Abstrakt
Den langsomme-frigivende hydrogensulfid (H
2S) donor, GYY4137 forårsaget koncentrationsafhængig drab på syv forskellige humane cancercellelinier (HeLa, HCT-116, Hep G2, HL-60, MCF-7, MV4-11 og U2OS), men påvirkede ikke overlevelse af normale humane lungefibroblaster (IMR90, WI-38) som bestemt ved trypan blå-udelukkelse. Natriumhydrogensulfid (NaHS) var mindre potent og ikke aktiv i alle cellelinjer. En strukturel analog af GYY4137 (ZYJ1122) mangler svovl og derfra ikke er i stand til at frigive H
2S var inaktiv. Lignende resultater blev opnået under anvendelse af et klonogent assay. Inkubation af GYY4137 (400 uM) i dyrkningsmedium førte til genereringen af lav ( 20 uM) koncentrationer af H
2S fastholdes over 7 dage. I modsætning hertil inkubation af NaHS (400 uM) på samme måde førte til meget højere (op til 400 uM) koncentrationer af H
2S, som varede i kun 1 time. Mekanistiske undersøgelser afslørede, at GYY4137 (400 uM) inkuberes i 5 dage med MCF-7, men ikke IMR90 celler forårsagede dannelsen af spaltet PARP og spaltes caspase 9, indikerer en pro-apoptotisk virkning. GYY4137 (men ikke ZYJ1122) også forårsaget delvis G
2 /M anholdelsen af disse celler. Mus xenografundersøgelser vha HL-60 og MV4-11 celler viste, at GYY4137 (100-300 mg /kg /dag i 14 dage) signifikant tumorvækst. Vi konkluderer, at GYY4137 udviser anti-cancer aktivitet ved at slippe H
2S over en periode på dage. Vi foreslår også, at en kombination af apoptose og cellecyklusstop bidrager til denne virkning, og at H
2S donorer bør undersøges yderligere som potentielle anticancer-midler
Henvisning:. Lee ZW, Zhou J, Chen CS, Zhao Y, Tan CH, Li L et al. (2011) Den Slow-Releasing hydrogensulfid Donor, GYY4137 udstiller nye antikræftmidler Effects
In vitro
In Vivo
. PLoS ONE 6 (6): e21077. doi: 10,1371 /journal.pone.0021077
Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, USA
Modtaget: Marts 27, 2011; Accepteret: 17. maj 2011; Udgivet: 20 Jun 2011
Copyright: © 2011 Lee et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Arbejdet understøttes af en National University of Singapore forskningsbevilling til PKM, LWD og CHT (R-183-000-240-720, R183-000-240-101, R183-000-268-733). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Svovlbrinte (H
2S) syntetiseres naturligt fra cystein ved adskillige enzymer, herunder cystathionin γ-lyase (CSE), cystathionin β-synthetase (CBS) og 3-mercaptosulfurtransferase (3-MST) i en lang række pattedyr og ikke-pattedyrceller både
in vitro
in vivo
. I det sidste årti er der blevet foreslået talrige fysiologiske og patofysiologiske roller for denne gas sammen med en overflod af cellulære og molekylære mål, herunder en række ionkanaler, enzymer og transskriptionsfaktorer [1].
Foruden sit potentiale roller i normal fysiologi er der også en omfattende litteratur, der beskriver toksiciteten af H
2S og dens rolle som en miljømæssig forurenende [2]. En række studier har undersøgt den rolle, H
2S i udløsning celledød og beviser er blevet fremlagt, at denne gas kan udøve både pro- og anti-apoptotisk aktivitet i dyrkede celler [3], [4]. Men den præcise mekanisme (r) involveret fortsat uklare.
