PLoS ONE: DNA Methylering-Uafhængig Tilbagevenden af ​​gemcitabin Resistance af Hydralazine i livmoderhalskræft Cells

Abstrakt

Baggrund

Nedregulering af gener, der koder for nukleosid transportvirksomheder og lægemiddelmetabolisme ansvarlige for optagelse og metaboliske aktivering af nukleosid gemcitabin er relateret med erhvervet tumor resistens mod denne agent. Hydralazin er blevet vist at vende doxorubicin resistens i en model af brystcancer. Her ønskede vi at undersøge, om epigenetiske mekanismer er ansvarlige for at erhverve resistens mod gemcitabin og hvis hydralazine kunne genoprette gemcitabin følsomhed i livmoderhalskræft celler.

Metode /vigtigste resultater

livmoderhalskræft cellelinie Calo celle linje blev dyrket i nærvær af stigende koncentrationer af gemcitabin. Nedregulering af

hENT1

DCK

gener blev observeret i de resistente celler (CaLoGR), som ikke var forbundet med promotor methylering. Behandling med hydralazin vendt gemcitabin modstand og førte til

hENT1

dCK

gen reaktivering i en DNA-promotor methylering-uafhængig måde. Ingen ændringer i HDAC samlede aktivitet eller i H3 og H4 acetylering på disse promotorer blev observeret. Chip analyse viste H3K9m2 på

hENT1

DCK

genpromotorer som korrelerede med hyper-ekspressionen af ​​G9A histon methyltransferase på RNA og protein niveau i de resistente celler. Hydralazine hæmmede G9A methyltransferaseaktivitet in vitro og nedbrydning af G9A genet ved IRNA restaureret gemcitabin følsomhed.

Konklusioner /Betydning

Vores resultater viser, at erhvervet gemcitabin modstand er forbundet med DNA promoter methylering-uafhængig

hENT1

dCK

gen nedregulering og hyper-udtryk G9A methyltransferase. Hydralazine vender gemcitabin modstand i livmoderhalskræft celler via hæmning af G9A histon methyltransferase

Henvisning:. Candelaria M, de la Cruz-Hernandez E, Taja-Chayeb L, Perez-Cardenas E, Trejo-Becerril C, Gonzalez- Fierro A, et al. (2012) DNA Methylering-Uafhængig Tilbagevenden af ​​gemcitabin Resistance af Hydralazine i livmoderhalskræft Cells. PLoS ONE 7 (3): e29181. doi: 10,1371 /journal.pone.0029181

Redaktør: Vladimir N. Uversky, University of South Florida College of Medicine, USA

Modtaget: Februar 16, 2011; Accepteret: November 22, 2011; Udgivet: 12 marts, 2012 |

Copyright: © 2012 Myrna et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af Psicofarma SA de CV De finansieringskilder havde en rolle i dataindsamling, men ikke i studie design, dataanalyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere eksterne midler modtaget for denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:. ADG har modtaget betalt rådgivning fra Psicofarma S.A. de C.V. til andre formål end dem, der vedrører denne forskning spørgsmål. Forfatterens Institution (nationale selvstyrende universitet Mexico) har patentansøgninger vedrørende hydralazin. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Gemcitabin (2 ‘, 2′-difluor-2’-deoxycytidin, dFdC) er en analog af cytosinarabinosid der besidder karakteristiske farmakologiske egenskaber og bredt antitumor-spektrum aktivitet. Gemcitabin har signifikant klinisk aktivitet mod en række maligniteter, herunder pancreas, lunge, blære, bryst, ovarie og hoved og hals [1], [2]. I livmoderhalskræft gemcitabin plus cisplatin og strålebehandling forbedrer overlevelse resultater sammenlignet med cisplatin stråling i fremskreden sygdom og når det bruges med cisplatin er lige så effektiv som andre cisplatin dubletter mod metastatisk livmoderhalskræft [3].

