PLoS ONE: Den perifere myeloid Expansion Drevet af Murine Cancer Progression vendes ved strålebehandling af Tumor

Abstrakt

Udvidelse af myeloid-slægt leukocytter i tumor-bærende mus er blevet foreslået som en årsag til systemisk immunosuppression . Vi viser, at strålebehandling af tumorer fører til et fald i myeloide celleantal i blodet og et fald i milt størrelse. Hyppigheden af ​​myeloide celler ikke falde til niveauet i tumor-fri mus: vi vise, at metastatisk sygdom kan forhindre myeloide celle numre fra at vende tilbage til baseline, og at tumor tilbagefald fra residual sygdom korrelerer med re-udvidelse af myeloid herkomst celler. resultater strålebehandling i forøget proliferation af T-celler i milten og mens T-celle responser på fremmede antigener ikke ændres af tumorbyrde eller myeloid celle ekspansion, er reaktioner på tumorassocierede antigener steg efter strålebehandling. Disse data viser, at myeloide celle tal er direkte forbundet med primær tumor byrde, at denne population kontrakter efter strålebehandling, og at strålebehandling kan åbne et terapeutisk vindue til immunterapi af residual sygdom

Henvisning:. Crittenden MR, Savage T, Cottam B, Bahjat KS, Redmond WL, Bambina S, et al. (2013) Den Peripheral myeloid Expansion Drevet af Murine Cancer Progression vendes ved strålebehandling af tumor. PLoS ONE 8 (7): e69527. doi: 10,1371 /journal.pone.0069527

Redaktør: Maria G. Castro, University of Michigan School of Medicine, USA

Modtaget: April 5, 2013; Accepteret: 11 Juni 2013; Udgivet: 25 Juli 2013

Copyright: © 2013 Crittenden et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af forskningsmidler fra en Susan G Komen for Cure Career Catalyst Award (KG110131) og en American Cancer Society Research Scholar Grant (RSG-12-168-01-LIB) til MJG, og en Wayne D. Kuni og Joan E . Kuni Foundation Kuni Scholar Award til MRC. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

myeloide celler har en vigtig rolle i udviklingen og progressionen af ​​cancer. Tumorassocierede makrofager er kritiske for angiogenese, invasion, metastase, immunosuppression samt behandlingsrespons [1], [2], [3]. For nylig undersøgelser har fokuseret på populationen af ​​myeloide celler, der ofte udvidet i det perifere blod af kræftpatienter [4], [5]. Visse musemodeller er forbundet med ekstreme myeloide udvidelser detekterbare i tumoren, milt og perifert blod, og disse myeloide celler er i stand til at undertrykke T-celleaktivering

in vitro

[6], [7], [8].

Transplanterbare tumormodeller med deres klonalt identiske cancerceller giver en nyttig model til at studere de vigtigste elementer i myeloid ekspansion. Hvis den myeloide ekspansion er knyttet til antallet af cancerceller, derefter behandling af den primære tumor bør forhindre myeloid ekspansion. Gemcitabin og 5-FU kemoterapi har vist sig at kontrollere myeloid ekspansion i milt fra tumorbærende mus [9], [10], [11]. Men hver af disse midler er blevet beskrevet, at have en direkte hæmmende virkning på myeloide populationer

in vitro

[10], [11]. Mens disse er ikke særlig myelotoksiske kemoterapi, kan de potentielle systemiske virkninger af kemoterapi på aktivt prolifererende myeloide forstadier forvirre bidrag reduceret tumor byrde. Kirurgisk fjernelse af den primære tumor forårsager også et fald i myeloide celler [9], [12]. Det er interessant, at denne virkning er ufuldstændig, da celler ikke vender tilbage til naive niveauer. Disse data antyder, at tumorer har en effekt på myeloide celler, der varer ved længere end excision. Men i denne model virkningen af ​​tumorexcision er forbigående, som myeloid ekspansion returnerer med gentagelse af den primære tumor og metastaser [12]. Derfor kunne disse data omfortolkes at antyde, at resterende cancerceller kan forhindre en fuldstændig normalisering af myeloide numre. I den kirurgiske model, kan traumer også fungere som forstyrrende element. Traume har vist sig at forårsage en mobilisering af myeloide celler med lignende fænotypiske, morfologiske og funktionsegenskaber til tumorinduceret myeloide celler [13]. Dette traume-inducerede myeloide ekspansion kan skjule omfanget af reduktionen i myeloide celler forårsaget af kirurgisk fjernelse af den primære tumor, og tilføje til enhver myeloid ekspansion påført residual sygdom.