Måske overraskende, at der har været få undersøgelser af effekten af H
2S på kræftceller
in vitro
ingen rapporter om dens virkning på tumorprogression
in vivo
. For flere år siden vi rapporterede, at H
2S beskyttet colon cancerceller (HCT-116) fra apoptose grund til p-phenylethyl isothiocyanat [5]. Andre har efterfølgende oplyst, at H
2S øger human coloncancer celledeling og reducerer apoptose i flere cellelinjer (f.eks HCT-116, [6]), mens faldende overlevelse i andre menneskelige kolon cellelinjer (f.eks WiDr, [7]) . Disse forskellige observationer er vanskeligt at forene. Imidlertid kan en af forklaringerne ligge i valget af H
2S donor. Sulfid salte, såsom natriumhydrogensulfid (NaHS) og natriumsulfid (Na
2S) er ofte blevet brugt til at studere de biologiske virkninger af denne gas i mange celler, væv og dyr. Ved tilsætning af vand, disse salte generere en stor mængde H
2S over en kort tidsperiode. Da cellekultur finder sted over en periode på timer eller dage, er det sandsynligt, at ringe, om nogen, H
2S er til stede i medium inden for en kort tid for at tilsætte enten NaHS eller Na
2S. , Mens der ikke direkte målinger er foretaget op til dette punkt, synes det således sandsynligt, at koncentrationen af H
2S at kræft (eller endog andre) ikke-kræftceller udsættes for i løbet af kultur med NaHS vil være høj i starten og ikke opretholdt i hele eksperimentet. Således kan det være vanskeligt at drage sikre konklusioner om evnen af H
2S at påvirke kræftcellen overlevelse ved hjælp sulfid salte som donor agenter.
Med dette i tankerne, vi tidligere rapporteret, at GYY4137 frigiver H
2S langsomt begge i vandige medier og når de indgives til intakte dyr over en periode på timer til dage [8], [9]. Vi har nu sammenlignet effekten af GYY4137 og NaHS på overlevelse af en række kræft og ikke-kræftceller i kultur og korreleret deres virkning med ændringer i koncentrationen af H
2S i mediet. Derudover har vi undersøgt effekten af GYY4137 på tumorvækst ved hjælp af en xenograftmodel i immunsvækkede mus.
Materialer og metoder
Protokoller blev gennemført med godkendelse af National University of Singapore (NUS) Institutional Review Board (IRB, reference kode: 09-120E) og NUS Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC, protokol nummer: 804/05).
Kemisk syntese af GYY4137 og ZYJ1122
GYY4137 blev syntetiseret kemisk i hus som beskrevet tidligere [8]. ZYJ1122 (morpholin-4-ium diphenylphosphinate) blev syntetiseret som følger. Til en opløsning af diphenylphosphinsyrechlorid syre i dichlormethan (1,0 mmol, 1,0 ækv.) (DCM; 2 ml) ved stuetemperatur, morpholin (. 2,0 mmol, 2,0 ækv) blev tilsat dråbevis. Reaktionen blev omrørt ved den samme temperatur i 1 time, og produktet efterfølgende opsamlet ved sugefiltrering. Det rene produkt blev opnået efter vask med kold DCM. Hvidt fast stof blev opnået som 56% udbytte.
1H NMR (500 MHz, CDC
3, ppm): δ = 7,77-7,74 (m, 4H), 7,38-7,32 (m, 6H), 3,77-3,75 (m, 4H), 2,95-2,93 (m, 4H); LRMS (ESI) m /z 217,2 (M
-). Renheden og strukturer af forbindelserne blev verificeret ved hjælp af H NMR spektrometri (
1H NMR) og massespektrometri (Tal S1, S2, S3, S4).
