PLoS ONE: WT1 Fremmer Cell Proliferation i ikke-småcellet lungekræft cellelinier gennem opregulering Cyclin D1 og p-pRb In vitro og in Vivo

Abstrakt

Wilms ‘tumor suppressor gen (WT1) er blevet identificeret som et onkogen i mange maligne sygdomme såsom leukæmi, brystcancer, mesotheliom og lungekræft. Men fortsat uklart, hvilken rolle WT1 i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) carcinogenese. I denne undersøgelse, vi sammenlignet WT1 mRNA-niveauer i NSCLC væv med parret tilsvarende tilstødende væv og identificeret signifikant højere ekspression i NSCLC prøver. Cell spredning af tre NSCLC cellelinjer positivt korreleret med WT1 udtryk; desuden blev disse sammenslutninger identificeret i begge cellelinier og en xenotransplantat musemodel. Endvidere har vi vist, at opregulering af cyclin D1 og phosphoryleret retinoblastoma protein (p-pRb) blev mekanisk relateret til WT1 accelererende celler til S-fase. Afslutningsvis vores resultater viste, at WT1 er et onkogen og fremmer NSCLC celledeling ved opregulering Cyclin D1 og p-pRb udtryk

Henvisning:. Xu C, Wu C, Xia Y, Zhong Z, Liu X Xu J, et al. (2013) WT1 Fremmer Cell Proliferation i ikke-småcellet lungekræft cellelinier gennem opregulering Cyclin D1 og p-pRb In vitro og in vivo. PLoS ONE 8 (8): e68837. doi: 10,1371 /journal.pone.0068837

Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: December 28, 2012; Accepteret: 4 juni 2013; Udgivet: 1. august, 2013 |

Copyright: © 2013 Xu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af National Natural Science Foundation of China [81170158] (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft fortsætter med at være et stort problem for folkesundheden i både mænd og kvinder, det er i øjeblikket kræft type med den højeste dødelighed i hele verden. Forekomsten er steget hurtigt på grund af omfattende tobaksrygning [1] – [3], og i Kina har der været en stigning 26,9% hos mænd og 38,4% hos kvinder over de seneste fem år [4]. Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) indeholder flere histologiske undergrupper, adenokarcinom, planocellulært og store celle karcinom, der omfatter 80-85% af den samlede forekomst, mens de resterende tilfælde omfatter mere tydelig gruppe af små-cellet lungekræft ( SCLC) [2], [5] – [7]. I denne undersøgelse har vi fokus på den rolle, WT1 i udviklingen og carcinogenese af NSCLC.

Wilms ‘tumor genet (WT1), som er placeret på 11p13q, koder en 52-54 kDa protein, der indeholder fire zink finger transskriptionelle faktorer og blev først identificeret som et tumorsuppressorgen i nefroblastom eller Wilms ‘tumor, en pædiatrisk nyrekræft [8], [9]. Overekspression af dette gen blev også opdaget i flere leukæmier og faste tumorer, som brystkræft, lungekræft og mesotheliom, og det blev antaget, at dette gen spiller en onkogen rolle [10], [11]. Oji Y et al foreslået, at WT1 spiller en vigtig rolle i væksten af ​​normale lungeceller; overekspression af WT1 forstyrre væksten og differentieringen af ​​normale lungeceller og ifølge deres resultater, føre til lungekræft [11]. WT1 har vist sig at spille en rolle i reguleringen af ​​celledeling og apoptose i mange biologiske og patologiske mekanismer. For nylig er det blevet undersøgt som et potentielt mål for immunterapi i flere cancertyper, herunder NSCLC og mesotheliom [12].

Signal transducere og aktivatorer af transkription 3 (STAT3) er blevet rapporteret at være overudtrykt i mange humane maligniteter og aktiveres af forskellige cytokiner og vækstfaktorer i cancerudvikling og progression [13], [14]. Det er blevet påvist, at STAT3 fremmer cancercelleproliferation via opregulering af gener, der koder apoptoseinhibitorer, såsom MCL-1 og Bcl-xL og celle-cyklus regulatorer herunder cycliner D1 /D2, og c-myc [13] – [17 ]. Interessant Rong et al demonstrerede beviser for, at WT1enhanced den transkriptionelle aktivitet af phosphoryleret STAT3 (p-STAT3) fører til synergistisk opregulering af nedstrøms gener, herunder cyclin D1 og Bd-XL, i musefibroblaster, melanom og leverceller samt humane embryoniske nyre celler [18]. Men WT1 er ikke tidligere blevet rapporteret i lungekræft cellelinier.

