PLoS ONE: Kolorektal Cancer Genetisk heterogenitet afgrænset af Multi-Regions sekventering

Abstrakt

intratumor heterogenitet (ITH) fører til en undervurdering af mutations landskab portrætteret af en enkelt nål biopsi og dermed påvirker behandlingen præcision. Omfanget af colorektal cancer (CRC) genetisk ITH er ikke godt forstået i kinesiske patienter. Således har vi foretaget dybe sekventering ved hjælp af OncoGxOne

™ Plus panel, rettet 333 cancer-specifikke gener i multi-region biopsier af primære og lever metastatiske tumorer fra tre kinesiske CRC patienter. Vi bestemt, at omfanget af ITH varierede blandt de tre sager. I gennemsnit 65% af alle de fundne mutationer var almindelige i de enkelte tumorer.

KMT2C

afvigelser og

NCOR1

mutation var de eneste allestedsnærværende begivenheder. Efterfølgende fylogenetisk analyse viste, at tumorerne udviklet sig i en forgrenet måde. Sammenligning af de primære og metastatiske tumorer viste, at

PPP2R1A

(E370X),

SETD2

(I1608V),

Smad4

(G382T), og

AR

splejsning websted mutationer kan være specifikke for liver metastatisk cancer. Disse mutationer kan bidrage til initiering og progression af fjernmetastaser. Kollektivt, vores analyse identificeret en betydelig grad af genetisk ITH i CRC, der bør overvejes for personlige terapeutiske strategier

Henvisning:. Lu YW, Zhang HF, Liang R, Xie ZR, Luo HY, Zeng YJ, et al. (2016) Kolorektal Cancer Genetisk heterogenitet afgrænset af Multi-Regions Sequencing. PLoS ONE 11 (3): e0152673. doi: 10,1371 /journal.pone.0152673

Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN

Modtaget: November 23, 2015; Accepteret: 17 marts 2016; Udgivet: Marts 29, 2016

Copyright: © 2016 Lu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Sequencing data er tilgængelige fra Sequence Hent Archive (SRA) database (tiltrædelse nummer SRP065361)

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Fonden for Medicinsk førende Talent af Yunnan-provinsen (nr L-201.205) KHW, Foundation of Yunnan Institut for Digestive Disease (nr 2014NS122) KHW, Institut for Videnskab og Teknologi i Yunnan-provinsen-Kunming Medical University (NO. 2015FB100) HFZ, National Natural Science Foundation of China (81.460.007) XYK. https://www.nsfc.gov.cn/. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de førende dødsårsager på verdensplan, der tegner sig for en anslået 1,2 millioner nye tilfælde og 600.000 dødsfald hvert år [1]. CRC er den tredje mest udbredte kræft og den femte hyppigste årsag til kræftdødsfald i Kina. Forekomsten af ​​CRC er også steget i den kinesiske befolkning i de senere år [2]. Selv om der er gjort betydelige fremskridt med hensyn til CRC behandling, herunder målrettet terapi, den femårige relative overlevelse af patienter med fjernmetastaser er kun 12,5% [3]. Derfor er en omfattende forståelse af den molekylære biologi CRC er meget ønskeligt. Disse nye indsigter vil efterfølgende forbedre behandlingen af ​​CRC.

intratumor heterogenitet (ITH) fører til en undervurdering af mutations landskab portrætteret af en enkelt nål biopsi og dermed påvirker behandlingen præcision. Med udviklingen af ​​næste generation sekventering (NGS), har ITH nylig blevet belyst i væsentlig detalje i flere cancertyper [4-7], herunder CRC [8, 9]. Kim et al. [8] gennemført multi-region biopsier af primære og lever metastatiske regioner fra fem CRCs gennem hele-exome sekventering og bemærkede, at kun 19,8% -53,9% af mutationerne i en given prøve var universelle. De identificerede også

APC

,

KRAS

, og

TP53

mutationer i alle regionale biopsier. Sekventeringen dækning af deres undersøgelse er relativt lav, hvilket kan føre til at overse den lavfrekvente mutation. Henviser i Kogita undersøgelse, [9] de kun målrettet 50 cancer-gener, og dermed den identificerede omfanget af CRC genetisk ITH var begrænset. Desuden er ikke fastlagt omfanget af CRC genetisk ITH i kinesiske patienter.