Gemcitabinopløsninger farmakologiske egenskaber er enestående i at to hovedklasser af gener er afgørende for dens antitumor effekter og modstand: membran transportør protein-kodende gener, hvis produkter er ansvarlige for narkotika intracellulær optagelse, og narkotika stofskifte-kodende gener, som katalyserer dens aktivering og inaktivering [4]. Således er ekspressionen af ​​disse gener er nøglen til tumorrespons og modstand mod gemcitabin. De fleste intracellulær optagelse af gemcitabin er medieret af hENT1 (human equilibrativ nukleosid Transporter 1). Følsomhed over for nukleosidanaloger herunder gemcitabin

in vitro

og i det kliniske miljø har vist sig at korrelere med ekspression af denne transporter henviser hENT1-deficiente celler er meget resistente over for denne nukleosid [5] – [8]. Patienter med bugspytkirtlen og lungekræft udtrykker hENT1 har højere responsrater og længere median overlevelse efter gemcitabin end personer med lave eller fraværende hENT1 [9], [10]. Med hensyn gemcitabin stofskifte gener,

dCK

udtryk er blevet forbundet med gemcitabin følsomhed. Cellelinjer udvalgt til modstand for nukleosid analoger har vist mutations inaktivering af

dCK

dCK

transfektion resultater i resensitization af celler til Ara-C og gemcitabin [11] – [12]. Hos cancerpatienter en lavere ekspression af DCK associeret med kortere samlet overlevelse [13], [14]. På den anden side, diphosphorylated gemcitabin er en inhibitor af ribonukleotidreduktase, en heterotetramere enzym består af to homodimerer (RRM1 og RMM2), som er nøglen til syntese af intracellulært deoxynukleotidtriphosphat [15]. Over udtryk for RRM1 og RRM2 har været forbundet med gemcitabin modstand i cancer-cellelinjer og NSCLC [16], [17]. Cytidindeaminaseinhibitor (CDA) katalyserer deaminering af cytidin, dexoycytidine, og deres analoger, såsom gemcitabin men dens rolle mediere gemcitabin resistens er kontroversiel [18]. Disse data tyder klart på, at et formindsket eller mangel på ekspressionen af ​​dCK og hENT1 er afgørende for gemcitabin modstand, men de mekanismer, der fører til deres transkriptionel silencing er endnu ikke defineret. Tidligere undersøgelser har vist, at methylering ved

dCK

gen er ansvarlig for dens inaktivering [19] dog; dette fortsat skal påvises for

hENT1

Hydralazine er en lille-molekyle DNA demethyleringsmiddel [20] kendt for at demethylate genpromotorer og fremkalde gen reaktivering in vitro [21] -. [ ,,,0],24] og in vivo [25]. Anvendes i kombination med histondeacetylaseinhibitoren valproat genaktiverer ekspressionen af ​​gener hos cancerpatienter [26] – [28]. Desuden har hydralazin blevet vist at vende doxorubicin resistens i en model for brystcancer [29]. Da det meste af arbejdet på gemcitabin modstand er blevet gjort i bugspytkirtelkræft cellelinjer og har dette stof blevet grundigt evalueret i livmoderhalskræft [30] vi ønskede at undersøge, om epigenetiske mekanismer er ansvarlige for at erhverve resistens mod dette middel, og hvis hydralazine kunne genoprette gemcitabin følsomhed i livmoderhalskræft celler. Vores resultater viser, at i denne model, hydralazin vender gemcitabin modstand i en DNA methylering-uafhængig måde.

Resultater

Livmoderhalskræft cellelinjer blev undersøgt for den basale udtryk for

hENT1

,

dCK

,

RRM1

,

RRM2

,

CDA

gener og derefter deres følsomhed over for gemcitabin blev evalueret. IC

50 i SiHa-cellelinien var 1000 pm, og det blev arbitrært anset som en primær resistente. IC

50 for de andre cellelinjer var: 3,3 pM, 0,3 pM og 0,1 pM for Caló, HeLa og C33A celler, henholdsvis (figur 1A). Som vist i figur 1B, som den basale ekspression af gener kodende for gemcitabin transport og metabolisme blev justeret til actin og med henvisning til den normale cervix, varierede blandt de cellelinier og et forhold mellem niveauer af disse gener med den iboende følsomhed /resistens status til gemcitabin i disse cellelinjer blev ikke fundet.

