PLoS ONE: MicroRNA-302a Fungerer som en formodet tumorsuppressor i tyktarmskræft ved at målrette Akt

Abstrakt

Micro RNA (miRNA) er vigtige regulatorer er involveret i forskellige fysiske og patologiske processer, herunder kræft. Den miRNA-302 familie er blevet dokumenteret som spiller en afgørende rolle i carcinogenese. I denne undersøgelse undersøgte vi rollen af ​​miRNA-302a i coloncancer. MiRNA-302a udtryk blev påvist i 44 kolon kræft væv og 10 normale kolon væv, og deres klinisk-patologisk betydning blev analyseret. Celledeling og cellecyklus-analyse blev udført på kolon kræftceller, der stabilt udtrykte miRNA-302a. Målet gen af ​​miRNA-302a og nedstrøms vej blev yderligere undersøgt. Sammenlignet med normale colon væv blev miRNA-302a udtryk nedreguleret i tyktarmskræft væv. Overekspression af miRNA-302a induceret G1 /S cellecyklus arrest i colon cancerceller, og undertrykt tyktarmskræft celledeling både

in vitro

in vivo

. Desuden miRNA-302a hæmmede

AKT

udtryk ved direkte binding til dets 3 ‘utranslaterede region, hvilket resulterer i efterfølgende ændringer af

AKT-GSK3p-cyclin D1

vej. Disse resultater afslører miRNA-302a som en tumorsuppressor i coloncancer, hvilket antyder, at miRNA-302a kan anvendes som et potentielt mål for terapeutisk intervention i tyktarmskræft

Henvisning:. Sun S, Zhang G, Wu Z, Shi W, Yang B, Li Y (2014)

MicroRNA-302a

Fungerer som en formodet tumorsuppressor i tyktarmskræft ved Målretning

Akt

. PLoS ONE 9 (12): e115980. doi: 10,1371 /journal.pone.0115980

Redaktør: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: September 15, 2014 Accepteret: December 2, 2014; Udgivet: 26 December, 2014

Copyright: © 2014 Sun et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. De klinisk-patologiske funktioner er ikke tilgængelige for offentligheden, men kan stilles til rådighed på anmodning til Kontaktforfatter. Alle data er nødvendige for at replikere undersøgelsen er til stede i papiret

Finansiering:.. Forfatterne har ingen finansiering eller støtte til rapporten

Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Ifølge de kinesiske Cancerregisteret Årsrapport (2012), har colon /endetarmskræft blevet den anden mest almindelige kræftform og den anden og fjerde hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald hos kvinder og mænd, henholdsvis i Kina [1]. Faktisk tyktarmskræft er en af ​​de mest almindelige kræftformer globalt, der tegner sig for ca. 9% af kræftrelaterede dødsfald [2], hovedsagelig på grund af metastatisk progression [3]. Dette nødvendiggør identificere avancerede molekylære markører til diagnosticering, som ville støtte i tidlig diagnosticering og forebyggelse af metastatisk progression i tyktarmskræft. Kirurgi er fortsat behandling af valg for tyktarmskræft; men for sent, har en mere tværfaglig tilgang indarbejde neoadjuverende kemoterapi blevet kendetegnet for behandling [4]. Det måske kan ikke understreges nok, selvom behovet for at overvåge tumor respons på behandlingen, for at udvælge de bedste kandidater til operation for at sikre positive resultater, og der ligger behovet for at forstå den underliggende patologiske mekanisme for tyktarmskræft debut og progression. De kritiske hændelser, der styrer hele processen for tyktarmskræft metastase er stadig ukendte.