Vi har udført dyb dækning sekventering ved hjælp af SureSelect Target Berigelse Kit og OncoGxOne

™ Plus panel af DNA fra flere regioner biopsier af primære og lever metastatiske tumorer af tre kinesiske CRC patienter til at karakterisere CRC ITH i kinesiske patienter. Vi bestemt mutationen landskab og identificeret den høje grad af genetisk ITH i CRC.

Materialer og metoder

Patienter og prøver

Tre patienter med multi-regionale primære tyktarmcarcinom kirurgisk resekteres i første Folkeparti Hospital i Yunnan-provinsen mellem oktober 2013 og april 2014 blev indrulleret i studiet. Patologisk tumor iscenesættelse blev gennemført i overensstemmelse med TNM klassifikationen (tabel 1). Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité af de første mennesker Hospital i Yunnan-provinsen (2014YXLH029). Alle patienter i undersøgelsen forudsat skriftligt informeret samtykke til brug af opereret væv.

DNA isolation

De formalinfikserede, paraffin-indstøbt (FFPE) prøver blev udsat for histologisk bedømmelse kun de indeholder tilstrækkelige tumorceller (mindst 70% af tumorcellerne), bestemt ved hematoxylin og eosin-farvning, og matchede normale væv blev udvalgt til DNA-isolering. Genomisk DNA blev isoleret ved anvendelse af QIAamp

® DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge producentens procedure med små modifikationer. Genomiske DNA-prøver blev kvantificeret ved hjælp af NanoDrop 2000 spektrofotometer (Agilent, Santa Clara, CA, USA). Den isolerede DNA blev opbevaret ved -80 ° C indtil analyse.

mikrosatelitter test

mikrosatellit instabilitet (MSI) status blev bestemt for hver enkelt sag ved hjælp af fem mononukleotid eller dinukleotid mikrosatellitter markører (BAT25, BAT26, D17S250, D2S123, og D5S346) [10]. Primere var 5′-mærket med HEX, FAM, eller TET (Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, Kina). Alle mikrosatellit-loci blev amplificeret fra matchet normal og tumor-DNA gennem fluorescens multiplex polymerasekædereaktion (PCR). Derefter blev PCR-produkterne sekventeret på ABI 3730XL automatisk sekventeringsapparat ved anvendelse af et fragment analyse software (Gene Scan, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA). Mikrosatellit markør stabilitet blev analyseret ved hjælp af GeneMapper software. MSI status blev klassificeret som MSI-høj, hvis ≥30% af markører var ustabil, MSI-lav, hvis. 30% af markører var ustabil, og ingen forskydninger eller yderligere toppe for mikrosatellit stabil (MSS) tyktarmskræft

Target berigelse og sekventering

Sample sekvens berigelse og bibliotek forberedelse blev udført ved hjælp af SureSelect Target Enrichment Kit (Agilent, Santa Clara, CA, USA) og OncoGxOne

™ Plus kræft panel (GENEWIZ, Inc ., South Plainfield, NJ, USA) ifølge producentens anvisninger. OncoGxOne Plus, en målrettet onkologi panel, indeholder 333 cancer-specifikke gener (herunder alle kendte kræft driver gener og 64 målrettede og kemoterapi relaterede gener). Kort fortalt blev 200 ng af genomisk DNA fra hver prøve fragmenteret ved akustisk forskydning på en Covaris instrument. Fraktioner på 150-200 bp blev ligeret til SureSelect Adaptor Oligo og PCR-amplificeret i 10 cykler. For målet berigelse, blev hele biblioteket hybridiseret ved hjælp af SureSelect Oligo Capture Kit til 16 eller 24 timer ved 65 ° C. Biotinylerede hybrider blev fanget, og de berigede biblioteker blev afsluttet under 16 PCR-cyklusser. De resulterende oprensede biblioteker blev samlet og sekventeret ved hjælp af Illumina

® MiSeq

™ NGS instrument til 2 × 150 parrede ende sekventering læser (Illumina, San Diego, CA, USA) i overensstemmelse med producentens protokoller. Generne i OncoGxOne

™ Plus kræft panel er anført i S1 tabel.