A. IC

50 af gemcitabin til HeLa, Calo, SiHa og C33A celler blev 3,3 pM, 0,3 pM, 1000 pm og 0,1 pM som henholdsvis vurderet med krystalviolet assay. B. Basal udtryk for

hENT1

,

dCK

,

RRM1

,

RRM2

,

CDA

gener som evalueret af RT PCR. Der var ingen korrelation mellem IC

50 og den iboende følsomhed /resistens status. Expression blev justeret til udtrykket i normal livmoderhalsen.

For at undersøge om induktion af gemcitabin resistens er relateret til ændringer i ekspressionen af ​​

hENT1

,

dCK

,

RRM1

,

RRM2

,

CDA

gener, Calo celler blev udsat for stigende koncentrationer af gemcitabin og når cellerne blev resistente de blev behandlet med hydralazin på forskellige tidspunkter og koncentrationer . Figur 2A viser, at efter fem uger, Calo celler erhvervet resistens over for dette antimetabolit og var i stand til at vokse ved 927 uM af gemcitabin (280-fold koncentration). Modstanden stat blev ledsaget af nedregulering af halvdelen af ​​

hENT1

dCK

.

RRM1

RRM2

gener havde mindre ændringer, mens

CDA

blev også reduceret (figur 2B). Desuden regne 2C viser, at nedreguleringen af ​​

hENT1

DCK

gener opstod efterhånden som modstand udvikles. Behandling af CaLoGR celler med hydralazin ved 2 uM i 10 dage, 10 uM og 30 uM i 5 dage var i stand til at vende tilbage gemcitabin modstand som vist i figur 2D. Den tilsvarende IC

50’erne for disse behandlinger var 1,7 uM, 2,7 uM og 6,6 uM henholdsvis.

A. Efter at erhverve gemcitabin modstand, IC

50 i CaLoGR celler var 927 uM (280-fold koncentration). B. Angivelse af

hENT1

,

dCK

og

CDA

blev næsten halveret, RRM1 og RRM2 havde mindre ændringer. C. Reduktionen af ​​

hENT1

DCK

gener opstod efterhånden som modstand udvikles. D. Behandling af CaLoGR celler med hydralazin ved 2 uM i 10 dage, 10 uM og 30 uM i 5 dage reverterede gemcitabin modstand. De tilsvarende IC

50’erne for disse behandlinger var 1,7 uM, 2,7 uM og 6,6 uM henholdsvis.

For at afgøre, om reversion af modstanden ved hydralazin der er en svag DNA demethyleringsmiddel er ledsaget af ændringer i ekspressionen af ​​

hENT1

dCK

gener, blev en RT-PCR af disse to gener udført. Resultaterne i Figur 3A viser, at som forventet førte hydralazin til re-ekspression af disse gener i de tre behandlingsgrupper betingelser evalueres. DNA promotor hypermethylering har vist sig at lukke munden gener i kemoterapi modstand modeller derfor status methylering på disse initiativtagere blev evalueret af MSP. Interessant,

hENT1

dCK

initiativtagere blev delvist methylerede selv i den basale tilstand og viste ingen hypermethylering i den resistente CaLoGR cellelinje. Hydralazin ved 2 uM, 10 uM eller 30 uM ikke demethylate disse promotorer som vist ved MSP i figur 3B. For at bekræfte dette resultat, seks uafhængige kloner (basal, resistente og modstandsdygtig behandlet med hydralazin) var bisulfit sekventeret men blev ikke observeret nogen demethylering i CpG evalueret (fig. 3C). Genet reaktivering derfor var uafhængig af dens demethylere effekt, hvilket tyder på, at andre epigenetiske mekanismer kan konto til nedregulere og genaktivere disse gener i denne model. For at bekræfte, at den manglende demethylere effekt af hydralazin på

dCK

hENT1

var ikke på grund af sin svage demethylere evne, figur 3D viser, at i den samme cellelinje og betingelser, genet

DAPK

blev demethyleret med hydralazin ved 2 uM 10 uM og 30 uM.