I denne undersøgelse var det et mål at identificere ekspressionen af ​​WT1-protein i NSCLC prøver sammenlignet med tilstødende væv, undersøge proliferationen fremme funktion af WT1 in vitro og in vivo og identificere dens forhold til p-STAT3 transkriptionel aktivering.

Materialer og metoder

Patienter

NSCLC og tilsvarende tilstødende væv indgår i denne undersøgelse blev opnået fra 85 på hinanden følgende patienter, som havde de novo sygdom og gennemgået kirurgisk resektion. De blev inkluderet fra december 2010 og april 2011, kl First Affiliated Hospital i Nanjing Medical University (Nanjing, Kina). Den korrekte diagnose blev vurderet af en erfaren patolog og iscenesættelsen af ​​NSCLC med en klinisk onkolog i henhold til den internationale sammenslutning for Studiet af lungekræft (IASLC) 7. TNM-klassifikation. Tilstødende væv blev placeret inden for 3 cm fra kanten af ​​tumorvævet.

RT-PCR

RNA blev opnået fra snap-frosne væv og NSCLC cellelinjer under anvendelse af Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA , USA) -metoden efter fremstillingen protokol. RNA-koncentrationer og kvaliteter blev undersøgt af Beckman Coulter DU800 spektrofotometer (Beckman, Brea, CA, USA). cDNA blev syntetiseret med en Primescript ™ RT reagenskit (Takara, Japan). 12 pi total RNA blandet med 8 pi Primescript puffer og 20 pi DEPC-behandlet vand blev inkuberet ved 37 ° C i 15 min, 85 ° C i 5 s og opbevaret ved 4 ° C indtil anvendelse.

QRT -PCR

ABI Prism7500 Sequence Detector System (ABI, USA) blev anvendt til at bestemme den relative niveau af mRNA i tumorvæv og tilstødende væv. Kvantitativ real-time polymerasekædereaktion (QRT-PCR) analyse for WT1 og β-actin blev udført med SYBR® Premix ExTaq ™ (Takara, Japan) ifølge producentens instruktioner. PCR blev udført under anvendelse af 10 pi 2 × Premix puffer, 0,5 pi af hver 5 ‘og 3’ primer og 1 pi prøver eller destilleret vand til et slutvolumen på 20 pi. Hvert hætteglas blev denatureret ved 95 ° C i 1 min. denatureret ved 95 ° C i 15 sekunder, anneales ved 60 ° C i 15 sekunder og forlænget ved 72 ° C i 30 sek anvendelse af følgende primere: WT1 fremadrettet primer, 5’GCTATTCGCAATCAGGGTTACAG3 ‘; WT1 revers primer, 5’TGGGATCCTCATGCTTGAATG3 ‘. β-actin forward primer, 5’CCCAGCACAATGAAGATCAAGATCAT3 ‘; p-actin reverse primer: 5’ATCTGCTGGAAGGTGGACAGCGA3 ‘; ved afslutningen af ​​udvidelsen fase blev fluorescens detektion udføres. For at skelne specifik fra ikke-specifikke cDNA produkter, blev en smeltende kurve opnået ved slutningen af ​​hver kørsel.

Cell Culture

A549, H1299, H1650 og 293T cellelinjer (ATCC) blev anvendt til foreliggende undersøgelse. A549, H1299 og H1650 blev dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), mens 293T blev dyrket i DMEM høj glucose medium suppleret med 10% føtalt bovint serum. Alle celler blev holdt i en befugtet 37 ° C inkubator med 5% CO

2.

lentivirus Produktion og transduktion

WT1A (-17aa-KTS isoform) genet blev syntetiseret (indkøbt fra genscript, Piscataway, NJ) med restriktiv fordøjelse ved hjælp Mlu i og subklonet PLV-GFP plasmid (gave fra D. Beicheng Sun, University of Nanjing Medical University, Kina), og navngivet PLV-GFP-WT1. For at generere plasmid udtrykker WT1-shRNA blev dobbeltstrengede oligonukleotider klonet ind pLL3.7 vektor (gave fra D. Yun Chen, University of Nanjing Medical University, Kina) og navngivet pLL3.7-WT1-shRNA. Sekvenserne af WT1-shRNA anvendte aac TCAGGGTTACAGCACGGTC ttcaagaga GACCGTGCTGTAACCCTGA tttttt c. De store bogstaver repræsenterer WT1 specifik sekvens og små bogstaver repræsenterer hårnål sekvenser. Rekombinant lentivirus blev genereret fra 293T-celler under anvendelse calciumphosphatpræcipitation. A549 blev H1299, H1650 transficeret med lentivirus hjælp polybren (8 ug /ml). Repræsentative billeder af vildtype- og transficerede celler er vist i figur S1.

