PLoS ONE: Apoptose-Fremme Effekter af hematoporphyrin monomethylether-Sonodynamic Terapi (HMME-SDT) på Endometrie Cancer

Abstrakt

Målsætning

Formålet med denne undersøgelse var at undersøge apoptose -at fremme effekter og mekanismer hematoporphyrin monomethylether (HMME) -sonodynamic terapi (SDT) på endometriecancer celler

in vitro

.

Metoder

endometriecancer celleprøver blev opdelt i fire grupper: 1) ubehandlet kontrolgruppe, 2) HMME gruppe, 3) ren ultralyd gruppe, og 4) HMME kombineret med ultralyd, dvs. SDT gruppe. CCK-8 metode blev anvendt til at vurdere den inhiberende virkning af SDT på proliferationen af ​​endometriske cancerceller. Optisk mikroskop og feltemissions transmissionselektronmikroskopi blev anvendt til at karakterisere morfologi ændringer af kræftceller induceret af behandlingerne. Apoptose sats, reaktive ilt arter (ROS) og mitokondrie membran potentiale (MMP) blev undersøgt ved flowcytometer. Fluorescensintensitet målt ved laserscanning konfokal mikroskopi blev anvendt til at undersøge variationen af ​​intracellulær calciumion (Ca

2+) koncentration. Apoptose-relaterede proteiner involveret i både indre og ydre apoptose signallings blev analyseret ved western blot.

Resultater Salg

SDT effektivt kan inducere apoptose af endometriske cancerceller. Sammenlignet med ultralyd, som er kendt som en effektiv anti-tumor-metoden, SDT fører til en betydelig forbedring i forhold til undertrykkelse af cellelevedygtighed og induktion af apoptose, sammen med mere bemærkelsesværdige ændringer på morfologi og underkonstruktionen i både ultralyd følsomme og resistente endometriecancer-celler. Yderligere undersøgelser afslører, at SDT fremmer ROS produktion, inducerer tab af MMP og øger intracellulære Ca

2+ koncentration mere effektivt end HMME eller ultralyd alene. SDT grupper viser også en temmelig høj ekspression af apoptose-fremmende proteiner, herunder Bax, Fas og Fas-L, og en betydelig lav ekspression af apoptose-suspension proteiner, herunder Bcl-2 og Survivin. I mellemtiden, begge spaltet caspse-3 og caspase-8 er dramatisk forøget i SDT grupper. Flere veje er blevet foreslået i processen, herunder den iboende aktivering ved overdreven ROS og overbelastet Ca

2+, silencing survivin genet og ydre vej medieres af død receptoren.

Konklusion

i betragtning af dets betydelige effektivisering i både ultralyd sensitive og resistente celler, SDT kan derfor være en lovende terapeutisk metode til behandling af livmoderkræft

Henvisning:. Sun H, Ge W, Gao X, Wang S, Jiang S, hu Y, et al. (2015) Apoptose-Fremme Effekter af hematoporphyrin monomethylether-Sonodynamic Terapi (HMME-SDT) på endometriecancer. PLoS ONE 10 (9): e0137980. doi: 10,1371 /journal.pone.0137980

Redaktør: Eric Asselin, University of Quebec på Trois-Rivieres, CANADA

Modtaget: December 29, 2014 Accepteret: 29 Juli 2015; Udgivet: 14 September, 2015

Copyright: © 2015 Sun et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Grant nr 30.872.650); Program for New Century Fremragende Talenter i University of China (Grant nr NCET-09-0131); MY anerkender økonomisk støtte fra Rekruttering Program for Global unge eksperter, Kina

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Endometriecancer er en af ​​de fælles gynækologiske maligniteter, der traditionelt behandles med kirurgi og suppleret med kemoterapi og strålebehandling, som desværre har en ret lav følsomhed over for tidligt eller metastatisk stadie for endometriecancer, der normalt ledsager med betydelige bivirkninger [1-2]. Hidtil er det stadig et åbent spørgsmål, hvor tidligt endometriecancer kan behandles samtidig bevare fertilitet. Og der er ingen rapport i litteraturen om lagring organ for patienter med et mellemliggende eller avanceret stadie. Det er klart, en effektiv tilgang med lav toksicitet er altafgørende.