Dyrkning data viser, at microRNA (miRNA), en type af endogen, små ikke-kodende RNA’er, deltage i forskellige cellulære processer. Gennem specifikt at binde og spalte mRNA eller hæmme deres oversættelse [5], miRNA funktion som enten onkogener eller tumor undertrykkere [6].

miRNA-302 familie blev første gang identificeret i humane embryonale stamceller (hESCs) og den menneskelige embryonale carcinomaceller i 2004. Siden da har forskellige undersøgelser af miRNA-302 familien med fokus på dets potentielle rolle i reprograming somatiske celler i induceret pluripotente stamceller, samt embryonale selvfornyelse [7]. Adskillige transkriptionsfaktorer, som udtrykkes tidligt i kræft stamceller udvikling og vedligeholdelse, såsom

Oct4

,

Sox2

, og

Nanog

, blev fundet afgørende for den transkriptionelle regulering af miRNA-302 familien [8]. Interessant Fareh et al. viste, at stabil ekspression af miRNA-302 var i stand til at fremkalde tab af

Oct4

,

Sox2

, og

Nanog

[9]. Rollen af ​​miRNA-302 i tumorigenese har været debatteret for nylig, da modstridende konklusioner er tegnet af forskellige forskergrupper. For eksempel blev endogen miRNA-302 ikke påvist i cervicale cancerceller, og ektopisk ekspression af miRNA-302 inhiberede celleproliferation og tumordannelse [10]. I modsætning hertil transfektion af miRNA-302b i Colon kræftceller resulterede i en stigning i stemness af CD133 + HT 29 celler

in vitro

[11]. Men til dato er blevet udført, ingen undersøgelser for at undersøge den mulige rolle af miRNA-302 i patienter med tyktarmskræft eller /og i tyktarmskræft patogenese i xenograftmodeller, hvilket var det vigtigste mål for den aktuelle undersøgelse.

Materialer og metoder

Patientprøver

tyktarmskræft væv og godartet tyktarm væv blev opnået fra vævet bank på General Hospital i Folkets Befrielseshær. Klinisk-patologisk funktioner i disse patienter blev hentet fra Onkologisk Afdeling database. Undersøgelsen Protokollen blev godkendt af Institutional Board Forskning Review på General Hospital i Folkets Befrielseshær og underskrevet informeret samtykke blev opnået fra alle undersøgelsens deltagere. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen og relevante politikker i Kina.

Cell kultur

Humane tyktarmskræft cellelinjer, HCT8 og HCT116 og humane embryonale nyre 293T-celler ( HEK293T) blev købt fra Shanghai Bioleaf Biotech Co, Ltd (Shanghai, Kina). HCT8, HCT116, og HEK293T celler blev dyrket i DMEM medium suppleret med 10% føtalt bovint serum. Celler blev dyrket ved 37 ° C ved 5% CO

2.

RNA, miRNA ekstraktion, og kvantitativ real-time polymerasekædereaktion

Totalt RNA blev isoleret fra dyrkede celler og tumor væv under anvendelse af Trizol-reagens. Første streng cDNA blev syntetiseret under anvendelse af RevertAid First Strand cDNA-syntese kit (Life Technology, Carlsbad, CA), som derefter blev anvendt til real-time polymerasekædereaktion (PCR) sammen med forward og reverse primere og Power SYBR Green PCR Master Blande. β-actin blev anvendt som en intern kontrol for

AKT

transkriptniveauer. Primersekvenserne anvendte var som følger:

AKT

-forward: GGGTTTCTCCCAGGAGGTTT, omvendt: GTCCATGGTGTTCCTACCCA; β-actin-forward: ACCGAGCGCGGCTACAG, omvendt: CTTAATGTCACGCACGATTTCC. Ifølge producentens instruktioner, miRNA fra væv og celler blev ekstraheret under anvendelse af Mirvana miRNA isolation kit (Life Technology, Carlsbad, CA), og ekspressionsniveauerne af miRNA-302a blev detekteret ved TaqMan miRNA assays (Life teknologi, Carlsbad, CA) ved hjælp U6 lille nukleare RNA som en intern kontrol.