Bioinformatik analyse

Sekventeringsdata blev adgang til via MiSeq Reporter. Datakvalitet blev kontrolleret ved hjælp af FastQC (https://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/) og derefter justeret til den menneskelige henvisning genom (hg19) ved hjælp af Burrows-Wheeler tilpasning værktøj til at generere et bam fil [11]. Variant kaldelse blev udført ved anvendelse af Genome Analysis Toolkit, som standard [12]. Rå variant opkald blev frafiltreret ved hjælp allelfrekvenserne 5% og ændret læser 7X. Derefter blev de resulterende varianter kommenteret af Illumina Variant Studio-version 2.2.3 (Illumina, San Diego, CA, USA) og ANNOVAR [13]. Kendte enkelt nukleotid polymorfier blev udelukket ved hjælp af varianter inthedbSNP 137 (hg19) [14] og SNPs præsenteret i 1000 genomprogramledere data. De potentielle germinale mutationer blev sekventeret i matchede normale væv.

fylogenetisk analyse

Vi udledes forfædres relationer mellem primære tumorer og metastaser af Patient 3 ved mutation profiler. Neighbor træer blev konstrueret som tidligere beskrevet af Kim et al. [8], med nogle ændringer. Vi brugte phytools [15] til at beregne nabo afstande og nabo algoritme implementeret i PHYLIP [16] softwarepakke til at udlede det fylogenetiske træ.

Resultater

Oversigt over NGS data

Tre CRC patienter (P1, P2, og P3) blev inkluderet i denne undersøgelse. Derefter blev 10 prøver fra 3 patienter sekventeret, med en median dækning på 250 læser. Vi identificerede ~ 8.000 somatiske enkelt nukleotid variationer (SNVs) (4.444 til 8348) og ~ 850 (457 til 1154) somatiske indsættelser og sletninger (indels) i de 10 biopsi prøver fra 3 CRC tilfælde (tabel 2).

Patient 1

En 62-årig mand blev diagnosticeret med MSS tyktarmskræft, med en 3,5 cm x 3 cm x 1,2 cm tumor. To regioner (P1-1 og P1-2) af den primære tumor udviste en moderat differentieret adenocarcinom, og den patologiske stadium af tumoren var T2N1M0. Patienten fik ingen forudgående behandling.

synonyme somatiske punktmutationer og indels, der fører til protein forandringer er opsummeret i S2 tabel. Deres fordelinger i forskellige regioner i hele tumoren blev kortlagt (Fig 1A). Til sammenligning af mutationen spektre mellem primære regioner, vi konstateret, at 24% (11/45) af mutationerne var specifikke for P1-1, mens 13% (6/45) af mutationerne var specifikke for P1-2. De resterende 63% af mutationerne blev deles af begge regioner. Ved at sammenligne vores resultat med de 127 signifikant muterede gener identificeret af Kandoth et al. [17], vi fastslået, at P1-1 og P1-2 indeholdt

APC

(428_429del),

KIT

(A755T),

KMT2C

(R909K, C391X, G315S D348N, P309S, og .Y816_I817delinsX),

NCOR1

(S63L),

NTM

(G12D), og

PIK3CG

(K344Q) mutationer. P1-1 indeholdt syv yderligere mutationer, nemlig

APC

(Q706X),

KMT2D

(3860_3861del),

KMT2C

(S338L, K306fs, og en splejsning websted mutation)

BRCA2

(T3030fs), og

ErbB4

splejsning websted mutation. P1-2 indeholdt en anden

AR

(57_58del) mutation.