Western-blotting assay

Proteiner blev ekstraheret fra dyrkede celler og mus væv, kvantificeret ved anvendelse af et protein assay (BCA-metoden, Beyotime, Kina). Proteiner blev fraktioneret ved SDS-PAGE, overført til PVDF-membran, blokeret i 4% tørmælk ved stuetemperatur i 1 time og immunfarvet med primære antistoffer ved 4 ° C natten over under anvendelse af anti-WT1 (1:1000, 6F-H2, Millipore, USA), anti-STAT3 /p-STAT3 (1:2000, Cell Signalling Technology, Beverly, MA, USA), anti-cyclin D1 (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Delaware Avenue, CA, USA), anti-p -pRb (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), anti-caspase3 (1:3000, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-Bcl-2L (1:1000, Abcam, Cambridge, MA , USA) og anti-GAPDH (1:1000, Kangchen, Kina). Resultaterne blev visualiseret via et kemiluminescerende påvisningssystem (Pierce ECL Substrat Western blot-detektionssystemet, Thermo, Pittsburgh, PA, USA) og eksponeret i Molecular Imager ChemiDoc XRS System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Cell Counting Kit-8 (CCK-8) Assay

celler blev podet i 96-brønds plader (6,0 x 10

3 celler /brønd). Cellelevedygtighed blev vurderet ved CCK-8 assay (Beyotime Institute of Biotechnology, Kina). Absorbansen af ​​hver brønd blev aflæst på et spektrofotometer (Thermo, Pittsburgh, PA, USA) ved 450 nm (A450). Tre uafhængige forsøg blev udført i fem eksemplarer.

flowcytometrisk analyse

blev taget Flowcytometrisk analyse til påvisning af apoptose og cellecyklus status. Cellerne blev høstet, vasket to gange og resuspenderet i 100 pi PBS indeholdende 3 pi annexin V og 3 pi PI (KeyGen, Kina) i overensstemmelse med fabrikantens anbefalinger. indsamling og analyse af den apoptose-data blev udført ved flowcytometri facilitet (BD Biosciences, San Jose, CA).

Cellecyklusanalyse blev vurderet ved DNA-indhold påvist under anvendelse af flowcytometri facilitet (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Efter opsamlet ved trypsinering blev cellerne suspenderet med 70% ethanol og opbevaret ved 4 ° C i 30 minutter. Filtreret gennem masken, og DNA-indholdet af de farvede kerner blev analyseret. Alle forsøg blev udført tre gange for at sikre resultater fakticitet.

Tumorigenicitet i nøgne mus

For at undersøge virkningerne af WT1 på tumorvækst in vivo, vi etablerede xenograft model i 4-uge- gamle Balb /c

nu /nu mus. Vi ansat 90 Balb /c

nu /nu-mus (købt fra model dyr forskningscenter i Nanjing University i Kina) i denne undersøgelse og delte dem i 5 grupper tilfældigt (n = 6 pr gruppe) for hver cellelinje (A549 /H1299 /H1650). Alle celler blev tripsinized og resuspenderet med 100 pi PBS (indeholdende 50 pi Matrigel) henholdsvis og subkutant injiceret i armhulen af ​​hver nøgen mus (5 x 10

6 celler per mus). En uge efter injektion blev tumorer dimensioner målt hver 4. dag og efter en måned blev alle mus aflivet, og tumorerne blev opnået (figur S2). Volumen blev beregnet ved hjælp af følgende formel: volumen = længde × bredde