Konsekvensen af ​​tumor strålebehandling til systemisk myeloide populationer er ikke blevet beskrevet. Strålebehandling kan leveres i en yderst site-specifik måde, hvilket resulterer i kontrol af målrettede tumorer og under normale omstændigheder er der ingen effekt på tumorer uden for målet feltet. Således strålebehandling tilvejebringer en teknik til at påvirke af den primære tumor på perifere myeloide celler uden de forstyrrende virkninger af kemoterapi og kirurgi. Vi viser, at strålebehandling af 4T1-tumorer forårsager et fald i myeloide celleantal i blodet og et fald i milt størrelse. Systemisk sygdom, som målt ved lungemetastaser, påvirkes ikke af strålebehandling af den primære tumor. Vi viser, at myeloid ekspansion nøje følger primær tumor vækst, men at der efter behandling, behøver myeloide tal ikke falde til niveauet i tumor-fri mus, hvilket tyder på, at der efter lokal behandling, residual lokale og metastatisk sygdom kombineres for at opretholde myeloide numre. Når primære tumorer gentog som følge af resterende lokal sygdom, myeloid ekspansion returneres. Vi viser, at mens myeloide tal reguleres af tumorvækst og påvirket af strålebehandling, gør T celleantal ikke. Imidlertid strålebehandling af den primære tumor forbedret myeloid: CD8-forhold og resulterer i forøget proliferation af endogene T-celler i milten. For at teste, om myeloid udvidelse og sammentrækning påvirket in vivo T-cellereaktioner, måltes antigenspecifikke respons på vaccine-associeret og tumor-associerede antigener. Vi viste, at der ikke var nogen ændring i den

in vivo

svar på

Listeria monocytogenes

vaccination i tumor-bærende og behandlede mus, men at kombinationen af ​​strålebehandling med vaccination medfører forøgede reaktioner på vaccine antigen delt med tumoren. Disse data understøtter den hypotese, at myeloid ekspansion er direkte knyttet til tumor byrde, at disse celler kontrakt efter strålebehandling, og at strålebehandling kan åbne et terapeutisk vindue til immunterapi af residual sygdom.

Materialer og metoder

Etik

Alle dyr protokoller blev godkendt af Earle A. Chiles Research Institute IACUC (Animal Welfare Assurance No. A3913-01).

Dyr og cellelinier

den 4T1 brystcarcinom cellelinie [14] (BALB /c) blev opnået fra ATCC (Manassas, VA). Den Panc02 murine pancreas adenocarcinom cellelinje [15] (C57BL /6) blev venligst stillet til rådighed af Dr. Woo (Mount Sinai School of Medicine, NY). 6-8 uger gamle C57BL /6-mus og BALB /c blev opnået fra Charles River Laboratories (Wilmington, MA) til anvendelse i disse eksperimenter.

Antistoffer og reagenser

Fluorescerende-konjugerede antistoffer CD11 -AF700, Gr1-PE-Cy7, IA (MHC klasse II) -e780, Ly6C-PerCP-Cy5.5, CD4-E450, foxp3-E450, CD25-APC, CD4-PerCP Cy5.5, CD8-FITC, IFNy APC, og CD40L-PE blev erhvervet fra eBioscience (San Diego, CA). Ki67-FITC, CD4-V500, TNFa-PE-Cy7 og Ly6G-FITC blev indkøbt fra BD Biosciences (San Jose, CA). CD8-PE-TxRD blev købt fra Invitrogen (Carlsbad, CA).

