PLoS ONE: Modulering af Androgen receptor signalering i hormonbehandling-Resistant prostatakræft Cell Lines

Abstrakt

Baggrund

Prostata epitelceller afhænger androgener for overlevelse og funktion. I (tidligt) prostatacancer (PSA) androgener regulere også tumorvækst, som udnyttes af hormonbehandlinger i metastatisk sygdom. Formålet med denne undersøgelse var at karakterisere androgen receptor (AR) reaktion i hormonbehandling-resistente PC346 celler og identificere potentielle sygdomsmarkører.

Metode /vigtigste resultater

Menneskelig 19K oligoarrays blev brugt at etablere androgen-regulerede udtryk profil androgen-responsive PC346C celler og dens afledte terapi-resistente underlinjer: PC346DCC (rudimentære AR niveauer), PC346Flu1 (AR overekspression) og PC346Flu2 (T877A AR mutation). I alt blev 107 udskrifter differentielt udtrykt i PC346C og derivater efter R1881 eller hydroxyflutamid stimulationer. AR-reguleret udtryk profiler afspejlede AR modifikationer af respektive terapi-resistente underlinjer: AR overekspression resulterede i stærkere og bredere transkriptionel respons på R1881 stimulering, AR nedregulering korreleret med mangelfuld respons AR-målgener og T877A mutation resulterede i transkriptionel svar på både R1881 og hydroxyflutamid. Denne AR-target signatur var knyttet til flere offentligt tilgængelige cellelinje og tumor afledt PCA-databaser, der afslører, at distinkte funktionelle klynger forskelligt blev moduleret under PCa progression. Differentiering og sekretoriske funktioner blev opreguleret i primær PCa men undertrykt i metastase, mens spredning, cytoskeletal remodellering og vedhæftning blev overudtrykt i metastaser. Endelig blev de androgen-regulerede gener ENDOD1, MCCC2 og ACSL3 udvalgt som potentielle markører for sygdomme for RT-PCR kvantificering i et særskilt sæt af humane prostata prøver. ENDOD1 og ACSL3 viste nedregulering i høj kvalitet og metastatisk PCa, mens MCCC2 blev overudtrykt i lav kvalitet PCa.

Konklusioner /Betydning

AR modifikationer ændret transkriptionel respons på (anti) androgener i terapi-resistente celler. Endvidere selektiv nedregulering af gener involveret i differentiering og opregulering af gener, der fremmer proliferation og invasion foreslå en forstyrret ligevægt mellem væksten og differentieringen funktioner i AR pathway under PCa progression. Disse resultater kan have konsekvenser i den aktuelle behandling og udvikling af nye terapeutiske tilgange til metastatisk PCa

Henvisning:. Marques RB, DIT’er NF, Erkens-Schulze S, van IJcken WFJ, van Weerden WM, Jenster G (2011 ) Modulation af Androgen receptor signalering i hormonbehandling-Resistant Prostate Cancer cellelinier. PLoS ONE 6 (8): e23144. doi: 10,1371 /journal.pone.0023144

Redaktør: Laszlo Tora, Institut for Genetik og molekylær- og cellebiologi, Frankrig

