PLoS ONE: DDX3X inducerer Primær EGFR-TKI Resistance Baseret på intratumor Heterogenitet i Lung cancerceller, der huser EGFR-aktiverende mutationer

Abstrakt

De specifikke mekanismer hvordan lungekræft celler, der huser epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) aktiverende mutationer kan overleve behandling med EGFR-tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er), indtil de til sidst erhverve behandling-modstand genetiske mutationer er uklare . Den fænotypiske mangfoldighed af kræftceller, der skyldes genetiske eller epigenetiske ændringer (intratumor heterogenitet) giver behandlingssvigt og kan skabe tumor evolution gennem darwinistisk udvælgelse. For nylig fandt vi DDX3X som det protein, der fortrinsvis blev udtrykt i murine melanom med kræft stamceller (CSC) -lignende fænotyper ved proteomanalyse. I denne undersøgelse transficerede vi PC9, humane lunge cancerceller, der huser EGFR exon19 deletion, med cDNA kodende DDX3X og fandt, at DDX3X, en ATP-afhængig RNA-helicase, inducerede CSC-lignende fænotyper og epitel-mesenkymale overgang (EMT) ledsaget af tab af følsomhed over for EGFR-TKI. DDX3X ekspression blev associeret med opregulering af Sox2 og forøgelse af cancerceller udviser CSC-lignende fænotyper, såsom forankringsuafhængig proliferation, stærk ekspression af CD44, og aldehyd-dehydrogenase (ALDH). EMT med at skifte fra E-cadherin til N-cadherin blev også lettet af DDX3X. Enten ligand-uafhængig eller ligand-induceret EGFR fosforylering blev hæmmet i lunge kræftceller, der stærkt udtrykte DDX3X. Manglende EGFR signal afhængighed resulterede i resistens over for EGFR-TKI. Desuden fandt vi en lille ikke klæbende delpopulation som stærkt udtrykte DDX3X ledsaget af de samme stamceller celle-lignende egenskaber og EMT i forældrenes PC9 celler. Den unikke subpopulation manglede EGFR-signalering og var meget modstandsdygtig over for EGFR-TKI. Som konklusion indikerer vore data, at DDX3X kan spille en kritisk rolle til induktion fænotypisk diversitet, og at behandling målretning DDX3X kan overvinde primære modstand mod EGFR-TKI følge af intratumor heterogenitet

Henvisning:. Nozaki K, Kagamu H, Shoji S, Igarashi N, Ohtsubo A, Okajima M, et al. (2014) DDX3X inducerer Primær EGFR-TKI Resistance Baseret på intratumor Heterogenitet i Lung cancerceller, der huser EGFR-aktiverende mutationer. PLoS ONE 9 (10): e111019. doi: 10,1371 /journal.pone.0111019

Redaktør: Pier Giorgio Petronini, University of Parma, Italien

Modtaget: Marts 10, 2014 Accepteret: September 26, 2014; Udgivet: 24 Oktober 2014

Copyright: © 2014 Nozaki et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning fra Ministeriet for uddannelse, videnskab og kultur of Japan (# 20.590.915, # 23.591.141, # 24591157, # 26293196), og ved forskningsmidler fra Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. finansieringskilder havde ingen rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.

Konkurrerende interesser:. Denne undersøgelse blev finansieret delvist af Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer

Introduktion

Behandlinger målrettet signal afhængighed forårsaget af onkogen driver mutation har ført til hidtil usete resultater i kliniske omgivelser. Brugen af ​​epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) -tyrosin kinase hæmmere (TKI’er) har forbedret progressionsfri overlevelse i lungekræftpatienter huser aktiverende EGFR-mutationer; det er imidlertid stadig vanskeligt at opnå en kur mod lungekræft, især hos patienter med fremskreden fase sygdom [1], [2]. Den fænotypiske mangfoldighed af kræftceller er baseret på både genetiske og nongenetic faktorer og resulterer i overlevelse af behandlingsresistente celler. Det meste erhvervet resistens afspejler udvælgelsen af ​​cancerceller, der huser stokastiske resistens-genetiske ændringer. Men de mekanismer, hvorigennem kræftceller overlever, indtil erhvervelse af yderligere mutationer er uklare. Sharma et al. viste, at en lille delpopulation af reversibelt drug-tolerante celler fandtes i alle undersøgte kræftceller og at narkotika-tolerante celler opførte sig som mor celler, der giver anledning til resistente celler, der huser yderligere mutationer [3].