strålebehandling af tumorer

Tumorer blev inokuleret s.c. i højre ben under knæet i en dosis på 5 × 10

4 4T1 celler eller 2 × 10

5 Panc02 og tilladt at etablere i 14 dage før påbegyndelse af behandling. Dosering var baseret på de seneste kliniske undersøgelser [16], med tre daglige 20 Gy behandling fraktioner givet ved hjælp af en Elekta Synergy lineær accelerator (Atlanta, Georgien) med 6 MV fotoner inkorporerer en halv stråle blok for at minimere dosis til torso og 1 cm bolus. Salg

klonogen analyse af metastatiske cancerceller

i klonogenisk analyse af metastatiske cancerceller, blev lungerne dissekeret i ca. 2 mm fragmenter efterfulgt af omrøring i 1 mg /ml collagenase (Invitrogen), 100 ug /ml hyaluronidase (Sigma, St. Louis, MO), og 20 mg /ml DNase (Sigma) i PBS i 1 time ved stuetemperatur. Fordøjelsen blev filtreret gennem 100 um nylonnet for at fjerne makroskopiske debris. Seriefortyndinger af tumorceller blev podet til 6-brønds vævskulturplader i medier indeholdende 60 pM 6-thioguanin at selektere for kræftceller, stromale celler og kolonier blev talt efter 7 dage. Den serielle fortynding og kimtal blev brugt til at beregne antallet af klonogene kræftceller i den oprindelige orgel.

flowcytometri af myeloide celler i blodet og Spleen

Udvidelsen af ​​myeloide celler i det perifere blod blev målt ved anvendelse af en fuldblod bead assay. Helblod blev høstet i EDTA-rør fra live mus via vena saphena, og 25 pi af frisk blod blev farvet direkte med fluorescerende antistof cocktails. En kendt antal accucheck fluorescerende kugler (Invitrogen) blev tilsat til hver prøve, derefter røde blodlegemer blev lyseret med Cal-Lyse fuldblodslysering opløsning (Invitrogen), og analyseret på en BD LSRII flowcytometer. Vi bestemt det absolutte antal celler i prøven baseret på en sammenligning cellulære begivenheder til at perle hændelser (celler /ul). For flowcytometrianalyse af splenocytter blev homogeniseret milte vasket og farvet med antistoffer specifikke for overfladeantigener, derefter blev cellerne vasket og fikseret ved hjælp af en T regulatorisk cellefarvning kit (EBiosciences) og intracellulært farvet for foxp3 og Ki67. Andelen af ​​hver infiltrere celletype blev analyseret på en BD LSRII. Flow sortering af blodceller blev udført under anvendelse af en BD FACSAria Cell Sorter til mere end 98% renhed. Morfologien af ​​de sorterede cellepopulationer blev bestemt ved cytospin efterfulgt af DiffQuick farvning. Blodudstrygninger blev farvet ved hjælp Wright’s-Giemsa farve (Ricca Chemical Company, Arlington, TX). Billeder blev erhvervet ved hjælp af et Nikon Eclipse TE2000-S fluorescens mikroskop med NIS-Elements indsamling og analyse software, eller på et Leica SCN400 dias scanner.

Cytokine Bead Assay

Tumorer blev høstet på is og homogeniseret i 4,5 pi PBS indeholdende HALT proteaseinhibitor per mg væv. Celleresterne blev fjernet ved centrifugering ved 14000 g i 15 minutter ved 4 ° C, og supernatanterne blev opbevaret i portioner ved -80 ° C indtil anvendelse. Cytokinniveauer i supernatanterne blev påvist under anvendelse af et murint multiplex bead assay (Life Technologies, Grand Island, NY) og aflæst på en Luminex 100 matrix reader. Cytokin koncentrationer for gentagelser af hver tumor prøve blev beregnet efter en standardkurve.

bakteriestamme og Vaccination

ACTA-deleted (Δ

Acta

)

L. monocytogenes

udtrykker AH1-A5-peptid Lm-AH1-A5) er tidligere blevet beskrevet [17]. Bakterier blev dyrket til midlog i hjerne-hjerte-infusionsvæske, vasket og resuspenderet i DPBS til injektion. En dosis på 5 × 10

6 CFU blev leveret intravenøst ​​og bekræftet ved plettering af resterende inokulum. Kontrol mus eller mus med 4T1 tumorer efterladt ubehandlet eller behandlet som ovenfor med tre daglige 20 Gy behandling fraktioner blev vaccineret 1 døgn efter den endelige stråledosis med 5 × 10