2 × 0.5

Immunhistokemi

Væv blev fikseret i 4% paraformaldehyd og skåret fra paraffin blok til 5 um tykkelse.. Efter afvoksning med xylen og rehydratisering med en gradueret række af ethanol, blev objektglassene opvarmes i autoklav i tre minutter under anvendelse af citratpuffer (pH 6,0) og inkuberet med primært antistof WT1 (1:100, 6F-H2, Millipore, USA), p-STAT3 (1:400, Cell Signalling Technology, Beverly, MA, USA), cyclin D1 (01:50, Santa Cruz Biotechnology, Delaware Avenue, CA, USA) og p-pRb (1:100, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) ved 4 ° C natten over. Blokering serum eller antistof fortyndingsbuffer blev fremstillet som negative kontroller. De primære antistoffer anvendte var alle de samme som for Western blot-analyse. Fotografier blev taget af microcope (Nikon, ECLIPSE 50i) og software NIS-Elements v4.0. Gennemsnitlige værdier af integrerede optiske densitet (IOD) blev opnået fra fem tilfældige felter pr dias ved hjælp af Image-Pro Plus software (v5.0). Hver data blev fundet tre gange i hvert fald.

Statistisk analyse

Data blev præsenteret som gennemsnit ± SD baseret på tre adskilte eksperimenter. Den t-test, ANOVA og tosidet Fisher eksakt test blev anvendt til at evaluere den statistiske signifikans af forskelle i alle relevante forsøg. En værdi på P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikans, og P 0,001 blev anset stærkt signifikant. Alle statistiske analyser blev analyseret ved hjælp af SPSS-programmet v17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA).

Resultater

1. WT1 mRNA niveauer blev overudtrykt i NSCLC Prøver

Vi undersøgte 85 par NSCLC og tilsvarende tilstødende prøver ved hjælp af immunhistokemi og real-time PCR. De kliniske karakteristika for patienterne er vist i tabel S1. WT1-ekspression i tumorer var signifikant højere i forhold til tilstødende væv. Repræsentative billeder er vist i figur 1A. Statistisk analyse af IOD værdier på 85 objektglas farvet med WT1 er vist i histogrammet i figur 1B (* p 0,05). Som illustreret i figur 1C, blev mRNA-niveauet af WT1 signifikant overudtrykt i NSCLC prøver (** p 0,001). Derudover vores resultater viste, at WT1 mRNA-niveauet var forbundet både med tumor versus normal og med tumor stadium, se tabel S1 (** p 0,001). Tilsammen disse resultater er i konkordans med tidligere resultater indikerer, at højere udtryk for WT1 er forbundet med NSCLC.

A, immunhistokemisk farvning af WT1 i tumor (til venstre) og tilstødende (højre) prøver. B, Gennemsnitlig værdi af integrerede optiske densitet (IOD) blev vurderet ved at analysere fem felter pr dias og registreres i histogrammet. C, Real-time PCR-analyse af WT1 mRNA niveau i tumor og tilstødende væv i forhold til p-actin. Data er repræsenteret som middelværdi ± SD.

* P 0,05,

** P. 0,001

2. WT1 Expression fremmet levedygtighed NSCLC cellelinier in vitro

For at finde et WT1-shRNA der effektivt kunne nedregulere ekspressionen af ​​WT1 i NSCLC cellelinjer, tre kandidat WT1-shRNA (tabel S2) blev syntetiseret og testet ved hjælp Western-blot-analyse og real-time PCR. Vi fandt, at WT1-shRNA3repressed ekspressionen af ​​WT1 i A549 /H1299 /H1650 med maksimal effektivitet (figur 2A). Derefter detekteres vi ekspressionen af ​​WT1 i alle cellelinier for at bekræfte lentivirus ved Western-blot-analyse og real-time PCR. Vi fandt, at ekspression af WT1 i A549 /H1299 /H1650 transduceret med pLL3.7-WT1-shRNA var meget lavere end i kontrollerne; samtidigt, udtryk for WT1 i A549 /H1299 /H1650 transduceret med PLV-GFP-WT1 var meget højere i forhold til kontrollerne. Vi fandt også, at de to vektorer (pLL3.7-WT1 og PLV-GFP) havde ingen virkning på ekspressionen af ​​WT1 (figur 2A og figur S3). Dernæst gennemførte vi CCK-8 assay til at teste levedygtighed Resultaterne indikerede, at overekspression af WT1 forøget cellelevedygtighed, hvorimod nedregulering af WT1 udviste den modsatte effekt og uoverensstemmelsen var mere og mere tydeligt over tid (figur 2B). Derfor er disse resultater viste, at WT1 fremmes NSCLC cellelevedygtighed in vitro.