tilskyndelse af apoptose foretrækkes i kræftbehandling [3]. Det er blevet påvist, at ultralyd kan forårsage apoptose af en stor række af celler, såsom myeloide leukæmiceller, lymfocytter og sarcomaceller [4-6]. Men den forsinkede dræbende virkning [7] sammen med den ineffektive effekt på ultralyd-resistente tumorceller kan i vid udstrækning begrænse sin klinik applikationer. For nylig, som en kombination af ultralyd og sonosensitizers har sonodynamic terapi (SDT) blevet en fascinerende non-invasiv anti-tumor metode med høj effektivitet og høj selektivitet i tumorcellerne og ingen indlysende indflydelse på tilgrænsende normale væv [8-10]. Blandt forskellige kemiske midler anvendt i SDT, hæmatoporphyrin-monomethylether (HMME) er særlig populær som en sonosensitizer grund af dets optimale optiske egenskaber og tilfredsstillende præferentiel retention i væv [11]. Endnu vigtigere, HMME har en meget højere optagelseshastighed ved tumor end normale væv [10], og denne høje selektivitet sikrer ultralyd energi til at være fokuseret specifikt på kræftcellerne.

Anvendelsen af ​​SDT på gynækologiske maligniteter er hurtigt opstå. Selvom en tidligere undersøgelse

in vitro

gjorde viser, at methylenblåt-medieret SDT kan øge de reaktive ilt arter i æggestokkene kræftceller og dermed inducere apoptose [12], forbliver SDT virkninger på endometriecancer uudforsket indtil nu.

i denne undersøgelse har indflydelse HMME-SDT på begge ultralyd følsomme og resistente endometriecancer celler blevet undersøgt

in vitro

. Apoptose-fremmende effekter og mekanismer diskuteres i lyset af de foreliggende oplysninger.

Materialer og metoder

2.1. Cell Culture

Humane endometriske adenocarcinom cellelinjer Ishikawa og HEC-1-en blev købt fra Shanghai Bogoo bioteknologi. Co., Ltd. Cellerne blev dyrket i et RPMI1640 (Hyclone, Thermo) opløsning indeholdende 10% føtalt kalveserum (Hyclone, Thermo) og inkuberet i en mættet fugtighed inkubator (HF240, Heal Kraft) ved 37 ° C med 5% CO

2. Forsøgene blev udført når cellerne nåede den logaritmiske vækstfase.

2.2. Cell overlevelsesraten

Celler i den logaritmiske vækstfase blev anbragt i 0,25% trypsin i fordøjelse og centrifugering og fremstillet i en enkelt-cellesuspension med en koncentration på 1 × 10

5 /ml. Cellerne blev derefter udsået i 6-brønds plader. Der var fire prøve grupper som følger: 1) ubehandlet kontrolgruppe (kontrol), 2) HMME gruppe (HMME), 3) ren ultralyd gruppe (ultralyd), og 4) ultralyd kombineret HMME gruppe (SDT). For SDT gruppe, blev HMME tilføjet en time før ultralyd interferens, hvilket var 1,0 W /cm

2 ved 1 MHz i 60 s for Ishikawa og 2,0 W /cm

2 ved 1 MHz behandlet 240 s for ny fabrik 1-a. Og slutkoncentrationen af ​​HMME var 15 ug /ml for Ishikawa og 50 ug /ml for HEC-1-en. En våd svamp blev anbragt mellem bunden af ​​dyrkningspladen og ultralydsonden at forhindre multiple refleksioner af ultralyd. Efter bestråling blev cellerne fordøjet og opkræves øjeblikkeligt, derefter overført til 96-brønds plader efter justering af koncentrationen, med 100 pi i hver brønd. To timer senere blev 10 pi Cell Counting Kit-8-reagens (CCK-8, Dojindo) tilsat til hver brønd. Efter en times yderligere dyrkning blev absorbansen ved 490 nm målt under anvendelse af en automatisk enzym mærke instrument (Multiskan MK3, Thermo) [13].