6 CFU Lm-1 ekstra hydraulik-A5. Milte blev høstet 7 dage efter vaccination og cellesuspensioner blev stimuleret med 2 uM LLO

91-99 (GYKDGNEYI), AH1 (SPSYVYHQF) eller DMSO-vehikel i nærvær af Brefeldin A i 5 timer ved 37 ° C. Stimulerede celler blev vasket og farvet med CD4-PerCP Cy5.5 og CD8-FITC, fikseres derefter og permeabiliseret under anvendelse af en BD Cytofix /Cytoperm plus kit (BD Biosciences) og frosset ved -80 ° C. Til analyse celler blev optøet og intracellulært farvet med IFNy-APC, TNF-PE-Cy7 og CD40L-PE. Celler blev vasket og analyseret på en BD LSRII flowcytometer og dataene blev afhørt ved hjælp af BD FACSDiva (BD Biosciences) og Flojo (Tree stjerne, Ashland, OR).

Statistik

Data blev analyseret og plottes ved brug Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA). Blood myeloide numre over tid blev tilpasset til andet polynomium kurver anvendelse af Prism. Individuelle datasæt blev sammenlignet ved anvendelse t-test og analyse på tværs af flere grupper blev udført ved hjælp af ANOVA med enkelte grupper vurderes ved hjælp af Tukey sammenligning.

Resultater

Udvidelsen af ​​myeloide populationer er forbundet med kræft progression i dyremodeller og hos cancerpatienter. Hos mus, den myeloide ekspansion varierer mellem tumormodeller, for eksempel med særlig udtalt myeloide udvidelser beskrevet i 4T1 brystcarcinom model [18]. I disse modeller mus med avancerede tumorer udviser ekstremt store milt, der indeholder en særlig mærkbar ekspansion i CD11b

+ Gr1

+ population. For at spore myeloid ekspansion i mus via tumorvækst uden behov for at aflive dyret monitorerede vi myeloide populationer i det perifere blod. Standard fremstilling af mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) ved densitetsgradientcentrifugering kan føre til tab af granulocyt befolkninger, som udgør hovedparten af ​​de myeloide celler i perifert blod. Derfor har vi udviklet en fuldblod flowcytometri assay inkorporerer tæller-perler til at måle absolutte antal af cirkulerende myeloide celler. Gentagne målinger af flere mus vist, at denne myeloid population udvidet med 2-3 logger gennem tumorvækst, dramatisk øge den samlede cellularitet af perifert blod. I naive mus CD11b

+ myeloide celler bredt bestod af Gr1

+ og Gr1

– celler (figur 1A), hvor CD11

+ Gr1

+ -celler var ensartet MHC klasse II ( IA) negativ og CD11b

+ Gr1

– celler indarbejdet både MHC klasse II negative og positive celler (figur 1aii). I 4T1 tumor-bærende mus observerede vi lignende fænotyper, men en stor stigning i antallet af disse celler, navnlig en udvidelse CD11b

+ GR1

+ celler, i overensstemmelse med observationer af andre efterforskere blev observeret [4] , [19]. Strålebehandling af mus der bar etablerede 4T1 tumorer kontrollerer tumorvækst; Men på trods af høje strålingsdoser, tumorer gentages lokalt (figur 1b). Strålebehandling af den primære tumor resulterede i en signifikant forskel i perifere myeloide celler, sammenlignet med ubehandlede mus, inden en uge strålebehandling (p 0,01 dag 21 efter tumorbelastning) (figur 1b). På dette tidspunkt er antallet af cirkulerende myeloide celler i behandlede mus var væsentligt lavere end niveauet før behandlingen for lidt over en uge før ekspansion returneres (RT d14 vs. RT D21 (p 0,05), RT d14 vs. RT D23 ( p 0,05), RT d14 vs. RT D27 (p = 0,26)). Antallet af cirkulerende myeloide celler i behandlede mus forblev signifikant lavere end i ubehandlede mus indtil cirka to uger efter behandling (p 0,05 dag 27 efter tumorbelastning). På dette tidspunkt, gentagelse af den primære tumor var tydelig (fig 1bi) antyder en mulig forbindelse mellem primær tumorbelastning og myeloide numre. Disse data viser, at strålebehandling af den primære tumor transient vender tumorassocierede myeloid ekspansion.