Modtaget: 8. december 2010; Accepteret: 13 juli 2011; Udgivet: 4 August, 2011

Copyright: © 2011 Marques et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet præsenteres i dette manuskript blev støttet af den nederlandske Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO), gennem ZonMw tilskud 903-46-187, og af den hollandske Cancer Society (KWF), gennem tilskud NKB97-1479 og DDHK 2001-2455. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den hyppigst diagnosticerede non-kutant malignitet hos mænd og den anden førende årsag til kræftdødsfald i de vestlige lande [1]. Prostatacancer er en stærkt heterogen tilstand, udviser en lang række biologiske og kliniske manifestationer. Mens nogle patienter udvikler en asymptomatisk sygdomsforløb og hellere dø med kræft end fra kræft, andre stede med en mere aggressiv og /eller mere fremskreden sygdom på tidspunktet for diagnose [2]. Når tumoren er begrænset til prostata, kan det effektivt behandles ved radikal kirurgi og /eller stråleterapi, men når tumoren har udbredt, er systemisk behandling kræves. Da prostatacancerceller kræver androgener for deres overlevelse og vækst, den gyldne standard for behandling af undvigende prostatatumorer er androgen ablation ved kemisk eller kirurgisk kastration, som kan kombineres med administration af androgen receptor (AR) antagonister [2]. De fleste patienter vil få gavn af denne hormonbehandling, tumorer kan skrumpe og symptomerne forbedre. Men efterhånden alle cancere bliver resistente og gentages som terapi-resistent eller kastrationsresistent sygdom, for hvilken i øjeblikket eksisterer ingen helbredende behandling [3], [4]. AR vej er meget alsidig, at være involveret i mange biologiske processer, herunder celleproliferation, regulering af apoptose og differentiering [5]. Balancen mellem disse forskellige funktioner dikterer homøostase af prostata kirtlen. Et relevant spørgsmål er, hvordan prostatacancerceller, der oprindeligt afhængige af androgener kan genoptage væksten i en androgen-berøvet miljø. En mulighed er, at prostatacancerceller opnå dette ved at tilpasse deres AR vej til de lave androgen /høj antiandrogen niveauer, for eksempel ved mutation, forstærkning eller trunkering til en konstitutivt aktiv AR, deregulering af AR cofaktorer og /eller intratumoral androgen produktion [6] [7]. På den anden side kan cancerceller aktivere alternative vækst pathways, mens lukke tumorsuppressorer og apoptotiske signaler [6], [7].

I den foreliggende undersøgelse har vi fokuseret på den rolle, AR vej hos prostatakræft progression. Ekspressionsmønsteret for androgen-regulerede gener i androgen-responsive og kastrationsresistent cellelinier blev etableret med det formål at: (i) bestemme, hvorvidt AR pathway stadig funktionelt aktiv i de hormonale terapi-resistent PC346 celler; (Ii) identificere den mekanisme (r), hvorved AR pathway kan justeres til de lave androgen /høj antiandrogen niveauer; (Iii) identifikation af androgen-regulerede gener, der potentielt kan anvendes i diagnose /prognose af prostatacancer eller som et terapeutisk mål. Til dette formål anvendte vi microarray teknologi til at karakterisere den transkriptionelle program aktiveres af det syntetiske androgen R1881 og antiandrogenet hydroxyflutamid. Som model system, vi brugte PC346 cellelinier (Tabel 1): androgen-responsive PC346C parental cellelinje og dets terapi-resistent afledte underlinjer PC346DCC, PC346Flu1 og PC346Flu2 [8]. Disse kastrationsresistent underlinjer reproducere fælles AR ændringer observeret i terapi-resistent sygdom:. AR nedregulering (PC346DCC), AR mutation (PC346Flu2) og AR overekspression (PC346Flu1), hvilket gør det til et unikt og værdifuldt model for denne undersøgelse

Metoder

Etik Statement

Normal og tumor prøver fra patienter blev opnået fra den frosne vævsbank af Erasmus Medical center (Rotterdam, Holland). Prøverne blev indsamlet mellem 1984 og 2001. De eksperimentelle protokoller blev godkendt af Erasmus MC Medical Ethics Committee henhold til medicinsk forskning med mennesket Emner loven.

Reagenser og cellelinjer

Den grundlæggende kultur medium, som anvendes i vedligeholdelse af PC346 cellelinier bestod af DMEM-F12-medium (Cambrex BioWhitaker, Belgien) suppleret med 2% føtalt kalveserum (FCS; PAN Biotech GmbH, Aidenbach, Tyskland), 1% insulin-transferrin-selen (Gibco BRL ), 0,01% bovint serumalbumin (Boehringer Mannheim, Tyskland), 10 ng /ml epidermal vækstfaktor (Sigma-Aldrich), penicillin /streptomycin antibiotika (100 U /ml penicillin, 100 mg /ml streptomycin; BioWhitaker, Belgien); suppleret med følgende: 100 ng /ml fibronectin (Harbor Bio-Products, Tebu-bio, Holland), 20 mg /ml fetuine (ICN Biomedicals, Holland), 50 ng /ml choleratoxin, 0,1 mM phosphoethanolamin, 0,6 ng /ml triiodthyronin og 500 ng /ml Dexametason (alle fra Sigma). PC346C celler blev holdt i kultur i komplet medium nævnt ovenfor suppleret med 0,1 nM 17-methyltrienolone (R1881, NEN, Boston MA, USA). PC346DCC selektionsmedium blev suppleret som beskrevet ovenfor, men forarmet fra androgener ved hjælp dextran-belagt trækul (DCC) behandlet FCS. PC346Flu1 og PC346Flu2 dyrkningsmediet blev også androgen udtømt ved anvendelse af 2% DCC-FCS, og suppleret med 1 uM af hydroxyflutamid (OH-flutamid, Schering-Plough Research Institute, New Jersey, USA). For hormonstimulationer blev en forenklet version af dyrkningsmediet anvendes, indeholdende 2% DCC- FCS uden de ovennævnte tilsætninger (minimal medium). Celler blev dyrket i T25 Primaria ™ vævskulturkolber (BD Biosciences Benelux NV, Holland) ved 37 ° C under 5% CO