Måling af H
2S
generation af H
2S fra enten NaHS (Sigma), GYY4137 eller ZYJ1122 (alle 400 uM) blev bestemt i portioner (100 pi) trukket tilbage med bestemte tidsintervaller (op til 7 dage) fra dyrkede MCF- 7 celler opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; Sigma) som beskrevet nedenfor. Koncentrationen af H
2S (bestemt som en kombination af fri H
2S, HS
– og S
2-) blev målt spektrofotometrisk som tidligere [10] beskrevne. Kort fortalt, medium (100 pi) blev blandet med 0,85% w /v acetat /3% NaOH-blanding zink (1: 1 ratio, 100 pi). Methylenblåt blev derefter dannet ved tilsætning af N, N-dimethyl-p-phenylendiamin-dihydrochlorid farvestof og FeCl
3 (slutkoncentrationer, 2,5 mM og 3,3 mM henholdsvis) og absorbans efterfølgende overvåget ved 670 nm. Koncentrationen af H
2S (defineret som ovenfor) blev bestemt ved anvendelse af en standardkurve for NaHS. (0-400 uM; R
2 = 0,9987)
Cellekultur og cellelevedygtighed
Alle cellelinierne undtagen HCT-116 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). Human cervical carcinoma (HeLa), colorektal carcinom (HCT-116), hepatocellulært carcinom (Hep G2), osteosarkom (U2OS), brystadenocarcinom (MCF-7) og humane diploide lungefibroblaster (IMR90 og WI-38) blev dyrket i DMEM suppleret med 10% vol /vol føtalt bovint serum (FBS; HyClone), penicillin /streptomycin (100 U /ml; Sigma) og L-glutamin (2 mM; Sænkekasse) ved 37 ° C i en atmosfære af 5% CO
2. Humane akutte promyelocytiske leukæmiceller (HL-60) blev dyrket i DMEM indeholdende 20% v /v FBS, mens human myelomonocytleukæmi (MV4-11) celler blev dyrket i RPMI med 10% volumen /volumen FBS under de samme inkuberingsbetingelser. Levende cellepopulationer inkuberet med NaHS, GYY4137 eller ZYJ1122 (400 eller 800 uM) blev opsamlet efter 5 dage og talt i tre eksemplarer efter farvning med trypanblåt anvendelse af et hæmocytometer. Koncentration respons for GYY4137 (100-1000 uM) blev dannet i MCF-7, HL-60 og MV4-11 udsat for lægemidler i 5 dage og evnen til at reducere overlevelse vurderet som IC
50 værdier. Kolonidannelse ved anvendelse MCF-7-celler blev også vurderet ved en klonogen overlevelse assay som beskrevet andetsteds [11]. Kort fortalt blev MCF-7-celler (10.000) podet tredobbelt i 6-brønds plader i nærværelse af GYY4137, NaHS eller ZYJ1122 (200 til 600 uM) i 10 dage, indtil kolonier var let synlig. Kolonier blev derefter farvet med krystalviolet (5% w /v), og de repræsentative billeder blev taget med et ChemiGenius 2 Bio Imaging System (SynGene Ltd).
In vivo
effekt af GYY4137
Den eksperimentelle protokol dyr er blevet beskrevet tidligere [12]. Kort fortalt blev kvindelig, svær kombineret immundefekt (SCID) mus (17-20 g, 4-6 uger gamle) opdrættet i hus og opretholdes i hele i specifikke patogenfrie (SPF) isolatorer. Eksponentielt voksende HL-60 og MV4-11 celler (1 x 10
7) ( 95% levedygtighed) blev vasket to gange i phosphatbufret saltvand og subkutant injiceret i det løse skind mellem skulderbladene og venstre forben af modtagende mus. Dyr blev behandlet med enten GYY4137 (100, 200 og 300 mg /kg /dag, ip) eller saltopløsning (1 ml /kg /dag, ip) i 14 dage begyndende 14 dage efter injektion af celler, på hvilket tidspunkt mus havde palpable tumorer af 100 mm
3 gennemsnitlige størrelse Alle dyr blev nøje overvåget. Vægt og tumorstørrelsen blev målt ved daglige intervaller. For tumorstørrelse måling, længde (L) og bredde (W) af tumoren blev målt med en passer, og tumorvolumen (TV) blev beregnet som TV = (L × B
2) /2.