a) i) Flowcytometri af frisk perifert helblod fra naive og 4T1-tumorbærende BALB /c-mus, der viser CD11

+ SSC

hi myeloide populationer. ii) Gr1 og IA (MHC klasse II) farvning på gated CD11b

+ SSC

hi myeloide populationer fra naive og 4T1 tumor-bærende mus. b) i) Mean og standard fejl af ben diameter BALB /c mus, der bærer 4T1 tumorer efterladt ubehandlet (NT) eller behandles begyndende på dag 14 med 3 daglige doser på 20 Gy omdrejningspunkt stråling (RT). Myeloide celler /pl perifert blod fra ii) mus efterlades ubehandlede og iii) mus behandlet begyndende på dag 14 med 3 daglige doser på 20 Gy fokal stråling. iv) monteret Kurverne fra grafer ii) og iii) afbildet uden målinger. c) i) klonogene assays af lungemetastaser stede ved eutanasi i BALB /c mus, der bærer 4T1 tumorer venstre ubehandlet (tomme cirkler – NT) eller behandles begyndende på dag 14 med 3 daglige doser på 20 Gy omdrejningspunkt stråling (fyldte cirkler – RT). ii) myeloide celler /pl perifert blod fra naive mus (naive) og mus dag 17 efter injektion af 4T1 i.v. (I.v.) eller s.c. (S.c.) iii) Samlet milt cellularitet i naive mus (NT) og mus dag 24 efter injektion af 4T1 i.v. (I.v.) eller s.c. (S.c.) d) i) myeloide celler /pl perifere blod hos C57BL /6 mus, der bærer Panc02 tumor høstet på forskellige tidspunkter. ii) dag 24 ben diameter og iii) myeloide celler /pl perifere blod hos C57BL /6 mus, der bærer Panc02 tumor venstre ubehandlet (NT) eller behandlet begyndende på dag 14 med 3 daglige doser på 20 Gy fokal stråling (RT). I hver graf, hvert symbol repræsenterer en mus. NS = ikke signifikant; * = P 0,05; ** = P 0,01; *** = P 0,005; **** = P 0,001. Dataene repræsenterer Mange gentagne eksperimenter.

4T1 modellen er spontant metastatisk, overvejende til lungerne. Metastaser podes senest 10 dage efter primær tumorimplantation – efter dette tidspunkt kirurgisk fjernelse af den primære tumor ikke kurerer mus, men i stedet i sidste ende resulterer i dødelighed på grund af progressiv vækst af metastatisk sygdom [20]. For at overvåge metastatisk progression i vores stråleterapi model, vi høstede lunger fra mus, der krævede eutanasi på grund af deres primære tumor over 12 mm, eller på grund af dårlig stand. I mus behandlet med strålebehandling 14 dage efter tumorprovokation, kontrol af den primære tumor resulterede i forsinket lunge høst sammenlignet med ubehandlede mus. på lunge høst, viste imidlertid klonogene analyse, at metastaserne fortsat fremskridt (Figur 1CI). Selv i mus, hvor strålingen behandlede tumor var stabil, eller forløber kun langsomt, inden 35-50 dage efter udfordring alle mus blev tilstrækkeligt syg til at kræve eutanasi, og dette sygelighed blev universelt forbundet med en omfattende belastning af lungesygdom. Disse data bekræfter omfattende historiske data, at omdrejningspunktet strålebehandling af den primære tumor er en meget lokal behandling resulterer i kræft kontrol udelukkende strålefeltet: i hundredtusindvis af patienter behandlet årligt med strålebehandling, abscopal effekter – behandling induceret kontrol tumorer uden for strålefeltet – er ekstremt sjældne, hvor strålingen er den eneste behandling modalitet [21]. Da myeloid ekspansion hos patienter har været forbundet med invasiv og metastatisk sygdom [5], er det muligt, at den resterende metastatisk sygdom forhindrer fuld normalisering af myeloide numre efter lokal terapi. For at undersøge bidraget af metastatisk sygdom på myeloid ekspansion blev mus injiceret med 4T1-tumorer intravenøst ​​til direkte dannelse metastaser i fravær af en primær tumor. Mus med kun metastatisk sygdom udviste perifer myeloid ekspansion (fig 1cii), men der var væsentligt færre myeloide celler til stede end i mus med synkrone subkutane primære tumorer. Dette forhold blev opretholdt i milten, hvor mus med kun metastaser udviser signifikant flere celler end ikke-tumorbærende mus, men dette var betydeligt færre end mus med sub-kutane primære tumorer (Figur 1ciii). Da vi ved, at omdrejningspunktet strålebehandling styrer den primære tumor lokalt, men kontrollerer ikke metastaser, mus, der modtager strålebehandling bevarer både deres resterende lokale sygdom