A WT1 ekspression af NSCLC vildtypeceller og NSCLC-celler transficeret ved lentivirus indeholdende pLL3.7 (GFP1), PLV-GFP (GFP2), pLL3.7-WT1-shRNA (WT1-shRNA1, WT1-shRNA2, WT1-shRNA3) og PLV-GFP-WT1 (WT1) ved western-blot. B, blev levedygtighed NSCLC-celler vurderet ved CCK-8-assay: overekspression af WT1 fremmer cellelevedygtigheden mens inhibering af WT1-ekspression reducerer effekten. Data er repræsenteret som middelværdi ± SD.

* P 0,05,

** P. 0,001

3. WT1 Expression Accelereret S-fasen Indtastning af Cell Cycle af Up-regulerende cyclin D1 og p-pRb Protein

For at undersøge den mekanisme, hvormed WT1 forfremmet NSCLC celleproliferation, vi studerede virkningerne af WT1 udtryk på cellecyklus via flowcytometrisk analyse. Resultaterne viste, at procentdelen af ​​S-fasen i WT1 overekspression gruppe var højere i sammenligning med kontrollen, hvorimod WT1 knockdown gruppe var lavere (figur 3A 3B). Dette resultat antydede, at WT1 potentielt fremmes NSCLC-celleproliferation ved at fremskynde optagelsen af ​​cellecyklus S-fase.

A, Cellecyklusanalyse af NSCLC vildtypeceller og transduceret med WT1-shRNA eller WT1. Vildtypeceller blev anvendt som kontrol. B, blev S-fase /G1-fasen analyse beregnes og registreres i histogrammer. C, Cell apoptose analyse af NSCLC vildtypeceller og dem transduceret med WT1-shRNA eller WT1. Vildtypeceller blev anvendt som kontrol. D, Western-blotting-analyse af ekspressionen af ​​WT1, STAT3, p-STAT3 (S727 og Y705), cyclin D1, p-pRb, caspase3, Bcl-2L i angivne NSCLC celler. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. Data er repræsenteret som middelværdi ± SD.

* P 0,05,

** P. 0,001

For yderligere at belyse den mekanisme, vi har registreret udtryk for cyclin D1 og p-pRb fordi denne aktivitet er nødvendig for cellecyklus G1 /S overgang ved Western-blot. Som illustreret i figur 3D, cyklin D1 og p-pRb-proteinet blev både forøget i WT1 overudtrykker celler og reduceret i WT1 nedreguleret celler. Baseret på WT1, forøget transkriptionel aktivitet af p-STAT3, og andre resultater af Rong et al, vi har registreret aktivitet STAT3 og p-STAT3 (S727 og Y705) og fandt, at phosphorylering af både S727 og Y705 blev overudtrykt i alle cellelinjer . Men til dato er der ingen rapporter, som har undersøgt, om WT1 er forbundet med phosphorylering af STAT3. Desuden har vi opdaget også apoptose og fandt ikke nogen effekt af WT1 (figur 3C 3D). Tilsammen vores resultater tyder på, at WT1 accelererer indtastning af cellecyklus S-fase ved opregulering Cyclin D1 og p-pRb proteinekspression.

4. WT1 Expression fremmet vækst af tumorxenoplantater in vivo

For at bestemme om WT1 påvirkede NSCLC progression in vivo, vi etableret en xenograft tumor model ved hjælp af Balb /c

nu /nu-mus. Mus blev subkutant injiceret med stabilt PLV-GFP-WT1 og pLL3.7-WT1-shRNA inficerede A549 /H1299 /H1650 celler på et enkelt sted, henholdsvis med tomme plasmid og vildtype WT1 som kontroller. Som illustreret i figur 4A, fandt vi, at der ikke var nogen signifikante forskelle mellem vildtypeceller og celler transduceret med PLV-GFP og pLL3.7-GFP; dette viste, at tumorvækst kurve i cellerne transduceret med PLV-GFP-WT1 den markant var steget i forhold til kontrol, mens tumor vækstkurve i celler transduceret med pLL3.7-WT1-shRNA var signifikant hæmmet. Tumorvæv opnået fra nøgne mus blev præsenteret i skarpt lys (figur 4B venstre) og in vivo fluorescensbillede (figur 4B højre). Betydelige stigninger i tumorvolumen blev fundet, når cellerne blev transduceret med PLV-GFP-WT1 sammenlignet med vildtypeceller; i modsætning hertil tumorvolumen af ​​celler transduceret med pLL3.7-WT1-shRNA var faldet betydeligt. Derudover detekteres vi ekspressionen af ​​WT1-protein i tumorer opnået fra nøgne mus ved Western-blot-analyse. Vi fandt, at det var der ingen ændring i forhold til celler in vitro (figur 2A højre og figur 4C). Disse resultater antyder, at WT1 fremmer væksten af ​​subkutant implantat tumor in vivo.