cellecyklusanalyse og Western Blotting Salg
MCF-7-celler (40.000) blev inkuberet i plader med 6 brønde i nærvær eller fravær af GYY4137 (400 uM) til enten 5 eller 8 dage. Celler behandlet med ZYJ1122 blev anvendt som kontrol. Til analyse cellecyklus profil blev celler fikseret med 70% v /v ethanol på is i mindst 2 timer og derefter farvet i propidiumiodid-opløsning (20 ug /ml propidiumiodid, 100 ug /ml RNase A og 0,1% v /v Triton X-100) i 15 minutter ved 37 ° C. Farvede celler blev derefter underkastet DNA indholdsanalyse ved flowcytometri (Dako CYAN ADP) og de opnåede data blev behandlet ved hjælp af Summit software (Beckman Coulter). Cellelysater af MCF-7 blev underkastet SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner. Membranerne blev blokeret i Tris-bufret saltvand (TBS) indeholdende fedtfri tørmælk (5% vægt /volumen) og derefter inkuberet med det relevante primære antistof (1 pg /ml) ved 4 ° C natten over. Anvendte antistoffer var α-PARP, α-spaltet-PARP, α-spaltet-caspase 9 (Cell Signaling Ltd.) og α-tubulin (Sigma).
Statistisk analyse
Celleoverlevelse, IC
50 og tumorvolumener blev udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse (SEM). For
in vitro
undersøgelser, celleoverlevelsesforløb af både ikke-behandling (NT) og behandlingsgrupper blev analyseret ved hjælp af en-vejs ANOVA efterfulgt af en post-hoc t-test. For
in vivo
undersøgelser blev de sammenligninger mellem vehikelkontrolgruppe og forskellige dosering behandlinger analyseret ved lineær mixed model for langsgående dataanalyse af SPSS software (IBM).
P
. 0,05 blev betragtet som signifikant
Resultater
Frigivelse af H
2S fra NaHS og GYY4137 i dyrkningsmedium
Inkubation af enten NaHS eller GYY4137 i dyrkningsmedium resulterede i frigivelsen af påviselige mængder af H
2S som afspejlet ved en stigning i koncentrationen af H
2S (uM) efter fjernelse af portioner og assay for methylenblåt formation. Frigivelse af H
2S fra NaHS var hurtig – toppede på eller før 20 min og faldende til ikke målbart med 90 min. I stærk kontrast, H
2S udgivelse fra GYY4137 var meget lavere ( 10% af den observeret med NaHS), men blev opretholdt, forbliver højere end baseline i op til 7 dage. Ingen frigivelse af H
2S fremgik af ZYJ1122, en kontrol for GYY4137 mangler svovl og dermed ude af stand til at danne H
2S, under de samme forsøgsbetingelser i op til 7 dage (figur 1A). De kemiske strukturer af GYY4137 og ZYJ1122 er vist i det indsatte til figur 1A.
(A) H
2S-frigivende profil NaHS, GYY4137 og ZYJ1122. H
2S frigives fra NaHS, og GYY4137 (400 uM) blev bestemt i portioner (100 pi) medium er trukket tilbage med bestemte tidsintervaller (op til 7 dage) fra dyrkede MCF-7-celler. Koncentration af H
2S beløb blev vurderet spektrofotometrisk under anvendelse af N, N-dimethyl-p-phenylendiamin-dihydrochlorid og resultaterne viste H
2S koncentration (pM). H
2S udgivelse fra GYY4137 var signifikant forskellige (
P
0,05) fra T = 0 på alle tidspunkter fra 0,3 timer til 7 dage. H
2S udgivelse fra NaHS var signifikant forskellige (
P
0,05) fra T = 0 på alle tidspunkter op til 1,5 timer. Ingen påviselig H
2S blev løsladt fra ZYJ1122 (400 uM) under identiske eksperimentelle conditons. Resultater viser middel ± S.E. betyde, n = 3. De kemiske strukturer af GYY4137 og ZYJ1122 er vist i det indsatte. (B) Vækst kurve analyser af MCF-7, HL-60 og MV4-11 celler behandlet med NaHS, GYY4137 og ZYJ1122 (400 uM) i løbet af 5 dage. Celleoverlevelse blev bestemt ved trypanblåt-farvning. Resultater viser cellevækst i procent i forhold til NT celletal på dag 5 og er middelværdier ± s.e. betyde, n = 3.