2 befugtet atmosfære.

hormonstimulationer og udtryk microarray analyse

Celler blev podet i deres respektive selektionsmedium at nå -50% konfluens og lodes binde natten over. Den næste dag blev mediet udskiftet med 2% DCC-FCS i minimalmedium, og cellerne blev udsultet i 48 timer, for at bringe AR aktivitet til basale niveauer før hormonstimulationer. Efterfølgende blev cellerne stimuleret med enten bærer, 1 nM R1881 eller 1 uM OH-flutamid i 4, 8 eller 16 timer. Efter stimuleringer blev celler skyllet to gange med PBS og opbevaret ved -20 ° C indtil RNA-isolering. Totalt RNA blev isoleret med RNAzol B reagens (Campro Scientific, Veenendaal, Holland) og yderligere oprenset ved RNeasy-søjler (Qiagen) med on-søjle DNA-fordøjelse, ifølge fabrikantens protokol. RNA kvalitet blev kontrolleret på 1% agarosegel.

Cy3- eller Cy5-mærkede RNA-prober blev fremstillet ved at inkorporere amino-allyl UTP under RNA-amplifikation, efterfulgt af kobling til N-hydroxysuccinimid modificeret farvestof. Kort beskrevet blev 3 ug RNA anvendes til en T7-baserede lineær mRNA amplificering protokol, der er beskrevet tidligere [9]. Amino-allyl UTP, plus samme mængde umodificeret rUTP, blev inkorporeret i aRNA med T7 Megascript Kit (alle fra Ambion) ifølge producentens protokol. Amplificerede RNA blev oprenset og koncentreret ved anvendelse af Microcon-YM 30 søjler (Amicon®) at skylle tre gange med 300 pi RNAse-frit vand. Endelig 2 ug aminoallyl-modificeret RNA, i højst 3,33 pi RNAse-frit vand, blev inkuberet med 1,66 pi natriumhydrogencarbonatbuffer (0,3 M, pH 9) og 5 pi Cy3- eller Cy5-farvestof (CyScribe Post-Mærkning kit, Amersham, NJ, USA), i 1 time i mørke ved stuetemperatur. Reaktionen blev standset med 5 pi 4 M hydroxylamin HCI (Sigma), kontraindikationer-mærkede prober blev kombineret og oprenset /koncentreret under anvendelse Microcon-YM 30 kolonner. Probe blev indsamlet i 5-15 pi endeligt volumen og resuspenderes i 80 ul Ambion hybridiseringsbuffer nummer 1.

For microarray vi brugte dobbelt-dye oligoarrays repræsenterer ca. 15.000 humane gener, som mærket hormon-stimuleret RNA var cohybridized med sin contra-mærket tid-matchede køretøj (ethanol) kontrol. To mikroarrays blev udført pr stand: i et eksperiment de stimulerede prøver blev mærket med Cy3 og ustimulerede reference med Cy5, i det andet eksperiment i omvendt (dye-swap); dette blev gjort for at udelukke dye-præferentiel binding til oligonukleotider på microarray. Desuden blev to uafhængige cellepassager anvendes for hvert af disse forsøg, at tage højde for den biologiske variabilitet.