DEAD /H (Asp-Glu-Ala-Asp /His) box polypeptid 3, X-bundet (DDX3X) er et medlem af den DEAD-box familie af ATP-afhængige RNA-helicaser og er placeret på X-kromosomet [4]. DEAD-box helicaser har flere funktioner, herunder RNA splejsning, mRNA eksport, transkriptionel og translationel regulering, RNA forfald, ribosom biogenese, og miRNA regulering [5], [6]. Således er DDX3X menes at være involveret i epigenetisk regulering af genekspression. Vores tidligere proteomanalyse identificeret DDX3X som et protein fortrinsvis udtrykkes i oprenset CD133

+ B16 melanomceller, som besad cancer stamceller (CSC) -lignende egenskaber [7], [8]. Selv DDX3X oprindeligt blev rapporteret at undertrykke tumorvækst ved at modulere

p21

WAF /CIP1

genekspression [9], DDX3X har også vist sig at være direkte korreleret med onkogenese [10], [11]. For nylig, hel-exome sekventering identificerede DDX3X som et mål for chauffør genmutationer, der medierer patogene β-catenin signalering i medulloblastom, som støtter CSC teori [12] – [16].

I denne undersøgelse har vi forsøgt at undersøge den rolle, DDX3X i at overdrage EGFR-TKI resistens i lungecancerceller. Vores data foreslog, at DDX3X kan repræsentere en ny terapeutisk mål for at overvinde intratumor heterogenitet i patienter med lungecancer huser EGFR-aktiverende mutationer.

Materialer og metoder

Tumor celler

PC9 celler lung adenocarcinom celler, der huser en EGFR exon 19 deletionsmutation blev tilvejebragt fra Riken Bioresource center og holdt i kultur-medium (CM) indeholdende RPMI 1640 medium suppleret med 10% varmeinaktiveret lipopolysaccharid (LPS) -qualified føtalt kalveserum (FCS), 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer, 1 uM natriumpyruvat, 100 U /ml penicillin, og 100 ug /ml streptomycinsulfat (alle fra Life Technologies, Inc., Tokyo, Japan). HCC4006 lungeadenocarcinom celler, der huser en EGFR exon 19 deletionsmutation blev indkøbt fra American Type Culture Collection og blev dyrket i CM.

Transfektion af PC9 celler med

DDX3X

cDNA

Transfektion af lungecancerceller med

DDX3X

cDNA blev udført ved anvendelse af et Myc-FLAG-mærket åben læseramme (ORF) klon af human DDX3X transcript variant 1 som transfektion-ready DNA (Origene Technologies, Inc., Rockville, MD , USA) ifølge producentens protokol. Eksperimentelle celler blev inkuberet med frisk medium indeholdende G418 (600 ug /ml, Promega, Madison, WI, USA), og mediet blev erstattet med frisk G418-holdigt medium hver 3-4 dage, indtil resistente kolonier blev identificeret.

Knockdown af DDX3X af shRNA

Knockdown af DDX3X blev udført under anvendelse af en shRNA lentiviral (pLKO.1-puro) plasmid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) med følgende DDX3X målsekvensen: 5′-CCGGACGTTCTAAGAGCAGTCGATTCTCGAGAATCGACTGCTCTTAGAACGTTTTTTG. PC9 celler blev udpladet i frisk medium, og hexadimethrinbromid (8 ug /ml) blev tilsat til hver brønd. Cellerne blev cotransficeret med pLKO.1-puro-plasmid plus emballagen vektor ifølge fabrikantens protokol. Mediet blev skiftet ca. 16 timer efter transfektion, og cellerne blev dyrket i yderligere 48-72 timer. Eksperimentelle celler blev inkuberet med frisk medium indeholdende puromycin (2,0 ug /ml), og mediet blev erstattet med frisk puromycin-holdige medium hver 3-4 dage, indtil resistente kolonier blev identificeret. Mindst fem puromycin-resistente kolonier blev udtaget, og hver klon blev udvidet til assayet. Effektiviteten af ​​DDX3X knockdown blev bestemt ved immunblotting.