En Genetic ITH i Patient 1. Den regionale fordeling af 45 somatiske varianter i 3 primære tumor regioner (P1-1 og P1-2 ); B Genetisk ITH i Patient 2. Den regionale fordeling af 33 somatiske varianter i 3 primære tumor regioner (P2-1, P2-2, og P2-3); C Genetisk ITH i Patient 3. Den regionale fordeling af 58 somatiske varianter i 3 primære og 2 metastatiske regioner. Varmen kort viser tilstedeværelsen (grå) eller fravær (mørkeblå) af en mutation i hver region. Farvebjælkerne over zonekort præcisere de kategorier af mutationer.

Patient 2

En 60-årig kvinde blev diagnosticeret med MSS tyktarmskræft, med en 3,8 cm x 3,5 cm × 1,2 cm tumor. Tre regioner (P2-1, P2-2, og P2-3) af den primære tumor udviste en moderat differentieret histologi og højre hepatisk lap metastaser. Flere lymfeknudemetastaser (PN2) blev påvist, og den patologiske stadium af tumoren var T2N4M0. Patienten fik ingen forudgående behandling.

For Patient 2 blev målrettet resekventering af DNA fra de tre regioner i primær tumor udført. Denne proces afslørede 25 ikke-synonyme punktmutationer og 8 indels (S2 tabel). Deres fordelinger i forskellige regioner i hele tumoren blev kortlagt (Fig 1B) som beskrevet af Gerlinger et al. [5]. Vi adskiller de 33 mutationer i 23 allestedsnærværende mutationer (dem, der præsenteres i alle regioner i hvert CRC), 6 private mutationer (dem, der præsenteres i én region), og resten kaldet delte mutationer. I gennemsnit en enkelt biopsi udstillede 28 somatiske mutationer, der tegner sig for 85% af alle de observerede i denne tumor mutationer. De mutation landskaber i de forskellige regioner var meget lig hinanden.

Vi identificerede adskillige betydeligt muterede gener, herunder

ATRX

(P571A),

CHEK2

(P358S),

KDM6A

(A1038T),

NCOR1

(N208K, S63L),

KMT2C

(A746S, G892R, P309S, R909K, D348N, og Y816_I817delinsX), og

AR

(57_59del), der var allestedsnærværende mutationer.

TGFBR2

(E125fs) var specifik for P2-1,

SETD2

(I1608V) mutation var specifik for P2-2,

TP53

(T218P),

KMT2C

(K339N) var specifik for P2-3.

APC

(L693fs) og TP53 (R89W) blev delt af P2-2 og P2-3.

NCOR1

(K85N) blev delt af P2-2 og P2-1.

KMT2C

(Q755X) deles af P2-1 og P2-3.

Patient 3

En 71-årig kvinde blev diagnosticeret med MSS-høj og moderat differentieret tyktarmskræft, med en 9 cm × 5 cm × 3 cm primær tumor og en 1,5 cm x 1 cm x 0,5 cm højre hepatisk lap metastaser. Tre regioner (P3-1, P3-2, og P3-3) af den primære cancer og to metastatiske regioner blev reseceret, og den patologiske stadium af tumoren var T3N2M2. Patienten fik ingen forudgående behandling. For denne patient, blev målrettet resekventering gennemført på DNA fra de tre regioner (P3-1, P3-2, og P3-3) af den primære tumor og to metastatiske regioner. Processen afslørede 47 ikke-synonyme punktmutationer og 11 indels (S2 tabel). Deres fordelinger i forskellige regioner i hele tumoren blev kortlagt (Fig 1C).

Vi konstruerede en fylogenetisk træ (figur 2), som viste en forgrenet snarere end en lineær, tumor evolution, til at repræsentere den evolutionære historie CRC. P3-2 mutation spektre var mere ligner L1 og L2, hvilket indikerer, at oprindelsen af ​​fjerne metastaser kunne spores til en af ​​de primære steder.