2.3. Forberedelse til karakterisering af Cell Morfologi og Underkonstruktion

morfologi og vedhængende vækst af celler blev observeret 6h efter de fire forskellige behandlinger ved hjælp af et omvendt mikroskop (Olympus CKX4). Cellerne blev fordøjet i 0,25% trypsin i 90’erne, vasket ved phosphatpufret saltvand, derefter centrifugeret ved 2000 o /min i 5 min. Fjernelse af supernatanten blev cellerne fikseret mellem 2,5% glutaraldehyd og 1% osmic syre, dehydreret med ethanol og acetone, indlejret i Epon812 epoxyharpiks, og skåret af III ultratynd slicer. Prøverne blev derefter dobbelt-farvet med uranylacetat og blycitrat og derefter karakteriseret ved anvendelse af en feltemissions transmissionselektronmikroskopi (TEM, JEM-2010, JEOL).

2.4. Apoptose Analyse

6h efter behandlingerne, cellerne i de fire grupper ovennævnte blev opsamlet og talt, derefter bevaret undgå lys i 15 minutter efter tilsætning af 10 pi fluoresceinisothiocyanat (FITC) -mærket AnnexinV (20 ug /ml) til 1 × 10

6 celler. Derefter blev 5 pi propidiumiodid (PI) (50 ug /ml) tilsat. Efter reaktion i 5 min, 400 pi bindingspuffer blev blandet. Prøverne blev testet ved flowcytometer (BD FACSCanto) umiddelbart.

2.5. Reaktive oxygenarter (ROS) og mitochondriemembran Potential (MMP)

Efter ultrasonisk bestråling blev cellerne inkuberet i 2 timer. 2’7′-dichlorofluorescein diacetat (DCFH-DA, Beyotime) og Rhodamine123 (Sigma) med en slutkoncentration på 10 mmol /l og 200 nmol /l blev tilsat til hver prøve for ROS og MMP-test. I begge tilfælde blev cellerne dyrket ved 37 ° C med 5% CO

2 undgå lys i 30 min. Fluorescensintensitet blev derefter målt ved et flowcytometer ved en excitations- og emissionsbølgelængde på 480 nm og 520 nm for ROS test, og 490 nm og 530 nm for MMP-test, henholdsvis.

2.6. Bestemmelse af intracellulært calcium (Ca) ionkoncentration

Endometriecancer celler af kontrol og SDT gruppe blev vasket tre gange ved phosphatpufferopløsning, indlæst af Fluo-3 /AM (Bio-Rad) med en slutkoncentration på 10 mmol /l ved 37 ° C i 45 minutter, og derefter overført til en særlig lille rille. Fluorescensintensitet blev testet ved en laser scanning konfokal mikroskop (Meridian, Insight-PlusIQ) ved en argon laser excitation af 488 nm. Den frie Ca

2+ koncentration i cellerne blev kalibreret med ligningen: [

Ca

2 +] =

K

d

[ ,,,0],(

F

–

F

min) /(

F

max –

F

)], hvor

K

d

er 400 nmol,

F

er den målte relative fluorescens værdi,

F

max

er maksimal fluorescens værdi efter tilsætning af 10 pmol /L 4-Br-A23187 høj Ca flydende (10 mmol /LK

2CaEGTA, 10 mmol /L K-svabere og 100 mmol /L KCI, Bio-Rad Company),

F

min

er den mindste fluorescens værdi efter tilsætning af 10 mmol /l 4-Br-A23187 Ca-fri opløsning [14]. Dette er en relativ enkel og billig metode, der normalt anvendes til intracellulær Ca

2+ koncentration.

2.7. Ekspressionen af ​​Apoptotiske-relaterede proteiner

Apoptose-relaterede proteiner blev analyseret 24 timer efter hver behandling ved western blot. Kort fortalt blev cellerne høstet efter forskellige behandlinger. Proteiner blev separeret ved SDS-PAGE-gel og derefter overført til PVDF-membraner, som for det første blev blokeret med 5% skummetmælk og inkuberes derefter med specifikke antistoffer som indikeret i figurerne ved 4 ° C natten over. De peberrodsperoxidase-konjugerede sekundærviklinger blev tilsat efterfølgende. Ekspressionen af ​​proteiner blev visualiseret ved forøget kemiluminescens (ECL) systemet (Thermo Scientific Pierce).