A. Hydralazin ved de tre testede betingelser (2 uM i 10 dage, 10 uM og 30 uM i 5 dage) genoprettede ekspressionen af ​​disse gener. B.

hENT1

,

DCK

gener blev delvist denatureret basalt og promotor methylering ændrede sig ikke i de resistente celler hverken efter hydralazin behandling som evalueret af MSP. C. Kort over promotorerne på disse gener viser CpG øer tæthed og fordeling samt positionerne af primere for MSP, chip og sekventering. Det er også vist ved sekventering at CpG methylering ikke ændrede i

dCK

og

hENT1

gener hverken i de resistente celler hverken når de behandles med hydralazin. Tomme og fyldte cirkler repræsenterer demethyleres og denatureret CpG’er i fem uafhængige sequencences. D. Hydralazine kunne demethylate

DAPK

promotor i Calo cellelinje.

En stigning af histondeacetylaseaktivitet er blevet vist at inducere gene silencing i nogle modeller. For at bestemme om dette fænomen deltager i gemcitabin resistens i livmoderhalskræft blev deacetylase-aktiviteten målt i Caló celler under anvendelse af et kit, som indeholder prototypen HDAC inhibitor Trichostatin A som en positiv kontrol. Figur 4A viser, at ingen ændringer i HDAC-aktivitet blev observeret; faktisk blev observeret et lille fald i deacetylase aktivitet i de resistente celler. Evalueringen af ​​den samlede acetylering på H3 og H4 i

hENT1

DCK

genpromotorer af Chip analyser mens viste et fald i H3 og H4 acetylering på

hENT1

promotor , en let forhøjelse af acetylering af H3 blev observeret i

dCK

promotor og ingen ændring for H4 acetylering (figur 4B). Disse tilsyneladende modsatrettede resultater argumentere imod en stor rolle i H3 og H4 acetylering at forklare lyddæmpning af disse gener af denne histon modifikation. Yderligere, valproinsyre behandling ved 1 mM i 5 dage undladt at reaktivere ekspressionen af ​​disse gener og vende gemcitabin modstand (ikke vist).

A. Samlet histondeacetylaseaktivitet viste ingen større ændringer mellem basal og resistente celler, faktisk et lille fald blev observeret i de resistente celler som evalueres med HDAC aktivitet kit. B. Total acetylering af H3 og H4 som vurderet af Chip viste et fald i H3 og H4 acetylering på

hENT1

promotor, en let forhøjelse af acetylering af H3 og ikke ændre i H4 ved

dCK

promotor.

for at opnå yderligere indsigt i de epigenetiske mekanismer

hENT1

dCK

nedregulering i denne model af gemcitabin modstand, histon methylering blev analyseret. Methylering af H3K9 er en kendt undertrykkende varemærke mens methylering ved H3K4 aktiverer, deraf methylering ved disse lysiner blev vurderet ved chipanalyse i den basale tilstand, i resistente celler og efter hydralazin behandling. Figur 5 viser, at for

hENT1

gen, blev der ikke observeret ændringer i H3K4me3 methylering men H3K9me2 steget mildt i de resistente celler og faldt efter hydralazin behandling. Med hensyn til

dCK

gen en lille reduktion i H3K4me3 blev observeret i de resistente celler, som ikke blev ændret ved hydralazin. Alligevel methyleringen ved H3K9me2 let forhøjet i resistente celler og reduceret efter hydralazin. Ændringerne i båndintensitet blev normaliseret mod deres respektive input intensitet. Som DNA demethyleringsmiddel 5-aza-CdR har vist sig at falde H3K9me2, brugte vi MetaDrug ™ program til at afdække, om hydralazin kan være involveret i reguleringen af ​​H3K9 methylering. Som vist i figur 6, kan hydralazin ikke blot påvirke DNA-methylering i cytosin, men også kan være involveret i negativ regulering af H3K9 methylering. For at bekræfte disse forudsigelser mRNA ekspressionen af ​​

G9A

blev evalueret i Calo celler ved qPCR. Resultaterne viser, at ekspressionen af ​​dette gen steg i de resistente celler, hvorimod hydralazin faldt dens niveau (figur 7A). Lignende resultater blev opnået ved Western blot, G9A protein steget i de resistente celler og faldt efter hydralazin behandling (figur 7B). For yderligere at undersøge den G9A hæmmende evne hydralazin, en H3K9 methyltransferase

in vitro

inhiberingsassay blev udført ved hjælp af

EpiQuik

™ histon methyltransferaseaktivitet /Hæmning Assay Kit (H3-K9). Hydralazin ved 2 uM og 10 uM stærkt reduceret H3K9 methylering (figur 7C). For at bekræfte den biologiske betydning af disse in vitro konstatering knockout af G9A genet ved hjælp af et IRNA assay viste, at transficerede Calo celler genvundet følsomhed over for hydralazin som ikke blev yderligere modificeret, når disse celler også blev behandlet med hydralazin (fig. 8).