A, Tumorvolumen af ​​Balb /c

nu /nu nøgne mus 31 dage efter NSCLC celler injektion. B, Tumor væv fra nøgne mus præsenteret i skarpt lys (til venstre) og in vivo fluorescens billede system. C, WT1-ekspression i tumorvæv fra nøgne mus ved Western-blotting-analyse. Data er repræsenteret som middelværdi ± SD.

* P 0,05,

** P. 0,001

5. WT1 påvirkede ekspression af cyclin D1 og p-pRb in vivo

In vivo vi yderligere valideret vores in vitro resultater, hvor WT1 accelererede S-fase indtastning af cellecyklus ved opregulering Cyclin D1 og p-pRb . Vi undersøgte ekspressionen af ​​STAT3, p-STAT3 (S727), cyklin D1 og p-pRb i tumorer opnået fra nøgne mus via immunhistokemisk farvning og Western-blot-analyse. Som vist i figur 5A og 5B, cyclin D1 og p-pRb-niveauer blev forøget i WT1-overudtrykkende væv sammenlignet med WT1 nedreguleret væv. I mellemtiden, p-STAT3 (S727) blev overudtrykt i begge væv. Statistisk analyse af IOD værdier af tumorvæv er vist i histogrammet (figur 5A, s 0,05). Sammenfattende indikerer disse resultater, at WT1 fremmer væksten af ​​tumor in vivo og også afhænger af opregulering af ekspressionen af ​​cyclin D1 og p-pRb.

A, Immunhistokemisk farvning af WT1, p-STAT3 (s727) , cyclin D1 og p-pRb i WT1 overudtrykt (WT1) tumorvæv og WT1 nedreguleret (WT1-shRNA) tumorvæv in vivo. Gennemsnitlige værdi af integreret optisk densitet (IOD) blev opnået som beskrevet ovenfor, viste, at ekspressionen af ​​cyclin D1 og p-pRb var signifikant opreguleret. B, Western-blotting-analyse af ekspressionen af ​​WT1, STAT3, p-STAT3 (S727 og Y705), cyclin D1, p-pRb i angivne tumorer. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. Data er repræsenteret som middelværdi ± SD.

* P. 0,05

6. WT1 Expression påvirkede ekspression af cyclin D1 og p-pRb i NSCLC Prøver

Vi evalueres yderligere sammenhængen mellem WT1-ekspression og niveauet af cyclin D1 og p-pRb med 85 paraffin indlejrede humane NSCLC væv dias. To tilfælde med forskellige WT1 ekspressionsniveauer er vist i figur 6: Case1 (stærk positiv) og Situation2 (svagt positive). Niveauet af cyclin D1 og p-pRb blev opreguleret i Case1 sammenlignet med Situation2. Som forventet blev p-STAT3 (S727) stærkt farvet i både Case1 og Situation2. Dette resultat støttes den hypotese, at WT1 kan øge ekspressionen af ​​cyclin D1 og p-pRb og regulere cellecyklussen.

Immunhistokemisk farvning af WT1, p-STAT3 (s727), cyklin D1 og p-pRb i WT1 overekspression (Case 1) tumorvæv og WT1 lav ekspression (sag 2) tumorvæv in vivo. Gennemsnitlige værdi af integreret optisk densitet (IOD) blev opnået som beskrevet ovenfor, viste, at ekspressionen af ​​cyclin D1 og p-pRb var signifikant opreguleret. Data er repræsenteret som middelværdi ± SD.