2.8. Statistisk analyse

Alle forsøg blev gentaget tre gange uafhængigt i de forskellige celler. SPSS version 13.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, Illinois) blev anvendt til dataanalyse. Data er præsenteret som gennemsnit ± kvadratisk afvigelse (SD). Datoen blev analyseret under anvendelse uparrede t-test. P 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant

Resultater

3.1.. Effekt af SDT på overlevelsesraten for de endometriecancer Cells

For at vurdere effekten af ​​SDT på cellelevedygtighed, en CKK-8 assay blev anvendt til Ishikawa og HEC-1-a celler efter forskellige behandlinger som angivet i fig 1. overlevelsesraten formindskes med enkelt behandling med enten HMME eller ultralyd i både Ishikawa og HEC-1-a-celler (figur 1). Interessant er cellelevedygtighed af Ishikawa-celler faldet til 33.99 ± 4,06% med 1 MHz ultralyd (1,0 W /cm

2) i 60 s; mens der ikke ses nogen indlysende væksthæmning i HEC-1-a celler under de samme betingelser (se S1A Fig). Endvidere er det konstateret, at cellelevedygtigheden af ​​HEC-1-a-celler opretholdes ikke mindre end 81,39 ± 4,83% ved behandling selv med stærkere ultralyd (2,0 W /cm

2) i en længere varighed fra 60 s til 240 s (S1B Fig). Dette indikerer direkte følsomheden af ​​Ishikawa og modstand HEC-1-a ved ultralydsbehandling. Vigtigt er, som vist i figur 1, selv om ultralyd inhiberer cellelevedygtighed for endometriecancer-celler til forskellige udvide, synergien af ​​ultralyd med HMME kan konsekvent og væsentligt vække et stort set forbedret dræbe effektivitet, dvs. 165% og 115% som den for ultralyd alene i HEC-1-a og Ishikawa-celler, hhv.

CCK-8 assay blev anvendt til at evaluere celle levedygtighed i kontrol, HMME, ultralyd og SDT-grupper i Ishikawa (a) og HEC-1-a (b ) celler. HMME eller ultralyd viser en indlysende inhiberende virkning på celleoverlevelse. SDT inhiberer cellelevedygtighed mere effektivt end både enkelt behandling. Data er præsenteret som middelværdi ± SD (n = 3), ** P 0,01.

3.2. Effekt af SDT på morfologi og Underkonstruktion af endometriecancer Cells

Set billederne i figur 2, for kontrol- og HMME grupper, er de fleste celler dyrket adhærent og ensartet til en “bane-sten ‘struktur, viser klart kontur, god gennemsigtighed og vitalitet; mens celler i ultralyd og SDT gruppe er dårligt gennemsigtige, ikke solidt fastgjort eller endda suspenderet, og morfologien af ​​del-celler bliver cirkulær.

Morfologien og adhærerende vækst af Ishikawa (a) og HEC-1-a (b) celler blev observeret 6 timer efter de fire forskellige behandlinger ved anvendelse af et inverteret optisk mikroskop (Olympus CKX4). Kontrolgrupper viser adhærent dyrket celler med klar kontur og god gennemsigtighed; ultralyd og SDT gruppe viser dårligt transparente celler, som ikke fastsiddende eller endda suspenderet. Forstørrelsen af ​​alle billeder er 40 gange, skala bar = 100 um.

Flere detaljer kan udforskes fra TEM billeder i figur 3. Det er fundet, at cellerne i kontrol og HMME gruppe besidder intakt celle- og nukleare membraner, klare organel strukturer og komplette mitokondrie strukturer uden indlysende modifikation. Med hensyn til ultralyd gruppe, cellekernen kromatin er naturligvis oprullet eller størknet og marginaliserede; mitokondrierne bliver hævede, deforme og vacuolær, og lysosomet forøges, hvilket er alle indikationer i retning celle apoptose. For SDT gruppe, kan allerede ses typiske fænomener af apoptose fra cellerne, hvor kernerne er under indlysende pyknosis i en heterogen blokstruktur, som viser små apoptotiske organer, forstørrede perinukleære huller og nukleare porer, ekspanderet Golgi apparat og endoplasmatisk reticulum under degranulering, samt sløret eller forsvandt mitokondrie cristae. Nogle celler viser endda akkumuleret glykogen granula i deres cytoplasma med en nedsat celle volumen.

underbygningen af ​​de fire gruppe celler var præget af transmission (TEM, JEM-2010, JEOL). (A) kontrol og (b) HMME gruppe, viser intakt cellemembran og nuklear membran, klar organel struktur og komplet mitokondrie struktur uden indlysende modifikation; (C) ultralyd gruppe, viser tendens til celle apoptose, herunder oprullet eller størknet og marginaliserede cellekerne kromatin, deforme og vakuolære mitokondrier og øget lysosomer; (D) SDT gruppe, der viser typiske fænomener apoptose, hvor kernerne er under indlysende pyknosis i en heterogen blokstruktur, med små apoptotiske legemer, forstørret perinukleær gap og kerneporen, ekspanderet Golgi-apparatet og endoplasmatisk reticulum under degranulering, samt sløret eller forsvundet mitokondrie cristae. Skalaen bar i alle billeder er 2 um.