For

hENT1

gen, blev der ikke observeret ændringer i H3K4m3 methylering men H3K9me2 steget mildt i de resistente celler og faldt efter hydralazin behandling. I

dCK

gen var der en mindre nedgang i H3K4me3 de resistente celler, som ikke blev ændret ved hydralazin. Methyleringen ved H3K9me2 let forhøjet i resistente celler og reduceret efter hydralazin. Ændringerne i band intensitet blev normaliseret mod deres respektive indgange.

MetaDrug ™ program forudsagt, at hydralazin kan påvirke ikke kun DNA methylering i cytosin, men også kan være involveret i negativ regulering af H3K9 methylering.

A. Kvantitativ RT-PCR af

G9A

viser, at resistente CaLoGR celler havde en stigning i forhold til basal og at hydralazine reducerer dets udtryk (basal vs resistente, p 0,05). B. På proteinniveau, var der en stigning i G9A i de resistente celler, der faldt efter hydralazin behandling. C. H3K9 methyltransferase

in vitro

inhiberingsassay. Hydralazine på 2 uM og 10 uM stærkt reduceret H3K9 methylering (ubehandlet vs hydralazin, p 0,05)

A.. Inhiberende koncentration af gemcitabin i Caló celler ikke nået. B. Udtømning af G9A restaureret gemcitabin følsomhed (IC

50 10,3 uM). C. Ingen yderligere ændringer i IC

50 blev set, da hydralazin blev sat til G9A udtømte celler. D. qPCR af G9A bekræfter den delvise udtømning af

G9A

messenger.

Diskussion

Resultaterne af denne undersøgelse af gemcitabin modstand i livmoderhalskræft celler og dens reversion med den svage DNA demethyleringsmiddel hydralazin viser, at udviklingen af ​​resistens ledsages af nedregulering af vigtige gener for gemcitabin intracellulære optagelse og stofskifte,

hENT1

dCK

. Interessant denne nedregulering skyldtes ikke genpromotor hypermethylering som påvist af MSP og bisulfit sekventering; alligevel, hydralazin var i stand til at genaktivere deres udtryk og at vende tilbage gemcitabin modstand. Disse data tyder på, at andre epigenetiske mekanismer fungerer at lukke munden på kemoterapi resistente gener, og at hydralazine har DNA methylering-uafhængige virkninger, sandsynligvis gennem at påvirke negativt reguleringen af ​​H3K9 methylering som forudsagt af METADRUG ™ program.

Disse resultater er vigtigt at opnå yderligere viden på mekanismerne i kemoterapi resistens. Gene inaktivering af DNA methylering var den første epigenetisk mekanisme vist sig at være direkte involveret i købet af kemoterapi modstand i

in vitro

modeller [31], [32] men som viden om epigenetiske processer har udviklet sig, er deltagelse af andre epigenetiske spillere som histondeacetylaser både zink-og NAD-afhængige samt histon metyltransferaser, histon demethylases og microRNA’er i inaktivering processen med gener involveret i kemoterapi følsomhed og modstand er blevet afdækket [33] – [38]. Vores resultater tyder på, at i denne model af gemcitabin modstand i livmoderhalskræft, kunne methylering på H3K9 være den vigtigste mekanisme til tavshed ekspression af

hENT1

dCK

gener, der baner vejen for yderligere afprøvning deltagelse af denne histon modifikation i andre modeller af kemoterapi modstand. Relevansen af ​​dette fund stiger som hæmmere af G9A histon methyltransferaser er ved at blive tilgængelige for undersøgelse [39].