Monoklonale antistoffer (mAb’er) og flowcytometri

PE-konjugeret anti-CD44 (IM7), anti-E-cadherin (67A4), og anti-vimentin (GF2); fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugeret anti-N-cadherin (8C11) blev indkøbt fra BD Pharmingen (San Diego, CA, USA). Analyse af celleoverflade-fænotyper blev udført ved direkte immunfluorescensfarvning af 0,5-1 x 10

6 celler med de ovennævnte fluorofor-konjugerede mAb’er og derefter behandlet med 1% paraformaldehyd. I hver prøve, blev 1 × 10

4 celler analyseret ved anvendelse af et FACScalibur flow microfluorometer (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, USA). PE-konjugerede underklasse-matchede antistoffer anvendt som isotypekontroller blev også købt hos BD Pharmingen. Prøverne blev analyseret med CellQuest software (BD).

Immunoblotting assay

Celler blev høstet og lyseret i Nonidet P-40 puffer indeholdende en protease-inhibitor-blanding (Sigma). Lige store mængder protein blev underkastet natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) på Mini-PROTEAN TGX Eventuelle kD Præfabrikerede Gels (BioRad, Hercules, CA, USA) og efterfølgende overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore, Billerica, MA, USA). Immunoblots fra tumor cellelysater blev probet med antistoffer mod DDX3X (Sigma), EGFR, phospho-EGFR (Tyr1068), phospho-EGFR (Tyr1173), phospho-EGFR (Tyr845), Akt, phospho-Akt, Erk1 /2, phospho- ERK1 /2, og β-actin (Sigma). Alle antistoffer undtagen anti-DDX3X og anti-β-actin blev købt hos Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA). Sekundære antistoffer bestod af anti-muse-IgG (BioRad) og anti-kanin IgG konjugeret til peberrodsperoxidase (Abcam, Cambridge, MA, USA). Immunreaktive proteinbånd blev visualiseret under anvendelse af et ECL-kit (Pierce). Mindst tre uafhængige forsøg blev udført for alle analyser.

Aldefluor assays

ALDH aktivitet blev påvist under anvendelse af ALDEFLUOR kit (StemCell Technologies Inc., Vancouver, Canada) ifølge producentens instruktioner. Kort beskrevet blev Aldefluor assays udføres ved at suspendere celler i Aldefluor assaybuffer indeholdende 1,5 uM BODIPY-aminoacetaldehyd, en ALDH substrat. Celler blev derefter inkuberet i 30 minutter ved 37 ° C og analyseret med et microfluorometer.

Cell levedygtighed assays

I alt 5 × 10

4 tumorceller blev podet i 24-brønds plader på dag 0. Fireogtyve timer efter podning, erlotinib eller vehikel blev tilsat. Antallet af levende og døde celler blev talt med trypanblåt-farvning. % Overlevelse indikerer en procentdel af levende celler, som udelukkede trypan blå-farvning, baseret på totalt celleantal i en brønd. Prøver blev fremstillet i tre eksemplarer.