3.3. Effekt af SDT på ROS Generation og MMP Reduction

Som vist i figur 4, den apoptotiske sats på SDT, ultralyd, HMME og kontrolgruppen er 96,66 ± 0,45%, 91,21 ± 3,44%, 4,75 ± 1,10% og 0,42 ± 0,35% henholdsvis i Ishikawa-celler og 67,54 ± 12,65%, 18,88 ± 3,73%, 43,50 ± 5,02% og 3,09 ± 1,37% henholdsvis i HEC-1-a-celler. Den inducerede apoptose er omvendt korreleret med cellens levedygtighed bestemt ved CCK-8 assay i de fire forskellige grupper (S1 Fig og fig 4), hvilket antyder, at apoptose er en af ​​de store mekanismer, der tilskriver den lave cellelevedygtighed ved behandlinger. De apoptose satser i SDT-grupper er signifikant øget sammenlignet med enten HMME eller ultralyd behandling alene i både Ishikawa-celler (p 0,05, figur 4B) og HEC-1-a-celler (p 0,01, figur 4D). Ikke desto mindre, SDT fremmer hovedsageligt tidlig apoptose i Ishikawa-celler (Fig 4A), mens senere apoptose i HEC-1-en sag (Fig 4C).

De apoptose niveauer er meget højere i SDT grupper end kontrollen, HMME eller ultralyd grupper i Ishikawa (a og b) og HEC-1-a (c og d) celler. Repræsentative FACS-profiler er vist i a og c. Histogrammer nuværende gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg (b og d, * P 0,05; ** P. 0,01)

Intracellulær ROS er vigtige mediatorer af apoptose [15]. For at forstå, om SDT induceret apoptose skyldes ROS produktion, blev ROS-niveauer visualiseret ved DCF-A, en probe, der fluorescerer, når oxideret. Det er fundet, at blandt fire forskellige grupper, kan SDT mest markant øge ROS-niveauer i både Ishikawa og HEC-1-a-celler (p 0,01, figur 5). Sammenlignet med ultralyd, er den ROS generation på SDT grupper steg op til 1,48 gange i Ishikawa-celler (p 0,01) og 4,7 gange i HEC-1-a-celler (p 0,01), henholdsvis

ROS niveauer er væsentligt forbedret i SDT grupper sammenlignet med kontrolgruppen, HMME, og ultralyd grupper i Ishikawa (a og b), og HEC-1-en (c og d) celler. Repræsentative FACS-profiler er vist i a og c. Histogrammer nuværende gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg (b og d, ** P. 0,01)

Forbedret ROS kan fremkalde ændringer i MMP, hvilket yderligere fremmer apoptose progression [16]. Den mitochondriemembranpotential blev således målt fra celler behandlet med Rhodamin. Som vist i figur 6, er et mindre fald på MMP observeret i HMME og ultralyd grupper for både Ishikawa og HEC-1-a celler. Vigtigere, tab af MMP bliver meget mere tydelig i SDT-gruppen sammenlignet med mono-behandlingsgrupper i begge cellelinier, der er involveret. (P 0,01)

Ishikawa (a og b) og HEC-1-a (c og d) blev underkastet fire forskellige behandlinger: kontrol, HMME, ultralyd og SDT. Tab af MMP var mere tydelig i SDT gruppe end de andre grupper. Repræsentative FACS-profiler er vist i a og c. Histogrammer nuværende gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg (b og d, ** P 0,01.)

3.4. Virkning af SDT på Intracellulær Ca ionkoncentration

Som angivet i figur 7 og tabel 1, koncentrationen af ​​Ca-ion i Ishikawa endometriske celler til kontrol, HMME, ultralyd og SDT gruppe er af 92,533 nmol, 204,539 nmol, 2991,485 nmol og 3455.750 nmol hhv. Tilsyneladende, intracellulær Ca

2+ koncentration ved ultralyd behandling kan øges til 32,3 gange i forhold til den for kontrolgruppen, og SDT kan fremkalde en yderligere stigning af koncentrationen i omkring 37,3 gange.