Effekt af NaHS og GYY4137 på cellevækst og levedygtighed
Effekten af NaHS, GYY4137 og ZYJ1122 på vækst af tre cancer cellelinjer dvs MCF-7 (brystadenocarcinom), MV4-11 (akut promyelocytisk leukæmi) og HL-60 (myelomonocytleukæmi), blev overvåget i 5 dage. Ved hvert angivne interval, blev antallet af levende celler fra hver behandlingsgruppe registreret i tre eksemplarer. GYY4137 (400 uM) signifikant reduceret celleproliferation af alle tre cancer linjer henviser både NaHS og ZYJ1122 var inaktive (figur 1B).
For at bestemme virkningen af to forskellige koncentrationer (400 pM og 800 pM) af GYY4137, NaHS og ZYJ1122 på et bredere panel af menneskelige kræftceller, celle overlevelse yderligere fire kræft cellelinjer af forskellig oprindelse dvs cervikal karcinom (HeLa), kolorektal carcinom (HCT-116), hepatocellulært carcinom (Hep G2) og osteosarkom (U2OS ) celler blev bestemt i sammenligning med to normale humane diploide fibroblaster (WI-38 og IMR90) (figur 2A). Over en 5-dages dyrkningsperiode, NaHS (400 uM) ikke at påvirke overlevelsen af nogen af de syv cancer linjer testet. I modsætning hertil effekten af GYY4137 på celle overlevelse var meget mere dybtgående med 30-70% (
P
0,01) død i alle cancer cellelinjer på samme koncentration. En højere koncentration af NaHS (800 uM) resulterede i en yderligere, omend små, reduktion i HCT-116, Hep G2 og MCF-7 celleoverlevelse (ca. 15-30%) selvom igen ingen signifikant forskel i celleoverlevelse var tydelig i HeLa , HL-60, U2OS og MV4-11 celler. I modsætning hertil GYY4137 ved samme koncentration, markant reduceret overlevelse med ca. 75-95% i alle cancercellelinier. Den absolutte grad af celledød forårsaget af GYY4137 varierede mellem cancercellelinier med størst effekt i HepG2, HL-60, MV4-11, MCF-7 og U2OS celler og mindst virkning i HCT-116 og HeLa-celler. Derfor udførtes efterfølgende eksperimenter anvender et eller flere af HL-60, MCF-7 og MV4-11 cancerceller. Vigtigt er det, hverken NaHS eller GYY4137 væsentligt ændret overlevelsen af humane ikke-cancer WI-38 og IMR90 fibroblaster. Svovlet-mangler kontrol sammensatte, ZYJ1122, var uden signifikant effekt på overlevelsen af enhver cellelinje, hvilket tyder på, at de observerede effekter af GYY4137 på kræftceller er sandsynligvis på grund af H
2S frigivelse. Koncentrationen responsforholdet for GYY4137 (100-1000 uM) for at reducere celleoverlevelse blev også undersøgt i MCF-7, HL-60 og MV4-11 celler. IC
50 værdier for denne forbindelse var 337,1 ± 15,4, 389,3 ± 16,8 og 341,8 ± 21,2 pM (alle n = 3) (figur 2B).
(A) Virkningen af behandlingen (5 dag) af en række kræft og ikke-cancerceller med NaHS, GYY4137 og ZYJ1122 (400 uM eller 800 uM) som bestemt ved trypanblåt farvning. Resultater viser procentdelen af cellelevedygtighed til ikke-behandling (NT) efter inkubering i fravær af lægemiddelbehandling og er middelværdier ± s.e. betyde, n = 3, (
#
P
0,05; *
P
0,01). (B) Koncentration-respons-kurver, som viser effekten af GYY4137 behandling i 5 dage på overlevelse af MCF-7, HL-60 og MV4-11 celler. Resultater viser middel ± S.E. betyde, n = 3. (C) Repræsentative fotografier, der viser klonogene overlevelse assays af MCF-7-celler efter eksponering (5 dage, 200-600 pM) til enten NaHS (øverste række), GYY4137 (midterste række) og ZYJ1122 (nederste række) . NT = ikke-behandling.