MTT-assays

Tumorceller blev podet ved 5 x 10

3 celler per brønd i fladbundede 96-brønds kulturplader og dyrket i CM. Efter en 24-timers inkubation periode, så de tillægger dyrkningsplader blev celler behandlet med erlotinib i 48 timer. Dyrkningspladerne blev centrifugeret i non-adhærente tumorceller og mediet blev fjernet så meget som muligt og erstattet med 100 pi frisk medium. 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay for cellelevedygtighed blev udført ved tilsætning af 10 pi MTT-reagens per brønd i 2 timer ved 37 ° C, efterfulgt af tilsætning af 100 pl /brønd farvestof-solubiliserende detergent reagens. Supernatanten blev aspireret, og absorbansen blev målt ved 570 nm. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

LEF /TCF Reporter Analyser

PC9 celler blev forbigående transficeret med lentivirusvektor herunder TCF /LEF

Firefly

luciferase reporter konstruktion og intern kontrol

Renilla

luciferase konstruktion, eller ikke-inducerbare

Firefly

luciferase reporter konstruktion og intern kontrol

Renilla

luciferase konstruktion (Cignal TCF /LEF reporter kit, Qiagen). Celler blev transficeret med Lipofectamine 2000 og udvalgt i 2 dage i puromicin. Transficerede celle blev derefter podet i 24-brønds plader ved 30.000 celler /brønd før behandling med rekombinant Wnt3a (100 ng /ml; R 0,05. Data er præsenteret som middelværdi ± SD af tre uafhængige forsøg

DDX3X medieret EGFR-TKI resistens

Siden stamceller udnytte stamcelle-signalering.; derfor kan CSC-lignende fænotyper være forbundet med aktiveringen af ​​forskellige andre end EGFR-signalering resulterer i ændring af følsomhed over for EGFR-TKI signalveje. Således næste vi undersøgte EGFR-TKI følsomhed A-1 celler. Som vist i fig. 2A, blev der observeret en signifikant modstand mod 48-h behandling med EGFR-TKI erlotinib i A-1 celler. Knockdown af DDX3X restaureret følsomhed over for EGFR-TKI (fig. 2B). Selv blev observeret fald i% levedygtige celler i A-1 celler, når celler blev behandlet med erlotinib ved en koncentration større end 20 nM, var det ikke klart, om celler døende eller ikke. For at teste, om A-1 celler udviser nedsat levedygtighed eller blot reduceret proliferation efter 72-h erlotinib behandling blev døde celler farvet med propidiumiodid (PI) og analyseret med en microfluorometer. Mens antallet af døde celler steg i de parentale PC9 celler, blev ingen stigning detekteret i A-1 celler (fig. 2C). Dette fænomen blev bekræftet ved at tælle celleantal i tre dage under anvendelse af trypan ekskluderingsmetode blue (fig. 3A). Antallet af døde PC9 celler blev øget betydeligt i tilstedeværelse af erlotinib ved koncentrationer større end 20 nM. I modsætning hertil A-1 celler stoppet prolifererende når de udsættes for erlotinib ved koncentrationer større end 20 nM, men døde A-1 celletal ikke adskiller sig fra dem i ubehandlede celler, selv efter tre dages udsættelse til 2000 nM erlotinib. Alle andre kloner, der blev manipuleret til at overudtrykke DDX3X udstillet samme modstand mod erlotinib som A-1-celler (fig. 3B).

A. MTT assay af forældrenes PC9 celler og A-1 celler. Cancerceller blev behandlet med den angivne koncentration af erlotinib i 48 timer. Prøver blev fremstillet i tre eksemplarer. Data er præsenteret som middelværdi ± SD. B. MTT assay af forældrenes PC9 celler, A-1 celler, og A-1 celler med knockdown af DDX3X. Cancerceller blev behandlet med den angivne koncentration af erlotinib i 48 timer. Prøver blev fremstillet i tre eksemplarer. Data er præsenteret som middelværdi ± SD. C. Flow cytometri analyse af cancerceller behandlet med 20 nM erlotinib i 72 timer.