Vector konstruktion, lentivirus produktion, og stabil transfektion

den modne HSA-miRNA-302a sekvens blev syntetiseret og introduceret i PLKO.3G vektor at producere PLKO.3G-mIR-302a. Luciferase-3 ‘utranslaterede region (UTR) reporter vektor blev genereret gennem subkloning

AKT

3’UTR, som bærer et formodet miRNA-302a-bindingssted i vektor MT01. Alle konstruerede vektorer blev bekræftet ved sekventering. PLKO.3G-MIR-302a blandet med psPAX2 og PMD2-G blev transficeret i HEK293T celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 reagens (Life Technologies, Carlsbad, CA) ifølge fabrikantens protokol. Otteogfyrre timer senere, lentivirus blev høstet og anvendt til at inficere HCT8 og HCT116-celler. Dernæst blev cellerne sorteres ved flowcytometri (Beckman Coulter, Brea, CA) til at etablere stabile cellelinier konstitutivt udtrykker miRNA-302a (HCT8-302a og HCT116-302a celler).

luciferaseassays

Otteogfyrre timer efter transfektion blev celler lyseret under anvendelse af 50 pi af passiv lysebuffer. Dernæst blev en dual-luciferase-assay udført som anvist af producenten (Promega, Madison, WI). Forholdet mellem ildflue at Renilla luciferaseaktivitet blev anvendt til at udtrykke luciferaseaktiviteter. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt. Data repræsenteret som middelværdi ± standardafvigelse (SD).

Protein høst og western blot

I alt proteiner blev høstet ved hjælp af CelLytic ekstraktionssæt (Roche, Basel, Schweiz), der indeholder proteasehæmmere og derefter kvantificeret under anvendelse af BCA Protein Assay Reagent kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) ifølge producentens instruktioner. Efter adskillelse proteiner under anvendelse af natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese blev protein overført til polyvinyliden fluorid membraner og derefter blokeret i 5% fedtfri mælk. Under anvendelse af de primære antistoffer og anti-kanin koblet til peberrodsperoxidase (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) som det sekundære antistof blev målproteiner probet og derefter visualiseret ved anvendelse af ECL Plus Western Blotting System (Thermo Fisher Scientific , Waltham, MA). Blottene blev strippet og probet med α-β-actin-antistof for at bekræfte ækvivalent belastning. De primære antistoffer omfattede følgende: AKT (1:1000), GSK3p (1:500), cyklin D1 (1:1000), PI3K (1:1000), PTEN (1:500) (Cell Signaling Technology, Boston, MA ) og β-actin (1:2000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX).

celledeling og cellecyklus analyser

CCK-8 og Edu-analyser blev udført for at afsløre celledeling . Kort fortalt blev CCK-8-assays udført som følger: celler blev podet i en 96-brønds plade ved en koncentration på 1 x 10

4 celler /brønd. Efter adhærens, blev cellerne dyrket i frisk medium blandet med CCK-8 (10:01) (Dojindo, Shanghai, Kina) i 2 timer, før absorbansen blev målt med en mikropladelæser ved 450 nm. For edu assays blev celler inkuberet i edu opløsning (1:5000) i 2 timer, derefter blev høstet og farvet under anvendelse af Cell-Light edu Apollo 643 In vitro Flowcytometri Kit (Ribobio, Guangzhou, Kina), i henhold til producentens anvisninger . Cellerne blev derefter analyseret ved flowcytometri

En celle cyklus assay blev også udført ved anvendelse af flowcytometri:. Kort fortalt blev cellerne fikseret med 75% kold ethanol natten over og derefter vasket med phosphatbufret saltvand. Dernæst blev propidiumiodid (50 ug /ml) tilsat til cellerne til DNA-farvning før flowcytometrianalyse.

Kolonidannelse assay

isolerede celler blev podet i 60 mm plader ved en koncentration på 500 celler /brønd og derefter inkuberet i 5% CO

2 ved 37 ° C. Tyve dage senere blev cellerne farvet med 0,5% krystalviolet i 30 minutter. Colony numre i hver plade blev talt ved hjælp af et omvendt mikroskop.