og

deres lunge tumor byrde. Derfor er disse data er i overensstemmelse med kombinationen af ​​resterende lokale og metastatisk sygdom forhindrer myeloide tal vender tilbage til baseline efter strålebehandling, og er i overensstemmelse med observationer efter kemoterapi [9] og kirurgisk excision [9], [12].

Denne virkning af strålebehandling var ikke begrænset til 4T1 model. Den Panc02 pancreasadenocarcinom tumormodel drev myeloid ekspansion med tumorprogression, om end i mindre grad end 4T1 (fig 1di). Strålebehandling af Panc02 tumorer forårsagede en forbigående kontrol af tumorvækst (figur 1dii), efterfulgt af en aggressiv udvækst [22]. Ligesom behandling af 4T1, strålebehandling til Panc02 tumorer resulterede i et signifikant fald i perifere myeloide celler (Fig. 1diii). Sammen viser disse data, at cytotoksisk behandling rettet mod den primære tumor forårsager en systemisk, skønt forbigående tilbageførsel af den myeloide ekspansion drevet af tumorvækst.

På nadir af blod myeloide celler efter strålebehandling, milt var synligt mindre (figur 2a). Vi tælles celler i milten som et mål for myeloid sammentrækning efter strålebehandling, og mens den samlede milt cellularitet faldt syv dage efter strålebehandling, forblev på et mellemliggende størrelse – betydeligt færre celler end mus uden behandling (p 0,01) og signifikant flere celler end mus uden tumorer (p 0,01) (Figur 2bi). At afgøre, om færre systemiske myeloide numre var forårsaget af strålebehandling uafhængigt af virkningerne på tumoren blev mus med 4T1-tumorer behandlet med stråling til den kontralaterale ikke tumorbærende ben. Mus får strålebehandling til tumoren viste signifikant færre totale celler i milten end ubehandlede mus eller dem behandlet på den kontralaterale ben (fig 2bi). CD11b

+ -celler var langt den største befolkning i den ekspanderede milten hos tumorbærende mus, og CD11b

+ -populationen i milten viste en lignende mellemresultat efter strålebehandling af den primære tumor, med mus behandlet med tumor strålebehandling udstiller betydeligt færre CD11b

+ celler end ubehandlede mus eller mus bestrålet på den ikke-tumor-bærende ben (Figur 2bii). Igen, trods reduktionen forårsaget af tumor stråling, behandlede mus bevarede en signifikant forhøjelse i myeloide celler i forhold til ikke-tumorbærende mus, og der var ingen signifikant forskel mellem ubehandlede mus og mus bestrålet til den ikke-behandlede ben (fig 2bii). Den tilsvarende myeloid respons på bestråling af tumoren set i det perifere blod og i milten resulterer i en tæt sammenhæng mellem disse foranstaltninger uanset tumor eller behandling status (Figur 2c). Da strålebehandling til tumoren og til den modsatte ekstremitet vil bestråle blod poolen gennem behandling, er ikke reducerer myeloide numre i milten at strålebehandling leveret til den modstående ekstremitet indikerer, at effekten på myeloide populationer ikke skyldes direkte effekter af stråling på myeloide celler eller eventuelle scatter-doser.

a) frisk udtaget milt fra D24 4T1 tumor-bærende BALB /c mus ubehandlet (NT) eller behandlet begyndende på dag 14 med 3 daglige doser på 20 Gy fokal stråling (RT). Kasser viste er 3 cm bred. b) i) Samlet milt cellularitet i naive mus (nr tumor) og mus dag 24 efter injektion af 4T1 efterladt ubehandlet (Tumor NT) eller behandlet begyndende på dag 14 med 3 daglige doser på 20 Gy fokal stråling til tumoren (Tumor RT) eller til den ikke er involveret modsatte ben (Tumor Leg RT). ii) Antallet af CD11

+ -celler pr milt i mus fra eksperimentet er vist i i). c) Antallet af CD11b

+ celler i milten plottet mod antallet af CD11b

+ celler /ul perifert blod ved høst for hver tumor og behandlingsgruppe.