A. I alt 5 × 10

4 tumorceller blev podet i 24-brønds plader på dag 0. Fireogtyve timer efter podning, erlotinib eller vehikel blev tilsat i de angivne koncentrationer. Antallet af levende og døde celler blev talt med trypanblåt-farvning. % Overlevelse indikerer en procentdel af levende celler, som udelukkede trypan blå-farvning, baseret på totalt celleantal i en brønd. Prøver blev fremstillet i tre eksemplarer. Data er præsenteret som middelværdi ± SD. * Bruges til at angive betydning. B.% overlevelse af kræft celler behandlet med 20 nM erlotinib blev demonstreret. A-1, 2, 3, 4, og 5 angiver klonnumre som var transfekteret med cDNA kodende DDX3X. Den% Overlevelse viser procentdelen af ​​levende celler, som udelukkede trypan blå plet, baseret på totalt celleantal i en brønd. Prøver blev fremstillet i tre eksemplarer. Data er præsenteret som middelværdi ± SD. **

s

. 0,001

DDX3X reducerede EGFR signalering i cancerceller, der huser EGFR-aktiverende mutationer

overlevelse og spredning af PC9 celler er afhængige af en EGFR signalering afhængighed, fordi PC9 celler besidder driver mutationer i

EGFR

gen, forbedre tyrosinkinaseaktivitet [18], [19]. Således har vi analyseret, om EGFR-signalering var påvirket af DDX3X overekspression. I overensstemmelse med tidligere rapporter, blev Tyr1068 af EGFR phosphoryleret i forældrenes PC9 celler og mock transfektanter, selv i fravær af EGF (figur 4A.); blev dog næsten ingen EGFR fosforylering påvist i A-1 celler. Derudover knockdown af DDX3X i A-1 celler, der restitueres EGFR fosforylering. For at bekræfte, at dette fænomen ikke var begrænset til PC9 cellelinje, transficerede vi HCC4006, en human lungeadenocarcinom huser en EGFR exon 19 deletion, med cDNA, der koder DDX3X (HCC4006 S1, HCC4006 S2). HCC4006 S1 og S2 mistede også EGFR fosforylering (fig. S1B). EGFR besidder flere Tyr-rester, der gennemgår phosphorylering. For eksempel binder Grb2 adapter protein aktiveret EGFR på phosphoryleret Tyr1068 [20], og phosphoryleret Tyr1173 giver en docking site for Shc scaffold protein, som er involveret i mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) signaleringsaktivering [21]. Derudover kan Tyr845 phosphoryleres af andre kinaser, herunder Src, og har vist sig at være phosphoryleret i mange gefitinib-resistent EGFR mutanter [22] – [24]. Derfor vi næste undersøgt phosphoryleringsbegivenheder stater i disse tre tyrosinrester (Tyr845, Tyr1068, og Tyr1173) i tilstedeværelse af EGF. Interessant, fandt vi reduceret phosphorylering af alle undersøgte tyrosinrester i EGFR i A-1-celler (fig. 4B).

A. Immunblotting analyse af EGFR, phospho-EGFR (Tyr1068), og DDX3X i kræftceller uden EGF tilskud. B. Immunoblotting analyse af phospho-EGFR på Tyr1068, Tyr1173, og Tyr845 i forældrenes PC9 celler og A-1 celler. C. Kinetisk analyse af EGFR-signalering i forældrenes PC9 celler og A-1 celler. EGFR, phospho-EGFR (Tyr1068), Akt, blev phospho-Akt, ERK1 /2, og phospho-ERK1 /2-niveauer analyseret ved immunoblotting ved 0, 15, 30, 60, 120 og 900 min efter tilsætning af 100 ng /ml EGF.

Ved tilstedeværelse af 100 ng /mL EGF EGFR fosforylering (Tyr1068) blev forøget i forældrenes PC9 celler (fig. 4C). I modsætning hertil blev ligand-induceret EGFR phosphorylering og efterfølgende ekstracellulært signal-reguleret kinase (ERK) phosphorylering signifikant svækket i A-1 celler.

Ud over at være reguleret af phosphorylering, EGFR kan generere signalering via phosphorylering af andre human epidermal vækstfaktor receptor (HER) familie proteiner ved at danne heterodimerer. Krydstale af Met med EGFR signalvejen er også blevet vist at være involveret i EGFR-TKI resistens [25]. Således har vi testet, om HER2, HER3, HER4, og Met blev phosphoryleret. Der blev dog ikke fundet nogen forskelle i phosphorylering stater HER2 eller Met mellem forældrenes PC9 celler og A-1 celler (Fig. S1c, D). Derudover HER3 og HER4 blev ikke phosphoryleret i disse celler (data ikke vist).