Tidlige undersøgelser har vist, at de DNA-methylering hæmmere induceret

dCK

re-udtryk i CEM /dCK- celler [19] og at manglen på ekspression af dette centrale gen for aktivering af flere nukleosidanaloger herunder gemcitabin sker ved promotor methylering [40] – [43]. Hidtil ingen anden epigenetisk mekanisme til lyddæmpning dette gen er blevet beskrevet i kemoterapi modstand modeller. Ligeledes manglende ekspression eller lave niveauer af hENT1 stærkt korrelerer med resistens mod gemcitabin og andre nukleosidanaloger [6], [9], [10], [44]. Selvom flere membran transportproteiner kodende-gener, såsom hOAT3 (SLC22A8), det opløste stof carrier familie 5 iodidetransporter (SLC5A8), den reducerede folat bærer (RFC), det cellulære retinol-bindende protein 1, og den humane Na + /I-symporter er kendte at blive nedreguleret ved DNA methylering og genaktiveret ved DNA methyltransferase hæmmere [45] – [49], her var vi ikke i stand til at påvise, at promotor methylering på

hENT1

tegner sig for dens observerede nedregulering, men dens reaktivering blev opnået ved hydralazin gennem en DNA methylering-uafhængig mekanisme tyder på, at faktisk

hENT1

er nede reguleret af en epigenetisk effekt sandsynligvis gennem G9A histon methyltransferase-medieret H3K9 methylering.

På trods at begge gener indeholder CpG øer ved deres promotorer [50], [51], og at i det mindste for

dCK

gen det har konsekvent vist, at dets promotor methyleres i resistente celler [19], i vores model er der ingen sammenhæng mellem promotor methylering på disse initiativtagere og udtryk. Ikke desto mindre demethyleringsmiddel virkning på andre gener (

DAPK

) blev bevist, udelukker, at hydralazin har nogen demethyleringsmiddel effekt. Disse data førte os til at søge efter andre epigenetiske mekanismer, der kunne tegne sig for gendæmpning. Ingen konsistente ændringer i histon deacetylase eller i histonacetylering ved disse genpromotorer blev observeret udelukke denne histon modifikation som et lyddæmpende mekanisme for disse gener i denne model. Som DNA methyltransferase inhibitor 5-aza-CdR decitabin kan udvise alternative virkningsmekanismer til DNA methylering med hensyn til transkriptionel reaktivering såsom histon H3K9 demethylering i de regulatoriske regioner af lyddæmpede gener [52] vi udført en søgning i METADRUG ™ program til få ledetråde over på andre mulige virkninger af hydralazin. Vores resultater viste, at ja hydralazin forventes at være involveret i den negative regulering af H3K9 methylering. Dette resultat førte os til at analysere af Chip analyse for ændringer i H3K9me2 på både

dCK

hENT1

initiativtagere i CaLoGR cellerne. Begge initiativtagere indeholdt H3K9me2 i ubehandlede celler, let steg i resistente tilstand, og dette lyddæmpning mærke blev delvist afløst af hydralazin. Vi skal dog understrege, at disse ændringer dog i H3K9m2 selvom konsekvente i tre separate analyser, var milde som kan forklares ud fra, at mindst otte histon methyltransferaser herunder G9A har også H3K9 som deres mål methylering [52].

for yderligere at bekræfte den konstatering, viste en kvantitativ RT-PCR, at ekspressionen af ​​G9A blev øget i de resistente celler sammenlignet med følsomme celler og niveauer var imidlertid lavere efter behandling med hydralazin. Ikke desto mindre blev en dramatisk reduktion på proteinniveauet af denne histon methyltransferase observeret ved western blot i de resistente celler efter hydralazin behandling. Bemærkelsesværdig, disse resultater er meget lig dem, der findes med 5-aza-CdR i en brystkræft model af maspin re-udtryk, hvor reduktioner i G9A histon methyltransferase protein niveauer ikke skyldes virkninger på G9A genekspression [53]. Yderligere støtte for denne effekt af hydralazin blev opnået ved et in vitro assay af H3K9 methylering viser, at hydralazin hæmmer aktiviteten af ​​dette histon methyltransferase. Den biologiske betydning af disse bemærkninger blev bevist ved at vise, at nedbrydende G9A i de resistente Calo celler førte til genvinde følsomhed over for gemcitabin af disse celler, og at højere følsomhed over for gemcitabin blev ikke nået ved at tilsætte hydralazin til G9A udtømte celler argumenterer mod en

off-target

effekt af hydralazin.

af note, METADRUG ™ programmet også tilkendegivet, at hydralazin kunne virke positivt i reguleringen af ​​H3K4 methylering, som ikke blev observeret i vores undersøgelse, men de seneste data fra vores gruppe tyder på, at i flere cancercellelinier behandling med hydralazin og valproinsyre førte til over-ekspression af MIC A og MIC B ligander, som blev ledsaget af en stigning i H3K4 methylering ved disse genpromotorer antyder, at hydralazin kunne have denne virkning på dette histon mærke [54].