In vivo

tumorgenicitet

PLKO.3G-Scr-transfekterede HCT8 celler (HCT-8-Scr celler ) og HCT116-302a celler blev injiceret subkutant i enten bageste flanke af samme 4-6 uger gammel mand nøgen mus. Tumorvolumen blev beregnet og tumorvægt blev målt efter aflivning på dag 40. Tumorer blev derefter opdelt i to dele, hver del fikseret med 10% formalin eller konserveret i -80 ° C. Forsøgene dyr blev udført med godkendelse af Animal Studies etiske komité for General Hospital Folkets Befrielseshær.

Immunhistokemi

Immunhistokemi (IHC) farvning af paraffinindlejrede prøver blev udført som tidligere beskrevet [12]. Kort fortalt, kanin-anti-AKT-antistof og anti-muse /kanin peberrodsperoxidase-mærket antistof (Santa Cruz Biotechnology Co., Ltd, Shanghai, Kina) blev anvendt som den primære og det andet antistof, henholdsvis.

Statistiske analyser

forskellen mellem kontinuerlige variabler blev analyseret ved hjælp af t-test eller analyse af varians. Tosidet P-værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS-version 20.0 (IBM Corporation, NY).

Resultater

miRNA-302a udtryk undertrykkes i tyktarmskræft væv

Tyktarmskræft væv blev erhvervet fra i alt 44 mandlige patienter med en gennemsnitsalder på 67 år (range, 49 til 77 år) med nyligt diagnosticeret, patologisk bekræftet tyktarmskræft. Alle patienter havde fået kirurgisk resektion. Patologisk bekræftede normale colon væv blev erhvervet fra 10 mandlige patienter med blærekræft, som havde fået radikal cystektomi.

Vi har detekteret miRNA-302a ekspressionsniveauerne i 44 kolon væv og 10 normale colon væv og fundet, at sammenlignet med normal colon væv, tyktarmskræft væv udtrykte lavere niveauer af miRNA-302a (fig. 1A). Endvidere har vi analyseret forholdet mellem miRNA-302a niveauer og klinisk-patologiske træk hos patienter med coloncancer. Der var ingen signifikant sammenhæng observeret mellem miRNA-302a niveauer og alder eller klinisk fase (data ikke vist).

(A) miRNA-302a-ekspression nedreguleret i tyktarmskræft væv sammenlignet med den normale colon væv. blev påvist (B) Lave niveauer af miRNA-302a udtryk i fire humane coloncancer-cellelinjer, HCT8, HCT116, HT29, og Caco2. (C) Høje niveauer af miRNA-302a udtryk blev fundet i HCT8 og HCT116 kolon kræftceller stabilt udtrykker miRNA-302a (* P 0,05)

Overekspression af miRNA-302a hæmmer tyktarmskræft cellevækst. in vitro og in vivo

for at undersøge funktionen af ​​miRNA-302a i tyktarmskræft, målt vi udtryk for miRNA-302a i fire humane tyktarmskræft cellelinier (HCT8, HCT116, HT29, og Caco2) ved kvantitativ real-time PCR. Som vist i fig. 1B, der var lav ekspression af miRNA-302a i alle fire cellelinjer. Fordi vi spekuleret på, at overekspression af miRNA-302a kan inhibere coloncancer cellevækst, vi stabilt overudtrykt miRNA-302a i HCT8 og HCT116-celler (betegnet som HCT8-302a og HCT116-302a celler), hvilket blev bekræftet ved kvantitativ revers-transkriptase (QRT ) -PCR (fig. 1C).

De CCK-8, EDU og kolonidannende analyser blev udført for at undersøge, om miRNA-302a overekspression påvirket tyktarmskræft celledeling

in vitro

. Som vist i fig. 2, var der en signifikant lavere (P 0,05) vækstrate i HCT8-302a og HCT116-302a celler sammenlignet med kontrollerne. Flowcytometrisk analyser viste, at de procentdele af Edu-positive celler i både HCT8-302a og HCT116-302a celler var lavere end i kontrollerne. Desuden sammenlignes med kontrollerne, både HCT8-302a og HCT116-302a celler udviklet færre kolonier på det 20. og 15. dage. Derfor

in vitro

eksperimenter viste, at miRNA-302a udøvede en suppressiv rolle i tyktarmskræft celleproliferation.