En lille delpopulation af PC9 celler udtrykte stærkt DDX3X og udstillet CSC-lignende fænotyper

Akkumulerende beviser har vist, at næsten alle tumorceller vise bemærkelsesværdig variabilitet i fænotyper baseret på genetiske og epigenetiske heterogenitet [26]. Hvis DDX3X faktisk spiller en rolle i at fremkalde en stamcelle-lignende tilstand og signal skift, en mindre bestand af DDX3X-overekspression forældrenes PC9 celler kan findes. Eftersom A-1 celler udviste en tendens til at formere sig i en ankerplads-uafhængig måde, vi undersøgte en mindre subpopulation af ikke-vedhæftende PC9 celler. Overraskende er dette ikke klæbende population af parentale PC9 celler udviste næsten det samme niveau af DDX3X ekspression som A-1-celler (fig. 5A). Vi undersøgte ekspressionen af ​​ALDH, en formodet CSC markør (fig. 5B). Selv om kun 0,47% af adhærente PC9 celler udtrykte ALDH, 23,0% af ikke-adhærerende celler udviste ALDH aktivitet. På den anden side, 15,8% af adhærente A-1-celler og 23,8% af ikke-klæbende A-1-celler var ALDEFLUOR positive. Det er sandsynligt, at der findes ALDEFLUOR-positive celler kun i cellepopulationen, som stærkt udtrykker DDX3X. Desuden har de fleste ikke-adhærerende celler, men ikke adhærente celler udviste stærk ekspression af CD44, en anden formodet CSC markør (fig. 5C).

A. Immunblotting analyse af DDX3X udtryk i vedhængende og ikke-vedhæftende forældrenes PC9 celler og A-1 celler. B. ALDEFLUOR assays blev udført ved at suspendere celler i Aldefluor assaybuffer indeholdende 1,5 uM BODIPY-aminoacetaldehyd, en ALDH substrat. Celler blev derefter inkuberet i 45 minutter ved 37 ° C og analyseret i henhold til producentens anvisninger. C. Flow cytometri analyse af vedhængende og ikke-vedhæftende forældrenes PC9 celler og A-1 celler. Histgrams indikerer CD44-ekspression. Stiplede linjer angiver isotypekontrol, tynde linier angiver adhærente celler, og de tykke linjer angiver ikke-vedhæftende celler. D. Flow cytometri analyse af ufraktionerede, vedhængende, og ikke-adhærerende celler afledt af forældrenes PC9 celler og A-1 celler. X-aksen viser fluorescensintensiteten af ​​E-cadherin, og Y-aksen viser fluorescensintensiteten af ​​N-cadherin. E. flowcytometrianalyse af ikke-adhærerende celler isoleret fra parental PC9 og A-1-celler. Histogram plots viser vimentin udtryk på gated N-cadherin + celler.

Det blev påvist, at i løbet af EMT, er E-cadherin nedreguleres mens neural cadherin (N-cadherin) opreguleres, kaldet cadherin switch og at cadherin switch fremmer cancer invasion og metastase via stigende kræft cellemotilitet [27] – [30]. Vi undersøgte derfor, om E /N cadherin kontakten blev induceret af DDX3X. Som vist i fig. 5D, 15,5% af ufraktionerede A-1-celler og 7,0% af ufraktionerede parentale PC9 celler udtrykte N-cadherin, således, er det sandsynligt, at N-cadherin ekspression blev fremmet af DDX3X. Adhærente celler var E-cadherin enkelt positiv og N-cadherin

+ celler tilhørte nonadhærente cellepopulation. Interessant, 43,1% af ikke-klæbende forældrenes PC9 celler udtrykte både E-cadherin og N-cadherin og 29,2% var E-cadherin

N-cadherin

+. Det ser ud til, at ufuldstændig cadherin skifte fandt sted i forældrenes PC9 celler. I modsætning, 42,3% af ikke-klæbende A-1-celler var N-cadherin enkelt positiv og 10,8% var E-cadherin