Effekten af NaHS, GYY4137 og ZYJ1122 (200-600 uM) på overlevelsen af MCF-7 celler blev også vurderet
in vitro
hjælp af en klonogene assay. Repræsentative fotografier er vist i figur 2C. Til disse eksperimenter blev MCF-7-celler udpladet i nærvær eller fravær af narkotika og dyrkes over en periode på 10 dage. GYY4137 forårsagede en koncentrationsafhængig tab af celle kolonidannelse som var tæt på maksimal ved en koncentration på 600 uM. Celletab var ikke synlige i både NaHS og ZYJ1122 behandlede prøver.
Effekten af GYY4137 (400 nm, 5 eller 8 dage) på MCF-7 celler blev også undersøgt ved hjælp af cellecyklus-analyse. Den sub-G1 befolkning MCF-7 celler udsat for GYY4137 var signifikant højere (
P
0,05) sammenlignet enten ikke-behandlede celler eller celler udsat for den samme koncentration af ZYJ1122 på dag 5 (figur 3A ). , Sub-G1 population af celler behandlet med GYY4137 udgjorde således 7,5% af den totale cellepopulation på dag 5 og 14,8% på dag 8 i behandling sammenlignet med ca. 1% af celler, som enten ikke modtog behandling eller blev udsat for ZYJ1122 ( Figur 3A). Derudover var der en signifikant ophobning af 4N-DNA cellepopulation i celler behandlet med GYY4137 (til 18,6% og 26,6% efter 5 og 8 dages inkubering henholdsvis) sammenlignet med enten ubehandlede (14,8%) eller ZYJ1122-behandlede (14 %) celler (figur 3A). I yderligere eksperimenter blev den mulighed, at GYY4127 udløser kræft celledød ved at fremme apoptose også undersøgt. Et stærkt signal for spaltet-PARP og aktiveret caspase 9 blev påvist i MCF-7-prøver behandlet med GYY4137 (400 pM, 5 dage) med en stærkt reduceret signal i celler behandlet med ZYJ1122 (figur 3B). Interessant nok blev ingen spaltning af PARP og ingen aktivering af caspase 9 observeret i IMR90 celler inkuberet med enten GYY4137 eller ZYJ1122.
(A) Cellecyklusanalyse af MCF-7-celler efter 5 dage (NT og ZYJ1122) og 5 og 8 dage (GYY4137) medicinsk behandling. Mellemværker viser procentvise fordeling af celler i hver celle cyklus fase. De viste resultater er indikative for 3 individuelle eksperimenter. NT: non-behandling. (B) Western blot-analyse af apoptose markører (α-spaltet-PARP, α-spaltet-caspase 9) af MCF-7 og IMR90 behandlede (5 dage) med GYY4137 eller ZYJ1122 (begge 400 uM). Den anti-spaltet caspase-9 antistof, der anvendes detekterer det store fragment af caspase-9 efter spaltning, men genkender ikke uspaltede procaspase-9. α-tubulin blev anvendt som en loading kontrol. De viste resultater er tegn på 3 individuelle eksperimenter.
Effekt af GYY4137 på tumorvækst
in vivo
Subkutan transplantation af enten HL-60 eller MV4-11 celler resulterede i tidsafhængig tumorvækst i SCID mus (figur 4A, B). Tumorvolumen ved slutningen af forsøget var 3024 ± 220 mm
3 og 1166 ± 199 mm
3 (n = 4-6) i dyr, der modtager daglig køretøj injektion og administreret HL-60 og MV4-11 celler henholdsvis . Administration af GYY4137 dagligt resulterede i en signifikant (
P
0,05) dosis relateret hæmning af tumorvækst i begge sæt af dyr. GYY4137 (ved den højeste dosis benyttes dvs. 300 mg /kg) administreret dagligt i 14 dage reducerede tumor volumen med 52,5 ± 9,2% (n = 6) og 55,3 ± 5,7% (n = 4) i HL-60 og MV4-11 injiceres dyr. Selvom det ikke er målt objektivt i disse forsøg, havde GYY4137 behandling ikke påvirke dyrenes vægt eller grov opførsel.