Enten iboende eller erhvervet lægemiddelresistens er en kompleks og pleiotropisk fænomen og andre potentielle spillere, der deltager i gemcitabin modstand i denne model blev ikke undersøgt i dette studie. For tilfælde, på trods af

RRM1

RRM2

overekspression er blevet relateret til resistens blev observeret [55] ingen større ændringer på disse gener i denne undersøgelse. Paradoksalt nok blev CD-genet nedreguleres i de resistente celler på trods af sin overekspression har konsekvent været vist relateret til resistens over for gemcitabin og andre nukleosidanaloger [56]. Dette fund yderligere understreger kompleksiteten af ​​resistens, som synes at være gen og celle model-specifik.

Resultaterne af denne undersøgelse er af potentiel klinisk relevans i det mindste for denne model af resistens. Gemcitabin bruges ofte til livmoderhalskræft enten sideløbende for stråling eller i kombination med cisplatin til fremskredne stadier [3]. Erhvervet resistens over for dette lægemiddel kan være ansvarlig for behandlingssvigt; Derfor kan hydralazin forhindre modstand og potentielt øge effektiviteten af ​​gemcitabin. Hertil kommer, at afdække, at H3K9 methylering kan føre til kemoterapi modstand fortjener sin test i andre forsøgsmodeller.

Materialer og metoder

Cell kultur

livmoderhalskræft cellelinier HeLa , SiHa og C33A blev opnået fra ATCC. Den Calo cellelinje blev en venligst doneret af Dr. Monroy-Garcia [57]. Cellelinier blev dyrket ved 37 ° C i fugtig atmosfære indeholdende 5% C0

2 i DMEM suppleret med 10% føtalt kalveserum (Gibco, Grand Island, NY).

Cytotoksicitetsassays

celler blev podet i 6-brønds mikrotiter Falcon plader (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) ved 2 × 10

3 celler /brønd i 0,2 ml komplet medium og derefter behandlet i 24 timer med gemcitabin i koncentrationer fra 1 × 10

-8 M til 1 x 10

-4 M. Derefter blev mediet indeholdende gemcitabin fjernet og frisk medium blev tilsat. Efter 72 timer blev mediet aspireret og erstattet i 10 minutter med 50 pi 0,75% krystalviolet i 50% ethanol, 0,25% NaCl og 1,75% formaldehydopløsning. Celler blev derefter vasket med vand, lufttørret, og farvestoffet elueredes med PBS + 1% natrium duodecyl sulfat (SDS) opløsning. Cellelevedygtighed blev vurderet ved farvestof absorbansen måles ved 570 nm på et automatiseret ELISA-læser. Alle assays blev udført tre gange. Den cytotoksiske virkning af hver behandling blev udtrykt som en procentdel af cellelevedygtighed i forhold til ubehandlede kontrolceller (procentdel af kontrol) og er defineret som [A

570 nm behandlede celler /A

570 nm ikke-behandlede celler] × 100.

Induktion af gemcitabin modstand og hydralazin behandling

Calo cellelinie blev dyrket ved 37 ° C i fugtig atmosfære indeholdende 5% C0

2 i DMEM suppleret med 10% føtalt kalveserum (Gibco, Grand Island, NY). Stigende doser af gemcitabin (IC

30, IC

50, IC

80 og endelig to trin ved IC

90 blev sat ugentligt at fremkalde gemcitabin modstand. Efter tilsætning IC

90 to gange, cytotoksiske assay blev gentaget for at bekræfte gemcitabin modstand. Salg

gemcitabin induceret resistente Calo celler (CaLoGR), blev dyrket ved 37 ° C i fugtig atmosfære indeholdende 5% C0

2 i DMEM suppleret med 10% føtalt kalv serum (Gibco, Grand Island, NY). Derefter hydralazin blev tilsat ved 10 pM og 30 pM i 5 dage og 2 pM i 10 dage. mediet indeholdende lægemidlet blev genopfyldes dagligt.