For at afgøre, om nogen specifik myeloid befolkning var især påvirket af strålebehandling, vi udførte yderligere sub-fænotypebestemmelse af perifere blod myeloide celler. Den Gr1 antistof genkender både Ly6G og Ly6C, og antistoffer mod disse markører blev anvendt til at skelne subpopulationer inden CD11b

+ -celler [6]. I overensstemmelse med litteraturen inden for CD11b

+ Gr1

+ celler var to store befolkningsgrupper udmærker sig ved Ly6C og Ly6G: en klart adskilt population af Ly6G

-Ly6C

+ celler og en stor bestand af Ly6G

+ -celler, der udviste varierende ekspression af Ly6C (fig 3AI-iii). Efter strålebehandling, var der en tilsyneladende tab af CD11b

+ Gr1

+ Ly6G

+ celler, som udtrykker lavere niveauer af Ly6C (figur 3aiii). Brug af kontroller for at identificere Ly6G

+ Ly6C

– celler (Figur 3aiv) vi vist, at strålebehandling af tumor resulterede i et signifikant fald i CD11

+ Gr1

+ Ly6G

+ celler, var Ly6C

-. Dette forekom ikke, når den modsatte ekstremitet blev bestrålet (fig 3av). For at karakterisere disse populationer, vi sorteret disse sub-fænotyper fra det perifere blod fra mus med 4T1-tumorer (figur 3b). Efter aftale med tidligere karakteriseringer [6], Ly6G

-Ly6C

+ celler havde monocyt morfologi, Ly6G

+ Ly6C

+ havde morfologi neutrofiler og Ly6G

+ Ly6C

– celler havde morfologien af ​​modne neutrofiler. Tilsvarende blodudstrygninger fra tumorbærende mus viste en markant ekspansion i neutrofiler, som var stærkt formindsket efter strålebehandling af tumor (figur 3c). Disse data viser, at strålebehandling af tumor resulterer i en bestemt vending af tumor-drevet neutrofil ekspansion.

a) Flowcytometri af frisk perifert helblod fra i) naive mus eller mus med 4T1-tumorer ii) ubehandlet eller iii) bestrålet, viser Ly6C og Ly6G inden gated CD11b

+ Gr1

hi myeloide populationer. iv) histogrammer af Ly6C udtryk i indhegnede CD11b

+ Gr1

hiLy6G

+ celler, herunder negativ kontrol farvning (FMO) og viser procentdelen Ly6C

– i mus bestrålet i tumoren (Tumor RT) eller det modsatte ben (Tumor Leg RT). v) Procentdelen af ​​CD11b

+ GR1

hiLy6G

+ celler, som er Ly6C

– fra naive mus (nr tumor) og mus dag 24 efter injektion af 4T1 efterladt ubehandlet (Tumor NT) eller behandlet begyndende på dag 14 med 3 daglige doser af 20Gy omdrejningspunkt stråling til tumoren (tumor RT) eller til uengagerede modsatte ben (tumor Leg RT). Hvert symbol repræsenterer en mus. b) cytospiner af sorterede CD11b

+ Gr1

hi celler fra ubehandlede mus, der er i) Ly6C

+ Ly6G

-, ii) Ly6C

+ Ly6G

+, eller iii) Ly6C

-Ly6G

+. Hver cytospin vises ved siden den slags renhed plot med øget forstørrelse på inset kassen. c) Wright-Giemsa farve af D24 blodudstrygninger fra i) naive mus (Ingen tumor) og mus dag 24 efter injektion af 4T1 ii) ubehandlet (Tumor NT) eller iii) behandlet begyndende på dag 14 med 3 daglige doser på 20 Gy fokal stråling til tumoren (tumor RT). Det indsatte boks roteres og vist ved forøget forstørrelse. NS = ikke signifikant; * = P 0,05; ** = P 0,01; *** = P 0,005; **** = P 0,001. Dataene repræsenterer flere replikerede eksperimenter; hver subfigure indeholder data fra en anden replikere eksperiment.