Ændringer i mængden af etablerede tumorer i, (A) HL-60 xenograft mus (B) MV4-11 xenograft mus behandlet dagligt med enten GYY4137 (100, 200 og 300 mg /kg, ip) eller vehikelkontrol. Behandling med GYY4137 reducerede signifikant tumorvolumen i begge dyremodeller, på en dosis-afhængig måde. Resultater viser ændringer i tumorvolumen i middelværdi ± S.E. betyder (n = 4-6, #
P
0,05; *
P
0,01).
Diskussion
Vi rapporten her, at (i) GYY4137 (men ikke NaHS) forårsager en koncentrationsafhængig reduktion i kræft celle overlevelse, (ii) hverken GYY4137 eller NaHS under anvendelse af identiske koncentrationer og eksperimentelle betingelser, påvirkede overlevelsen af normale dvs. ikke-kræftceller, (iii) GYY4137 fremmes cancercelle (MCF-7), men ikke normale celler (IMR90) apoptose som angivet ved måling af sub-G1 population og ved observation af spaltet PARP og spaltes caspase 9 og udløste cellecyklusstop af MCF-7-celler i G
2 /M fase, (iv) H
2S koncentration påvist i medium, der indeholder MCF-7 celler overskredet ‘basale’ niveauer for op til 7 dage efter udsættelse for GYY4137 men for mindre end 2 timer efter eksponering til NaHS, (v) ZYJ1122, en kontrol for GYY4137 mangler svovl og dermed ude af stand til at danne H
2S, var inaktive i alle tilfælde, og (vi) GYY4137 administreres dagligt til immundefekte mus i 14 dage forårsagede en dosisafhængig reduktion i tumorvækst fremkaldt ved forudgående injektion af en af to humane leukæmi-cellelinier.
den foreliggende data viser for første gang, en anti-cancer virkning af langsomt frigivende H
2S donor , GYY4137. Alle testede cancerceller var modtagelige for denne forbindelse om end omfanget. Det er nu veletableret, at NaHS frigiver store mængder af H
2S over en kort periode. I de foreliggende eksperimenter viser vi, at GYY4137, ligesom NaHS, også frigiver H
2S følgende inkubation i dyrkningsmedium indeholdende MCF-7-celler derved bekræfte vores tidligere observation af spontan H
2S generation i vandige medier [8]. Da ZYJ1122 udviste ingen anti-cancer aktivitet i nogen af de
in vitro
modeller, vi konkludere, at den anti-cancer aktivitet af både GYY4137 og NaHS (i høj koncentration) er meget sandsynligt, at være H
2S- afhængig. Måske overraskende, GYY4137 udstillet større cancercelledrab aktivitet end gjorde NaHS
in vitro
selvom det fører til markant lavere koncentrationer af H
2S i cellen medium. Således vil en optimal drab af kræftceller ved H
2S under disse eksperimentelle betingelser synes at forekomme ved lave koncentrationer af gassen spredes over en periode på flere dage i modsætning til en langt højere koncentration opnås over en kortere tidshorisont efter eksponering af celler til NaHS. Det skal bemærkes, at mens relativt høje koncentrationer af GYY4137 (dvs. 400-800 uM) er nødvendige for denne effekt, den effektive koncentration af H
2S genereret er langt mindre dvs. 20 uM baseret på målinger i dyrkningsmediet. Men vi kan ikke udelukke muligheden for, at GYY4137 kan samle inde kræftceller og derved frigive større mængder af H
2S intracellulært. Under denne forudsætning for øje, den foreliggende data antyder, at den hastighed, hvormed celler udsættes for H
2S samt koncentrationen af H
2S stødt, er afgørende for evnen af denne gas for at fremme celledrab.