Branch længder i træet er proportional med antallet af ikke-synonyme mutationer i de tilsvarende.

Samlet set target sekventering identificeret 45 somatiske mutationer per biopsi, der tegner sig for 78% af alle mutationer observeret i denne tumor. 60% af alle de fundne af multi-region sekventering i kolektomi prøven mutationer var allestedsnærværende mutationer til stede i alle regioner. Når vi analyserede den primære kræft, blev opdaget i gennemsnit 45 somatiske mutationer per biopsi, som tegnede sig for 87% af alle de mutationer identificeret i denne tumor. For metastatiske steder, en enkelt biopsi viste 92% af alle de fundne i denne tumor mutationer.

I de væsentligt muterede gener, vi bestemt, at

KRAS

(G13D),

PIK3CA Hotel (E545),

TP53

en splejsning websted mutation,

APC

(E854fs),

KMT2C

(E141G, K339N, P309S, og Y816_I817delinsX),

SETBP1

(Q1558L), og

NCOR1

(S63L) var allestedsnærværende mutationer, mens

CDKN2A

(D74A),

Smad4

(W168X),

NCOR1

(N208K),

KMT2C

(G315C og K306fs) og

INHBA

(V58I) var specifikke for den primære kræft.

PPP2R1A

(E370X),

SETD2

(I1608V),

Smad4

(G382T), og

AR

splejsning websted mutationer var specifikke for leveren metastatisk cancer . Men disse mutationer var, fraværende i de primære områder kræft.

KRAS

,

TP53

, og

PIK3CA

mutationer, som ofte er blevet anvendt som molekylære biomarkører i CRC, præsenteres også i alle regioner.

metastatisk tumor-specifikke mutationer

Ved at sammenligne mutationen landskab mellem primære og metastatiske regioner, vi har registreret, at flere mutationer var specifikke for metastatiske regioner. Smad4 er et centralt transducer af transformerende vækstfaktor-β superfamilien signalering, som regulerer celleproliferation, differentiering og apoptose [18]. Tab af Smad4 er korreleret med CRC metastase [19-21]. I mellemtiden, AR tilhører en familie af nukleære receptorer, der fungerer som transkriptionsfaktorer. AR er blevet vist at regulere cellemigration ved at undertrykke den nukleare faktor kappa B /matrix metallopeptidase 9 pathway og yderligere inhibering hepatocellulært carcinom-metastase [22, 23]. AR splejsningsvarianter er kendt for at fremme tumormetastase [24].

PPP2R1A

gen koder den strukturelle underenhed af PP2A enzym, som er en særdeles konserveret serin /threonin-phosphatase, der tjener et bredt spektrum af biologiske roller, herunder den negative regulering af signaltransduktion, cellecyklusprogression [25] , og genekspression. PPP2R1A letter tumor celle-lymfatisk endotel celle-interaktioner under melanom celle metastase [26].

Diskussion

Den multi-region mutation landskab analyse af de tre CRC tumorer ydet betydelig beviser for ITH, med omfanget af ITH varierende blandt de tre sager. I Patient 1, vi sekventeret to rumligt adskilte steder af primær cancer. Deres mutationsændringer spektre udviste en 63% overlapning. I Patient 2, en enkelt biopsi udstillede 28 somatiske mutationer i gennemsnit, der tegner sig for 85% af alle de observerede i denne tumor mutationer. Derimod i Patient 3 var 78% af alle mutationer observeret i denne tumor. Af alle de somatiske mutationer afsløres ved multi-region sekventering, 30% til 40% var heterogen og kan således ikke påvises i hvert sekventeret region. Kim et al. [8] bestemt, at 46% -80% af mutationerne var upåviselige på tværs af alle de regionale biopsier i deres kohorte. Niveauet af genetiske ITH i deres prøver var højere end i vores. Sekventeringsresultaterne af de primære kræft i patient 1 og 2 var mere ligner hinanden end de af prøverne fra den ovennævnte undersøgelse. Disse resultater indebærer, at en enkelt tumor biopsier ikke præcist kan repræsentere en tumor genomiske mutations landskab, som i væsentlig grad påvirker målrettet terapi.