RT-PCR

RNA blev isoleret fra cellelinjer ved standardmetoder. Derefter 5 ug RNA blev behandlet med DNAse. Revers transkription blev udført under anvendelse af RNA-kittet PCR Core Gene Amp

R (Applied Biosystems Roche) efter tjenesteyderen anbefalinger .

GAPDH

,

hENT1

,

dCK

,

RRM1

,

RRM2

,

CDA

gener var forstærkes ved hjælp af de følgende oligonucleotidprimere:

GAPDH

: S: 5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3 ‘, AS: 5′-ATGGGTGGAATCATATTGGAAC-3’

hENT1

: S: 5’GCAAAGGAGAGGAGCCAAGA-3 ‘ , AS: 5’CCCAACCAGTCAAAGATATTG-3 ‘

dCK

: S: 5′-CGATCTGTGTATAGTGACAG-3′, AS: 5’GTTGGTTTTCAGTGTCCTATG-3 ‘,

RRM1

: S: 5′-GCAGCTGAGAGAGGTGCTTT -3 ‘, AS: 5′-CAGGATCCACACATCAGACA-3′, RRM2: S: 5’-GAGTTCCTCACTGAGGCC-3 ‘, AS: 5′-TTAGAAGTCAGCATCCAAG-3’,

CDA

: S: 5 ‘GTTGCCTTGTTCCCT TGTAA -3 ‘, AS: 5′-TCTTGCTGCACTTCGGTATG-3’. PCR blev udført i et totalt volumen på 25 pi indeholdende cDNA, 20 pmol af primere, 200 uM dNTP’er, 0,25 U Taq polymerase og 1 x buffer leveret af producenten (Applied Biosystems, Foster City, CA). PCR’er blev initieret ved en denatureringstrin ved 94 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 30 cykler ved 94 ° C i 35 sek, 59 ° C i 35 sek og 72 ° C i 45 sek; en endelig ekstension blev udført ved 72 ° C i 7 min. Produkter blev elektroforesebehandlet i 2% agarosegeler.

G9A

genekspression blev evalueret ved kvantitativ RT-PCR (iCycler iQ, Bio-Rad, Hercules, CA) under anvendelse af SYBR Green I dye (Bio-Rad, Hercules, CA) under anvendelse af følgende primere:

G9A

; Sense 5′-CTCCGCTGATTTTCGAGTGTAA-3 ‘og antisense 5′-GTCGAAGAGGTAAGAATCATCC-3’.

GUSB

(human beta glucuronidase) specifikke primere blev anvendt som endogen kontrol; sense 5′-CCTGTGACCTTCTGAGCAA-3 ‘og antisense 5′-AAACCCTGCAATGGTTTCTG-3’. PCR startede med inkubering ved 95 ° C i 1 min, efterfulgt af PCR-cykler af 35 sek, ved 94 ° C, 35 sek, 59 ° C, 50 sek, ved 72 ° C, med en endelig forlængelse ved 72 ° C i 7 min. Antallet af PCR-cykler blev bestemt eksperimentelt. Data blev analyseret ved anvendelse af 2-ΔΔCT fremgangsmåde og rapporteres som den gange ændring i genekspression normaliseret til det endogene kontrol genet (

GUSB

) og i forhold til celler uden behandling.

IRNA transfektionsassay

Gemcitabin erhvervet resistente celler blev podet i 24 microtitier Falcon (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) ved 1,5 × 10

5 celler /brønd i 0,2 ml Optimem og efter 24 timer blev transficeret med lipofectamin og

G9A

siRNA (Ambrion kat # 439.242). Negativ kontrol blev udført med lipofectamin RANiMAX indeholdende siRNA Scramble (Ambrion, kat # 4.390.844). Celler blev dyrket blev dyrket ved 37 ° C i fugtig atmosfære indeholdende 5% C0

2.