CCK-8 assay blev udført for at måle proliferation i (A) HCT8 og (B) HCT116 celler. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± standardafvigelse af den optiske densitet (OD) værdi detekteret ved 450 nm fra tre uafhængige forsøg. Celleproliferation blev påvist i (C) HCT8 og (D) HCT116 celler under anvendelse edu assay analyseres ved flowcytometri. (E, F) kolonidannelse analyser angivet færre kolonier i miRNA-302a overekspression HCT8 celler. (* P 0,05).

For yderligere at validere vores observationer

in vivo

blev HCT8-Scr celler og HCT8-302a celler sprøjtes ind i venstre og højre bageste flanke af nøgen mus hhv. Tumorvolumener blev målt ved anvendelse skydelære på forskellige tidspunkter efter inokulering, og tumorvægte blev målt efter aflivning. Både volumen og masse var især lavere i HCT8-302a tumorer end i HCT8-Scr tumorer (P 0,05;. Figur 3). Tilsammen indlysende celleproliferation inhibering blev observeret efter overekspression af miRNA-302a i colon cancerceller.

HCT8-GFP-celler og HCT8-302a celler blev injiceret i venstre og højre bageste flanke hos nøgne mus, henholdsvis ( A, B). Tumoren volumen (C) og masse (D) i HCT8-302a gruppen var især lavere end i HCT8-GFP-gruppe. (* P 0,05).

Overekspression af miRNA-302a inducerer cellecyklus arrest i kolon kræftceller

Nu hvor væksthæmning blev observeret i tyktarmen kræftceller, vi udførte cellecyklus analyse for at undersøge, om overekspression af miRNA-302a resulterede i cellecyklus ændringer. Som vist i fig. 4, er andelen af ​​celler i G1-fasen steg markant i HCT8-302a celler, mens andelen af ​​celler i S-fase var betydelig mindre end i kontrolgruppen. Analoge resultater blev observeret i HCT16-302a celler, hvilket tyder på, at miRNA-302a effektivt inducerer G1 /s cellecyklus arrest i colon cancerceller.

Andelen af ​​celler i G1-fasen steget betydeligt i HCT8-302a celler ( A, C) og HCT116-302a celler (B, D) sammenlignet med kontroller, mens andelen af ​​celler i S-fase var betydelig mindre end kontrollerne. (* P 0,05).

miRNA-302a undertrykker AKT udtryk ved direkte målrette sin 3’UTR

For at opdage de molekylære mekanismer, som miRNA-302a udøver sine posttranskriptionel regulerende funktioner vi brugte bioinformatik algoritmer (https://www.targetscan.org) for at søge mulige målgener, og fandt, at 3’UTR af

AKT

mRNA huser en bevaret bindingssted for miRNA-302a. Dernæst undersøgte vi udtryk for AKT på mRNA og protein niveau i HCT8-302a og HCT116-302a celler og kontroller. Som vist i fig. 5A og 6, sammenlignet med kontroller, AKT udtryk faldt markant i HCT8-302a og HCT116-302a celler, på både mRNA og protein niveau. Desuden AKT udtryk i HCT8-302a tumorer var signifikant lavere end i HCT8-Scr tumorer, som bestemt ved real-time PCR og IHC-farvning (fig. 5B, C). Disse resultater tyder på, at AKT udtryk nedreguleres af miRNA-302a i tyktarmskræft.

AKT

mRNA ekspression blev bemærkelsesværdigt undertrykt i (A) HCT8-302a og HCT116-302a celler og (B ) HCT8-302a tumorer. (C) Immunhistokemi farvning indikeret lavere udtryk for AKT i HCT8-302a tumorer. (D) Relativ luciferaseaktivitet blev især undertrykt i vildtype AKT-3 ‘utranslaterede region (UTR) transficerede celler. (E) Skematisk afbildning af luciferase reporter, der har transporteret vildtype eller mutant

AKT

3 ‘UTR. (* P 0,05).