* P. 0,05

Diskussion

I løbet af de sidste mange årtier, selv om nogle studier har undersøgt den rolle, WT1 i NSCLC, dens funktion er ikke fuldt belyst. I denne undersøgelse fandt vi, at ekspression af WT1 genet og proteinet i NSCLC prøver var markant opreguleret i forhold til tilstødende væv; WT1 fremmet proliferation af NSCLC-celler in vitro og in vivo, og WT1-ekspression påvirkede niveauet af cyclin D1 og p-pRb som accelereret celleproliferation i NSCLC-celler og kliniske prøver. Med alle resultater taget sammen, vi hypotese, at WT1 potentielt spiller en onkogen rolle i at fremme carcinogenese og progression af NSCLC.

WT1 blev oprindeligt identificeret som et tumorsuppressorgen i Wilms tumor, og blev efterfølgende fundet at være overudtrykt i en række faste tumorer [19]. Men forholdet mellem udtryk og carcinogenese af WT1 i NSCLC stadig kontroversielt. Oji et al. foreslog, at WT1 kan forstyrre væksten og differentieringen af ​​normale lungeceller og bidrage til onkogenese for lungekræft [11]. For nylig Hayashi S et al rapporterede, at lav WT1 genekspression i NSCLC-tumorer var en negativ prognostisk tegn og var også forbundet med lymfeknudemetastaser [20]. Endvidere blev det påvist, at WT1 tab induceret senescens og nedsat proliferation af lungecancerceller nedstrøms for onkogene KRAS signaling [21] .STAT3 konstitutivt aktiveret i mange humane tumorer, såsom prostata-, lunge-, hjerne-, bryst- og pancreascancer [13], [15], [22], [23]. Downstream gener herunder cyclin D1, c-myc, og Bd-XL af STAT3, er potentielt opreguleret af phosphoryleret STAT3. Cyclin D1 er en celle-cyklus regulator, der fremmer celler fra G1-fasen til S-fasen, og phosphorylerer pRb protein [24], som er en nuklear phosphoprotein, der regulerer cellevækst i G1-fasen. Hypophosphorylerede pRb på S780 frigiver så E2F fra en inhibitorisk kompleks og gør det muligt at fremme transkriptionen nødvendig for progression i sen G1-fasen og S-fase [24] – [26]. Det er blevet rapporteret, at cyclin D1 og cyclin-afhængig kinase 4 (CDK4) phosphoryleret pRb og at pRb mistet sin evne til at binde til E2F [27]. Når således Cyclin D1 er opreguleret af STAT3 kan phosphorylere pRb og fremmer cellevækst ved at slippe E2F.

Rong et al har rapporteret, at funktionen af ​​WT1 som tumorsuppressor eller onkogen primært afhængig af de aktiviteter af STAT3. Følgelig når STAT3 blev aktiveret, WT1 fungerede som tumorsuppressor, men da STAT3 blev deaktiveret, WT1 fungerede som en onkoprotein [18]. De foreslog også, at WT1 og STAT3 synergistisk fremmet celledeling ved opregulering gener såsom cyclin D1 og Bd-XL. Baseret på disse resultater, vi den hypotese, at WT1 kan virke som et onkogen i NSCLC.

I denne undersøgelse har vi påvist, at WT1 blev overudtrykt i NSCLC væv sammenlignet med tilstødende væv. WT1 udviste en virkning på proliferation af NSCLC-celler in vitro og in vivo: overekspression af WT1 fremmet cellevækst henviser nedregulering inhiberede proliferationen af ​​NSCLC-celler. Vi har detekteret også udtryk for STAT3 i NSCLC prøver og celler, i tråd med Fernandes et al der fundet STAT3 overudtrykt i lungekræft væv [23]. Vores resultater viste, at WT1 accelereret S-fasen entry celle; således vurderede vi cellecyklus regulator gener, såsom cyclin D1 og p-pRb og vi fandt, at ekspression af cyclin D1 og p-pRb blev faktisk opreguleret som vist i figur 3D. Under hensyntagen vores resultater og de tidligere resultater af Rong et al, fandt vi, at WT1 og STAT3 synergistisk fremme væksten af ​​NSCLC celler ved opregulering cellecyklus regulatorer cyclin D1 og p-pRb. Derudover fandt vi, at WT1-ekspression var forbundet både med lymfeknudemetastaser og tumor fase. Dette resultat viser, at WT1-ekspression kan være relevant for tumorinvasion og metastase. Epiteliale til mesenkymale overgang (EMT) betragtes som en vigtig proces for metastaser af carcinoma og formidling af kræftceller fra den primære tumor og migration til forskellige steder af kroppen [28]. Interessant nok kunne WT1 potentielt drive EMT via EMT-relaterede mål som sneglen, Slug og E-cadherin [29] – [31]. Dette vil kræve yderligere forskning for at bestemme funktionen af ​​WT1 i tumor invasion og metastase.