Vi konstrueret en fylogenetisk træ ved hjælp af data fra Patient 3. Træet viste, at CRC udviklet sig i en forgrenet snarere end en lineær, måde. Den forgrenede evolution model er blevet valideret i mange typer af kræft [27], herunder CRC [8]. Traditionelt er CRC anses for at udvikle sig lineært [28]. Nylige undersøgelser har vist, at der findes både evolution modeller i CRC [29].

forgrenede tumor udvikling understreger behovet for at målrette mutationer placeret i hovedstammen af ​​det fylogenetiske træ. Vi bestemt, at

KMT2C

og

NCOR1

(S63L) blev muteret i alle regioner sammenlignet med de markant muterede gener rapporteret af Kandoth et al. [17]. KMT2C er medlem af den humane trithorax /mixed-slægt leukæmi familie [30] og er involveret i histon modifikation.

KMT2C

ofte ændres i mange typer af kræft, herunder leverkræft [31], kutant planocellulært karcinom [32], og esophageal pladecellekræft [33]. I vores forskning, vi besluttet, at hver patient har mindst syv mutationer i

KMT2C

, den kliniske betydning af som fortsat skal valideres. Vi observerede også en

NCOR1

missense mutation. NCOR1 er en 270 k nuklear receptor co-repressorkomplekset [34], der deltager i ligand-afhængig transkriptionel repression af østrogenreceptoren-α [35].

KMT2C

og

NCOR1

kan repræsentere to potentielle målsøgende gener i fastsættelsen af ​​heterogenitet.

KRAS

,

TP53

, og

PIK3CA

er de mest markant muterede gener i CRC [36]. Dog kun Patient 3 havde disse mutationer i vores kohorte. Disse mutationer blev identificeret i alle regioner opnået fra patienten og viste høj overensstemmelse mellem matchede primær og metastatisk CRC. Dette resultat er i overensstemmelse med den for Brannon et al. [37]. Den primære kræft mutation spektre præcist svarer til det metastatiske læsioner i form af for tiden tilgængelige forudsagte CRC biomarkører.

PPP2R1A

(E370X),

SETD2

(I1608V),

Smad4

(G382T), og

AR

splejsning websted mutationer blev bestemt til at være potentielle metastatisk tumor-specifikke mutationer. Vi formoder, at disse mutationer kunne drive CRC metastase. I betragtning af den begrænsede stikprøvestørrelse, skal hyppigheden af ​​disse mutationer i CRC metastaser vurderes i en større kohorte. Yderligere funktionelle studier er nødvendige for at løse deres roller i CRC metastaser.

Genomisk analyse fra enkelt nål biopsier kan undervurdere mutations landskab af heterogene tumorer. ITH kan til dels forklare den dårlige validering af CRC biomarkører grundet sampling bias. Rekonstruktion tumoren klonal struktur og identificere de allestedsnærværende ændringer beliggende i stammen af ​​fylogenetisk træ kan bidrage til opdagelsen af ​​mere effektive biomarkører og terapeutiske tilgange.

Som konklusion, vi identificeret den betydelige omfang af ITH i CRC. I forbindelse med dette fænomen, vi fastslået, at CRC udviklet sig i en forgrenet måde og flere molekylære begivenheder kan bidrage til CRC progression. Vi undersøgte kun tre tilfælde på grund af finansielle begrænsninger. bør foretages yderligere undersøgelser med store stikprøvestørrelser at bekræfte disse resultater.

Støtte Information

S1 Table. OncoGxOneTMPlus Cancer gen liste

doi:. 10,1371 /journal.pone.0152673.s001

(PDF)

S2 Table. Genetiske ændringer per patient

doi:. 10,1371 /journal.pone.0152673.s002

(XLSX)