det er interessant, hverken GYY4137 eller NaHS forårsagede betydelig drab på normale dvs. ikke-kræftceller tyder på, at effekten af de to H
2S donorer er specifik for cancerceller. Virkningsmekanismen af cancercelledrab virkning GYY4137 er også blevet undersøgt. Behandling af MCF-7-celler med GYY4137 resulterede i standsning af cellecyklus i G
2 /M-fase og fremme af apoptose som bevismateriale af øget sub-G1 population samt tilstedeværelsen af både spaltet PARP og spaltes caspase 9. Ingen signifikant effekt enten på cellecyklus eller på apoptose var tydelig i ZYJ1122-behandlede celler igen antyder, at begge disse virkninger var sekundære til den vedvarende udsættelse af celler for lave niveauer af H
2S. Evnen af H
2S at forårsage kræft celle drab på denne måde er ikke tidligere blevet rapporteret. Men H
2S er tidligere blevet vist, at påvirke både cellecyklus og apoptose. For eksempel H
2S fremmer cellecyklus indtastning og proliferation af intestinal IEC-18 celle
in vitro
ved at aktivere MAPK [13]. H
2S kan også udvise både pro- (for eksempel [14]) og anti- (fx [15]) apoptotisk aktivitet afhængigt af celletypen undersøgt og de eksperimentelle betingelser, især koncentrationen af H
2S anvendes. En række potentielle molekylære mål er blevet impliceret i virkningen af H
2S på apoptose, herunder p38 og caspase-3 [15], [16], andre MAPK såsom MEK og JNK [17] samt augmented produktion af varmechokprotein (HSP-90) [18]. Mens den præcise cellulære virkningsmekanisme GYY4137 fortsat uklart, forekommer det ikke urimeligt at H
2S, frigives langsomt over en periode på flere dage, kan påvirke redox mekanismer i cellen at tilvejebringe anti-cancer virkning. På denne baggrund kunne det være interessant at vurdere effekten af GYY4137 på reaktiv generation ilt arter og anti-oxidant enzym niveau i kræftceller.
Som konklusion, GYY4137 udviser anti-cancer-celle aktivitet både
In vitro
in vitro
. Vi foreslår, at GYY4137 nedbryder langsomt til opnåelse H
2S, som ved en kombination af cellecyklusstop og fremme apoptose, inhiberer tumorvækst. Ingen celledød var tydelig i ikke-kræftceller. Hvorvidt sådanne celler simpelthen nedbryde H
2S hurtigere eller om cancerceller er unikt følsomme over for dræbende effekt af denne gas kræver yderligere undersøgelser. Det fund, at kræftceller kan dræbes selektivt når de udsættes for relativt små mængder af H
2S over en forholdsvis lang tidsperiode er nøglen. Denne observation skal huske på nogen fremtidige arbejde at undersøge den del af H spillet
2S i kræftcellen overlevelse og også i udviklingen af romanen H
2S-baserede anti-tumor agenter.
Støtte oplysninger
figur S1.
1H NMR-spektrum af GYY 4137.
doi: 10,1371 /journal.pone.0021077.s001
(TIF)
Figur S2.
Massespektrometri spektrum af GYY 4137.
doi: 10,1371 /journal.pone.0021077.s002
(TIF)
Figur S3.
1H NMR-spektret af ZYJ1122.
doi: 10,1371 /journal.pone.0021077.s003
(TIF)
Figur S4.
Massespektrometri spektrum af ZYJ1122.
doi: 10,1371 /journal.pone.0021077.s004
(TIF)
Tak
Vi er meget taknemmelige for Dr. Thilo Hagen for hans værdifulde forslag vedrørende eksperimentelle designs, og Dr. Zhao Yudong for hans råd om
in vivo
dataanalyse. Vi takker Dr. Bert Vogelstein til tilvejebringelse HCT-116-cellelinjen.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.