Tumor-drevne myeloide udvidelser er knyttet til det lokale inflammatoriske miljø og manipuleret udtryk for GM-CSF [23] eller IL-1β [24] af kræft celler er blevet vist at drive myeloid ekspansion. For at bestemme om strålebehandling påvirket myeloide numre ved modulering disse cytokiner, analyserede vi deres niveauer i tumoren. Niveauerne af GM-CSF, IL-1α og IL-1β blev ikke ændret i tumoren efter strålebehandling (figur 4a). Disse data indikerer, at balancen i disse inflammatoriske cytokiner og vækstfaktorer i tumoren ikke er leder ændringen i myeloide numre. Selvom vi ikke kan udelukke regulering af andre vækstfaktorer, er det måske mere relevant at følge strålebehandling de primære tumorer er betydeligt mindre efter diameter (figur 4bi) og vægt (figur 4bii). Hvis vi beregne antallet af celler i milten per mg primær tumor, er der ingen forskel mellem ubehandlede og bestrålede mus (figur 4biii). Selv uden vækstfaktor regulering på tumorstedet, vil en mindre tumorbyrde betyder færre tumorafledte vækstfaktorer at påvirke myeloide numre. Derfor er disse data, at myeloid sammentrækning efter cytotoksisk og cytoreduktiv terapi bestemmes primært af udsving i antallet af cancerceller.

a) Bead assay for i) GM-CSF, ii) IL-1α og iii) IL-1β i homogenater af 4T1-tumorer på dag 24 efter injektion af 4T1 efterladt ubehandlet (NT) eller behandlet begyndende på dag 14 med 3 daglige doser på 20 Gy fokal stråling til tumoren (RT) eller til ikke-involveret modsatte ben (RT Opp ). b) D24 efter tumor udfordring grafer viser i) ben diameter ii) tumor vægt og iii) splenocytter pr milt /tumor vægt for mus ubehandlet (NT) eller behandlet begyndende på dag 14 med 3 daglige doser på 20 Gy omdrejningspunkt stråling (RT) . I hver graf, hvert symbol repræsenterer en mus. NS = ikke signifikant; * = P 0,05; ** = P 0,01; *** = P 0,005; **** = P 0,001. Dataene er repræsentativt for tre replikater eksperimenter.

subpopulationer af myeloide celler fra tumor-bærende mus kan udøve undertrykkende virkninger på T-celle funktion

in vitro

. Derfor undersøgte vi T-celler i milten efter strålebehandling. På grund af myeloid ekspansion i milten, T-celler udgør en mindre procentdel af splenocytter; dog total CD8 T-celle nummer var ikke forskellig i tumorbærende mus eller efter strålebehandling af tumoren (figur 5a). At CD8 T-celler forbliver konstant, mens myeloide celler øger resulterer i en dramatisk skæv myeloid: T-celle-forhold – i milten ratio stiger fra et gennemsnit på ca. 1,7 CD11b

+ pr CD8

+ til 29 CD11b

+ pr CD8

+ (p 0,001). Resultatet af strålingsinduceret fald i myeloide celler er en forbedring i myeloid: CD8-forhold i milten – til 20 CD11b

+ pr CD8

+ (p 0,01) – hvilket antyder en noget forbedret potentiale til at indlede

de novo

immunreaktioner. I overensstemmelse med dataene i CD8 T-celler, var der ingen ændring i antallet af ikke-regulerende CD4 T-celler i tumorbærende mus og behandlede mus sammenlignet med kontroller (figur 5b). Imidlertid er tumorbyrde og strålebehandling ledsaget af en stigning i antallet af T regulerende celler (T

REG) i milten (figur 5B), som målt ved CD4

+ -celler der udtrykker CD25 og foxp3 (figur S1 ). Interessant, strålebehandling signifikant øget proliferation af CD8 T-celler og ikke-regulatoriske CD4 T-celler (figur 5C) som målt ved ekspression af Ki67 (fig S1), hvilket antyder, at endogene immunresponser kan være mere aktiv i milten efter strålebehandling af primær tumor.