+ N-cadherin

+. 21,7% af gated N-cadherin

+ i forældrenes PC9 celler, og 47,7% af gated N-cadherin

+ i A-1 celler udtrykte vimentin (Fig. 5E). Tilsammen en unik subpopulation der var under EMT eksisterede i ikke-klæbende celler af både A-1 og forældreorlov PC9 og at DDX3X lettet E /N cadherin kontakt efterfulgt af vimentin udtryk.

nonadhærente celle population af forældrenes PC9 manglede EGFR signalering og udviste resistens over for EGFR-TKI

Som vist i fig. 6A, manglede alle ikke-vedhæftende celler EGFR fosforylering som A-1 celler. Desuden nonadhærente population af parentale PC9 celler var resistente over for EGFR-TKI erlotinib, ligner adhærente A-1 celler (Fig. 6B). Fordi ikke-klæbende celler kan omfatte døde celler, vi undersøgte procentdele af døende celler med PI farvning. Fig. 6C viser, at 28,5% af adhærente parentale PC9 celler døde efter 72-h erlotinib behandling. I modsætning hertil procentdelen af ​​døende celler var kun 14,1% i ikke-vedhæftende PC9 celler. Dernæst dyrkede vi parentale PC9 celler i nærvær af stigende koncentrationer af erlotinib (op til 3000 nM) til opnåelse resistente celler. Efter tre måneders udsættelse for erlotinib, vi etableret R-PC9 celler, som var i stand til at overleve i CM indeholdende 3000 nM erlotinib. Fig. 7A viser, at R-PC9 celler var signifikant resistente over for erlotinib. R-PC9 celler udviste stærk ekspression af DDX3X (fig. 7B). Kollektivt, viste vores data, at forældrenes PC9 celler indeholdt en mindre population udstille stærk udtryk for DDX3X, CSC-lignende fænotyper, EMT, og den primære modstand mod EGFR-TKI. Den mindre befolkning kan overleve længe behandling med EGFR-TKI.

A. Immunoblotting-analyse af EGFR og phospho-EGFR (Tyr1068) i adhærente og non-adhærente cancerceller. B. MTT-assays blev anvendt til måling celleproliferation i adhærente og non-adhærente PC9 celler og A-1-celler efter erlotinib behandling. Data er præsenteret som middelværdi ± SD. Prøver blev fremstillet i tre eksemplarer. **

P

0,001. C. Flow cytometri analyse med PI farvning blev anvendt til at undersøge døende celler.

A. MTT-assays blev anvendt til bestemmelse af proliferationen af ​​adhærente og non-adhærente PC9 celler, såvel som R-PC9 celler, som blev opnået ved langvarig eksponering for stigende koncentrationer af erlotinib. Data er præsenteret som middelværdi ± SD. Prøver blev fremstillet i tre eksemplarer. * Angiver signifikante forskelle ved to-vejs ANOVA og ad hoc analyser. B. Immunoblotting analyse af DDX3X udtryk i forældrenes PC9 celler og R-PC9 celler.

β-Catenin signalering induceret af DDX3X

Selvom A-1 celler manglede EGFR phosphorylering og efterfølgende signalering , de viste næsten samme spredning hastighed som forældrenes PC9 celler

in vitro

. Det er sandsynligt, at EGFR-signalering erstattes af andre signalveje. Stamceller udnytter specifikke signalveje, såsom Wnt /β-catenin eller pindsvin, i stedet for receptortype tyrosinkinase signalering; desuden en vis delmængde af CSC vedligeholdelse er afhængig af Wnt /β-catenin signalering [31], [32]. DDX3X er påkrævet for Wnt /β-catenin signalering, og muteret DDX3X er blevet vist at spille en rolle i patogen β-catenin signalering i medulloblastom [13], [33]. Derfor vi næste analyseret Wnt /β-catenin signalering. TCF /LEF luciferase reporter assay viste, at β-catenin signalering blev fremmet i A-1 celler i nærvær eller fravær af Wnt3a (fig. S1E).