Western blot-analyser viste nedreguleret AKT og cyclin D1 niveauet, og opreguleret GSK3p niveauer i miRNA-302a overudtrykkende HCT8 celler. PTEN og PI3K niveauer blev ikke påvirket.

For at teste, om miRNA-302a regulerer

AKT

ved direkte binding til dets 3’UTR, en luciferase reporter vektor indeholdende det humane

AKT

3’UTR, som bar vildtype-miRNA-302a bindende sekvens blev sub klonet. En luciferase vektor, der bærer det muterede 7-bp region komplementær til 5’frø region af miRNA-302a blev genereret som kontrol reporter (Fig. 5E). Sammenlignet med kontrolgruppen, blev den relative luciferaseaktivitet undertrykkes med 36% (P 0,05) i vildtype

AKT

3’UTR transficerede celler (figur 5D.). Derfor miRNA-302a hæmmer tyktarmskræft celler via direkte rettet mod

AKT

.

miRNA-302a induceret cellecyklus ændringer i tyktarmskræft celler ved at hæmme AKT-GSK3p-cyclin D1 vej

for yderligere at vurdere effekten af ​​miRNA-302a på AKT signalvej, opdaget vi udtryk for opstrøms (PI3K og PTEN) og nedstrøms (GSK3p og cyklin D1) AKT effektorer ved western blot. Sammenlignet med de tilsvarende kontrol celler, GSK3p niveauer var især forhøjet, mens cyklin D1 især blev reduceret i miRNA-302a transficerede HCT8 andHCT116 celler. Imidlertid ekspression af to store opstrøms effektorer af Akt, PI3K og PTEN, blev ikke påvirket af miRNA-302a transfektion (fig. 6). Givet den kritiske rolle af AKT-GSK3p-cyclin D1 signalvejen i cellecyklus overgang, vores resultater tyder på, at miRNA-302a kan inducere G1 /S standsning af cellecyklus i colon cancerceller ved at hæmme AKT-GSK3p-cyclin D1 pathway, hvorved undertrykke tyktarmskræft celleproliferation.

diskussion

i denne undersøgelse har vi observeret, at miRNA-302a blev nedreguleret i tyktarmskræft væv. Overekspression af miRNA-302a induceret G1 /S anholdelse i colon cancerceller, og bemærkelsesværdigt undertrykt tyktarmskræft celledeling

in vitro

in vivo

. Desuden

AKT

blev afsløret som en direkte og funktionel målgen af ​​miRNA-302a.

Gennem det seneste årti, de fleste forskning med miRNA-302 har fokuseret på sin rolle i hESCs, som er karakteriseret ved selv-fornyelse og pluripotens. Undersøgelser analysere miRNA-302 funktion i carcinogenese er begrænsede og usammenhængende. Lin et al. fandt, at miRNA-302 kunne inhibere tumorigenicitet og inducere apoptose i human brystcancer MCF7-celler, embryoniske teratocarcinomaceller Tera-2-celler, og hepatocellulær carcinoma HepG2-celler [13]. Tilsvarende blev celleproliferation undertrykt i cervikal cancer Hela og SiHa-celler, samt hepatocellulært carcinom SMMC-7721 celler, via cellecyklusregulering [10], [14]. Men Zhu et al. observeret en omvendt fænomen i kolon kræftceller, hvor overekspression af miRNA-302b førte til øget koloni-dannende evne

in vitro

[11]. Den augmented kolonidannelse evne blev ligeledes valideret i cancer stamceller fra hoved og hals pladecellekræft [15]. For første gang, afslører vi undertrykt miRNA-302a udtryk i tyktarmskræft væv sammenlignet med normale kolon væv. Derfor vi spekulere at miRNA-302a kan spille en vigtig rolle i tyktarmskræft udvikling og progression.