Uventet, vi fandt ikke, at WT1 haft nogen virkning på apoptose af NSCLC celler ifølge flowcytometer assay og også af vestlige -blot assay; dette er forskelligt fra Rong Y et al konstateringer, der demonstrerede WT1 øget ekspression af Bd-XL [18]. Det blev også rapporteret, at WT1 kræves for inhibering af apoptose i brystkræft og rhabdoid cancer ved at reducere Bcl-2 mRNA og protein niveauer [32], [33]; imidlertid andre rapporter indikeret, at WT1 reguleres negativt Bcl-2-promotoren i prostata-cellelinien [34]. Vincent S et al. rapporterede, at de ikke afsløre nogen forskel i respons på WT1 udtømning i NSCLC cellelinjer [21], hvilket var i overensstemmelse med vores resultater. Årsagen til disse forskelle er fortsat ukendt, men yderligere udredning, hvorfor WT1 og STAT3 synergistisk fremme niveauet af cyclin D1, men har ingen effekt på niveauet af Bel-2L i NSCLC, er berettiget. De nyligt identificerede transkriptionel WT1 co-faktorer, såsom BASP1 (hjerne syre-opløseligt protein 1) og WTIP (WT1 interagerende protein) kan deltage i disse forskelle i WT1-medieret transkriptionel regulering af target gener, såsom Bcl-2L [35] – [37].

Som konklusion i denne undersøgelse, fandt vi en signifikant højere WT1 ekspressionsniveau i NSCLC prøver sammenlignet med tilstødende andet væv, vi demonstreret proliferationen fremme funktion af WT1 in vitro og in vivo og vi identificeret sin onkogene rolle i NSCLC via amplifikation af den transkriptionelle aktivitet af p-STAT3 at opregulerer nedstrøms gener, herunder cyclin D1 og hypo-phosphoryleret retinoblastoma protein (p-pRb). Således WT1 potentielt tjene som et terapeutisk mål for behandling af NSCLC.

Støtte oplysninger

figur S1.

billede af NSCLC vildtypeceller og andre transficeret med lentivirus i skarpt lys (øvre) og i grønt lys (lavere). NSCLC vildtypeceller nævnt som kontrol; celler transduceret med pLL3.7 og PLV-GFP benævnt GFP1 og GFP2; celler transduceret med pLL3.7-WT1-shRNA benævnt som WT1-shRNA og transduceres med PLV-GFP-WT1 benævnt som WT1 i figuren

doi:. 10,1371 /journal.pone.0068837.s001

(TIF)

Figur S2. Salg Tumorer opnået fra de nøgne mus. Tumorer opnået fra nøgne mus er alle vist i denne figur. Det skal bemærkes, at vi kun fundet 4 tumorer i H1299-WT1-shRNA gruppe og 5 tumorer i H1650-WT1-shRNA gruppe i den injicerede sted

doi:. 10,1371 /journal.pone.0068837.s002

( TIF)

Figur S3.

WT1 mRNA-ekspression af NSCLC-celler. WT1-ekspression af NSCLC vildtypeceller og NSCLC-celler transficeret med lentivirus indeholdende pLL3.7 (GFP1), PLV-GFP (GFP2), pLL3.7-WT1-shRNA (WT1-shRNA1, WT1-shRNA2, WT1-shRNA3) og PLV-GFP-WT1 (WT1) af Real-time PCR. Data er repræsenteret som middelværdi ± SD. * P 0,05

doi: 10,1371 /journal.pone.0068837.s003

(TIF)

tabel S1..

Forholdet WT1-ekspression og klinisk-patologiske funktioner i NSCLC

doi:. 10,1371 /journal.pone.0068837.s004

(DOC)

tabel S2.

sekvens af WT1-shRNA

doi:. 10,1371 /journal.pone.0068837.s005

(DOC)

Tak

Forfatterne takker alle personer, der frivilligt deltog i undersøgelsen og D. Beicheng Sun og D. Yun Chen (University of Nanjing Medical University, Nanjing, Kina) for deres plasmider.