Diskussion

I denne undersøgelse har vi undersøgte rolle DDX3X i køb af EGFR-TKI-resistens i lungerne kræftceller. Vores resultater viste, at kræftceller huser EGFR-aktiverende mutationer kunne slukke EGFR-signalering og miste EGFR signal afhængighed. Tyr rester i EGFR af lungecancerceller overudtrykker DDX3X blev ikke phosphoryleret selv i nærvær af EGF. Dette var en uventet og overraskende fund, fordi EGFR-aktiverende mutationer forårsager EGFR kinasedomænet til at forblive i den aktive konformation, selv i fravær af ligander, hvilket resulterer i phosphorylering af tyrosinrester i de C-terminale hale segmenter. Den præcise mekanisme, gennem hvilken DDX3X inhiberer phosphorylering af tyrosinrester i EGFR er uklar. Imidlertid inhibering af tyrosinkinase-aktivitet er usandsynligt at være involveret, fordi ikke kun tyrosinrester underkastet autophosphorylering i C-terminal hale segmenter, men også Tyr845 i kinasedomænet, som også kan phosphoryleres af Src, var ikke phosphoryleret. Den iagttagelse, at DDX3X medieret Wnt /β-catenin signalering er i overensstemmelse med en nylig rapport, der beskriver Wnt-afhængige stimulering af kasein kinase 1 og fremme af pjusket phosphorylering med DDX3X i pattedyrceller [33]. Desuden har undersøgelser hel-exome identificeret DDX3X som en komponent af patogene β-catenin signalering, i Wnt undergruppe medulloblastom [12] – [14]. Samlet set vores nuværende data og disse tidligere undersøgelser viser, at DDX3X er en kritisk komponent i Wnt /β-catenin-signalvejen, og at signalet skift fra EGFR afhængighed af p-catenin signalering kunne fremkaldes ved DDX3X i lungekræft celler, der huser EGFR- aktiverende mutationer.

DDX3X er et RNA-helicase, som er stærkt bevaret fra gær til menneske og modulere strukturen af ​​RNA [34]. Således er RNA helicaser menes at deltage i RNA-transkription, splejsning, og translation. Menneskelig DDX3 har to nært beslægtede gener, DDX3X og DDX3Y, der er kodet i X og Y kromosomer, hhv. DDX3Y er unikt udtrykt i kimceller og er afgørende for spermatogenese [35]. Interessant fandt vi, at DDX3X inducerede stigning af cancerceller ledsaget af stamceller-lignende fænotyper såsom opreguleret ekspression af Sox2, ALDH, og CD44. Desuden forankringsuafhængig proliferation, cadherin skift fra E-cadherin til N-cadherin, vimentin ekspression blev observeret i disse celler. I overensstemmelse med vores resultater, har tumorer huser opreguleret DDX3X blevet rapporteret at udvise stamceller-lignende egenskaber og /eller bevis for EMT i melanom, brystcancer og leukæmi [8], [10], [12], [36]. Især, medulloblastom, hvori DDX3X er blevet vist at virke som drivkraft gen, ligner i udseende og differentiering potentiale til neurale stam- og progenitorceller. Men det er unikt fund, at ubehandlet lungeadenokarcinom celler indeholdt en subpopulation stærkt udtrykker DDX3X og ledsaget af signal skift, CSC-lignende fænotyper, og bevis for EMT.

Sammenfattende denne undersøgelse forudsat den første demonstration af, at DDX3X induceret tab af EGFR-signal afhængighed medfører resistens over for EGFR-TKI, ledsaget af CSC-lignende egenskaber og forekomst af EMT i lungekræft celler indeholdende EGFR-aktiverende mutation. Vores resultater viste, at hæmning af DDX3X kan være en lovende behandling for at overvinde primære EGFR-TKI-resistensmekanismer baseret på intratumor heterogenitet og for at opnå en kur i patienter med lungecancer huser EGFR-aktiverende mutationer.

Støtte Information