Fluorescens intensiteten af ​​Ishikawa endometriecancer-celler 1 time efter behandlingerne blev testet af en laser scanning konfokal mikroskop (Meridian, Insight-PlusIQ) ved en argon laser excitation af 488 nm. (A) Kontrollen og (b) SDT-gruppe, som viser intracellulære koncentration af calcium-ion i SDT er meget højere end i kontrolgruppen.

3.5. Virkning af SDT på ekspressionen af ​​apoptotiske-relaterede proteiner

For at forstå de molekylære mekanismer i SDT-induceret apoptose, blev aktiveringen af ​​caspase-3 og caspase-8 først detekteret ved western blotting efter forskellige behandlinger. Som vist i fig 8, begge spaltet caspase-3 og caspase-8 er signifikant forøget i SDT-grupper, hvilket tyder på begge casapses også aktiveres under behandlingen. Desuden er det anti-apoptotiske protein survivin og Bcl-2 faldt, og pro-apoptotiske Bax forøges med SDT. Endvidere dødsreceptorgener pathway markører, såsom Fas og Fas-L, er også forstærket af SDT (Fig 8). Disse data sammen foreslået, at både interne og eksterne veje har været involveret i SDT-induceret apoptose

Ishikawa (a), og HEC-1-a (b) blev udsat for fire forskellige behandlinger:. Kontrol, HMME, ultralyd og SDT. Apoptose relaterede markører blev detekteret ved Western blotting med specifikke antistoffer som angivet. β-actin blev anvendt en belastning kontrol.

Discussion

Selvom ultralyd er blevet betragtet som en effektiv behandling for cancere, utilfredsstillende dræbe virkninger er blevet foreslået af HEC-1-A-celler i denne undersøgelse og også ved tidligere arbejde [7]. Vigtigere er det, SDT virker ikke kun effektivt på ultralyd følsomme Ishikawa-celler, og også ultralyd resistente HEC-1-A-celler, hvilket indikerer, at SDT kan have applikationer på bredere vifte af cancerceller. Den synergistiske pro-apoptose effekt af kombinationen af ​​HMME og ultralyd i livmoderkræft kan tilskrives to faktorer, dvs. den høje effektivitet af HMME som sonosensitizer og dræbende effekt af ultralyd.

SDT normalt har to drab tilstande på tumorceller, dvs. nekrose og apoptose [17]. Den dominerende apoptotiske-lignende ændring i cellemorfologi og underkonstruktion vist i omvendt mikroskop og TEM billeder påpeger, at apoptose er den største død måde for endometriecancer celler i den foreliggende sag. Baseret på vores eksperimentelle resultater, er mulige mekanismer SDT på apoptose af endometriecancer celler foreslås som følgende:

(1) Tab af MMP af ROS generering og Bcl-2 familie vekslen kan være en af ​​SDT-induceret apoptose veje.

Det er afsløret, at ROS i celler behandlet af SDT er mest overdreven blandt alle prøver. Under normale forhold, selve cellerne kan slette kontinuerligt små molekyler genereres under aerob respiration, herunder singlet oxygen [18,19]. Dog på en ubalanceret tilstand, intracellulær ROS kan akkumuleres, skader mitokondriemembran og reducere membranpotentialet [20-22]. Dette er i overensstemmelse med de eksperimentelle resultater, hvor den mest betydningsfulde ROS generation sats og MMP reduktion sats blev observeret samtidig i SDT grupper. Endvidere er mitochondriemembranpotential også udsat for Bcl-2-familiemedlemmer ‘regulering. I denne undersøgelse er Bcl-2 familiemedlem Bax øget og Bcl-2 er reduceret i SDT grupper. Den forøgede Bax kan således danne Bax /Bax homodimerer eller antagoniserer Bcl-2 anti-apoptose virkning gennem dannelse Bax /Bcl-2 heterodimerer på ydre membran af mitokondrier [23]. Sådanne ændringer kan derefter forøge membranpermeabilitet så apoptose-fremmende faktorer, såsom cytochrom c, vil frigive fra mitokondrier til cytosolen, hvor de udløser caspase kaskader og eventuelt føre til apoptose af endometriecancer-celler. , Konkluderer derfor vi at overdreven ROS og ændringer i Bcl-2 familiemedlemmer i SDT kan aktivere den iboende apoptose pathway ved at påvirke mitokondrier membran potentialer.