I vores undersøgelse, blev der observeret en hæmmende effekt af miRNA-302a på celledeling i tyktarmskræft HCT8 og HCT116 celler, gennem hindrer G1 til S faseovergang, som anses som en vigtig hændelse under celleproliferation. Efter aftale med tidligere undersøgelser [8], [10], [14], fandt vi også bemærkelsesværdig nedregulering af cyklin D1 i miRNA-302a overekspression kolon kræftceller. Interessant er miRNA-302 forudsagt til at målrette mange cellecyklus regulatorer. For eksempel, Lin et al. påvist, at miRNA-302 samtidigt undertrykt både cyclin E-CDK2 og cyclin D-CDK4 /6 signaleringsveje [13], og dette mål blokering blev reguleret af flere transkriptionelle faktorer, såsom Oct4 og Sox28. Men Card et al. rapporterede, at miRNA-302a fremmet en stigning i S-fase og et fald i G1-fasen i hESCs, selvom cyclin D1 blev også undertrykt [8]. Det er klart, yderligere forskning belyse de nøjagtige mekanismer i miRNA-302 funktion er berettiget.

Vores observationer, at overekspression af miRNA-302a i colon cancerceller induceret cellevækstinhiberingen

in vitro

in vivo

tyder på, at miRNA-302a kan post-transkriptionelt regulere en drejelig gen, som er involveret i celleproliferation. Som en vigtig onkogen,

AKT

påvirker en lang række fysiologiske funktioner, herunder metabolisme, proliferation, overlevelse, angiogenese, migration og invasion [16]. Vores resultater viser, at miRNA-302a undertrykte spredning og tumorgenicitet af tyktarmskræft celler gennem AKT-GSK3p-cyclin D1 vej, og ved direkte binding 3’UTR af

AKT

. Endvidere blev ekspressionen af ​​PI3K og PTEN, der er de vigtigste opstrøms effektorer af Akt og har også vist sig vigtigt i udviklingen coloncancer, ikke påvirket af miRNA-302. Den regulatoriske rolle af miRNA-302 i AKT blev også demonstreret af Cai et al: efter miRNA-302S transfektion i livmoderhalskræft celler, de observerede forhøjede udtryk for cyclinafhængige kinase hæmmere p27KIP1 og p21Cip1, sammen med nedreguleret AKT niveauer [10]. Derfor som et mål af miRNA-302,

AKT

blev især undertrykt og fremkaldte ændringer i mange nedstrøms signalveje.

Vores resultater også give visse fingerpeg med hensyn til miRNA-målrettede kræftbehandling. Tidligere undersøgelser har vist, at nogle specifikke miRNA ofte blev overudtrykt i tumorer, mens de fleste miRNA var.

nedreguleret [17], [18]. Global miRNA undertrykkelse blev fundet at øge carcinogenese i både

in vitro

og

in vivo

modeller [19], der fremhæver pro tumorfremkaldende virkninger efter miRNA tab af funktion. Liang et al. observeret et sensibiliserende rolle af miRNA-302 substitutionsterapi i brystkræftceller for ioniserende stråling [20]. En anden nylig undersøgelse rapporteret, at viral levering af lad-7 miRNA kunne inhibere tumorvækst i en mus lungeadenocarcinom model [21]. Ligeledes vores resultater valideret hæmmende effekt af miRNA-302a udskiftning i tyktarmen kræftceller. Tilsammen disse undersøgelser tyder på, at overekspression af selv en enkelt miRNA i cancerceller kan give betydelige terapeutiske fordele.

Sammenfattende vores undersøgelse viser, at miRNA-302a er afgørende for tyktarmskræft cellevækst ved at regulere G1-S faseovergang. MiRNA-302a udtryk undertrykkes i tyktarmskræft væv. Derudover gennem direkte binding til sin 3’UTR, miRNA-302a inhiberer

AKT

udtryk, hvilket resulterer i efterfølgende ændringer i AKT-GSK3p-cyclin D1 veje. Selv om det er klart, at miRNA-302a deltager i tyktarmskræft, er yderligere undersøgelser nødvendige for at forklare de præcise mekanismer bag sin rolle i tyktarmskræft progression, og dermed bestemme dens potentielle værdi som biomarkør og /eller et terapeutisk mål.