(2) Overbelastede Ca-ioner i celler kan være en anden stor iboende faktor for celleapoptosen i SDT.

overbelastning af Ca-ioner involverer forskellige apoptose processer, især opstrøms regulering dem. Ca-ioner normalt gemt i endoplasmatisk reticulum. Det endoplasmatiske reticulum stress på grund af overdreven ROS [14] kan øge Ca

2+ lagerkapacitet på celler samt frigivelse hastighed Ca

2+ i cellerne. Som det fremgår af de foreliggende konfokalt mikroskop resultater, Ca

2+ overbelastning i celler er temmelig svær for SDT gruppe. Siden udgivelsen af ​​cytochrom c har en positiv feedback på Ca

2+ koncentration [24-26], Ca

2+ overbelastning i SDT kan være en anden stimulans for den store frigivelse af cytochrom c, som så aktiverer Caspase-3 og inducere celle apoptose som nævnt ovenfor.

(3) SDT kan effektivt tavshed overlevende gen.

for nylig er det blevet påvist, at survivin udtryk sats i endometrie karcinom væv er (100%) højere end i længere endometriehyperplasi (73%) [27], hvilket betyder, at survivin kan være tæt forbundet til malign transformation af endometriet. Endnu vigtigere er tidligere arbejde påpeget, at overlevelsen protein survivin kraftigt kan inhibere apoptose stimuleres af forskellige faktorer [28]. Silencing survivin kan derfor bryde beskyttelse og fremme apoptose af cancerceller. I dette arbejde har SDT blevet påvist at være en effektiv måde til at undertrykke dette gen, hvilket fører til en overordentlig svækket ekspression af survivin og mere effektiv aktivering af caspase-8 og caspase-3 i forhold til de tre andre grupper.

(4) ydre vej kan hjælpe de iboende faktorer for apoptose i SDT.

tilstedeværelsen af ​​Fas /Fas-L er et tegn på død receptor-medieret extrinsic apoptose pathway hvor caspase-8 handlinger som en vigtig indvielse caspase og caspase-3 er den udøvende caspase. Vores resultater viser, at døden receptorproteiner Fas /Fas-L-signifikant forøget i SDT grupper og både caspase-8 og caspase-3 aktiveres med den samme behandling, som direkte angiver aktivering af ydre apoptotiske veje som reaktion på SDT.

sammenfattende kan SDT signifikant at hæmme proliferation af endometriske cancerceller, meget mere effektive end HMME eller ultralyd alene i både ultralyd sensitive og resistente celler. Den apoptose induceret af HMME-SDT involverer flere veje, herunder iboende apoptosecyklus aktiveret af ROS generation, MMP reduktion og Ca

2+ overbelastning, effektiv stilhed survivin gen, sammen med Fas /Fas-l-medieret extrinsic apoptose pathway. I betragtning af den bemærkelsesværdige effektivitet i både ultralyd sensitive og resistente celler, kan HMME-SDT derfor har åbnet en ny rehabilitering vej for patienter, der ikke kan overleve fra kirurgi, strålebehandling eller kemoterapi, og som kræver bevare organer og endda reproduktive funktioner.

Støtte Information

S1 fig. Ultralyd følsomhed for endometriecancer-celler analyseret ved CKK-8-assays.

(A) Ishikawa og HEC-1-A-celler blev behandlet med ultralyd (1 MHz) ved intensiteten af ​​1,0 W /cm

2 for 60 s og derefter udsat for en CKK-8 assay. Ishikawa er mere følsomme over for ultralyd behandling end HEC-1-a. Data er præsenteret som middelværdi ± SD (n = 3), ** P 0,01. (B) Ultrasound resistent HEC-1-A-celler blev behandlet med ultralyd ved en øget intensitet på 2,0 W /cm

2 for 0 s, 60 s, 120 s, og 240 s hhv. En lille og tidsafhængig cellelevedygtigheden inhibering observeres med behandlingerne. Data er præsenteret som middelværdi ± SD (n = 3)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0137980.s001

(TIF)