oligoarrays anvendt i denne undersøgelse blev produceret hos Erasmus Center for BIOMICS. Kort fortalt, et menneske 18,584 oligonukleotider bibliotek (Compugen, Sigma-Genosys) blev spottet på aminosilanforbindelser objektglas under anvendelse af en Virtek Chipwriter Professional arrayer (Virtek Vision International, Waterloo, Canada). Kontrolpletter inkluderet landmærker, spotting-buffer, fremmede oligonukleotider (SpotReport fremmede Oligo Array, La Jolla, Stratagene), poly-d [A] 40-60, laksesperma-DNA, og human COT-1 DNA. Før hybridisering blev microarray objektglas præhybridiseret i 5 x SSC, 0,05% SDS, 4% BSA-opløsning i 30 minutter ved 45 ° C, vasket to gange med RNAse-frit vand i 2 minutter, skyllet med isopropanol og spin-tørret i 3 minutter ved 1500 g. Microarray hybridiseringer blev udført natten over ved 45 ° C, under kontinuerlig omrøring, i en HS4800 Hybridisering Station (Tecan Benelux BV). Endelig blev arrays vasket automatisk i Hybridisering Station med: 2 x SSC /0,05% SDS (ved 45 ° C), 1x SSC og 0,2 x SSC (ved stuetemperatur), og tørret under en strøm af N

2, før scanning.

data ekstraktion og analyse

Arrays blev scannet i en ScanArray Express HT scanner (Perkin Elmer, Nederland BV) og spot intensiteter blev kvantificeret ved hjælp Imagene software (Bio Discovery Inc, El Sequndo , CA, USA). For at skabe balance Cy3 og Cy5 spot intensiteter, Loewess normalisering pr undergruppering blev udført ved hjælp limma-pakke (https://bioinf.wehi.edu.au/limma/) fra BioConductor (https://www.bioconductor.org) [10] , [11]. For at skalere mellem arrays, blev det globale median intensitet pr vifte sat til 1000. Dye intensiteter under 200 blev derefter tærsklingsbehandlet ved 200, at minimere støj og gøre fold-ændring på lav intensitet interval mere robust over for outliers. Steder med intensiteter under tærsklen (200) for både Cy3 og Cy5 kanaler, i mere end 50% ( 3/6) af de arrays til hver gang-kursus, blev udelukket fra analysen. Prøve til køretøj-kontrol nøgletal blev derefter beregnet og 2log forvandlet. Steder, der viste modsatrettede virkninger for dye-swap /biologiske replikater blev udelukket fra yderligere analyse; effekter blev kaldt modsat hvis middelværdien 2log ratio for de tre testede tidspunkter var ≥0,5 for et farvestof og under ≤-0,5 for farvestoffet-swap. Efter normalisering og alle de ovennævnte kvalitetskontrol blev de 2log intensitetsforhold fra begge replikater gennemsnit for hvert tidspunkt. Disse data blev lagret i SRS7 (Sequence Retrieval System version 7, Lion Bioscience AG, Heidenberg, Tyskland) [12], som også blev anvendt til sammenligninger med andre tidligere publicerede /offentligt tilgængelige databaser [13], [14], [15 ], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], [24].

Hierarkisk klyngedannelse og datavisualisering var udføres ved hjælp af Cluster og TreeView programmer (Eisen Labs: https://rana.lbl.gov), hhv. Betydning Analyse af microarrays (SAM; https://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM) blev anvendt til at bestemme, hvilke gener var statistisk forskellige mellem stimulerede prøver og ikke-stimulerede referencer. Gene ontologi klyngedannelse blev udført ved hjælp af Database til anmærkning, Visualisering og integreret Discovery (DAVID: https://david.abcc.ncifcrf.gov) [25], [26]. Den vej og funktionelle analyser blev genereret ved brug af Opfindsomhed Pathways Analysis (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).

Alle microarray data MIAMI kompatibel og er blevet deponeret i Gene Expression Omnibus repository ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), under GEO tiltrædelse nummer GSE22914.

cDNA syntese og RT-PCR-analyse

Totalt RNA blev isoleret som beskrevet ovenfor og cDNA blev syntetiseret under anvendelse af MMLV-revers transkriptase-kit og oligo (dT)

12-18 primer (Invitrogen) ifølge producentens protokol. cDNA-prøver blev opbevaret ved -20 ° C. Til validering af microarray resultater blev kvantitativ real-time PCR-analyse udført ved anvendelse af en ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). KLK2, PART1, TPD52, FKBP5, GPR88, STEAP1, TRIB1 og ID3 blev kvantificeret med Absolute QPCR SYBR Green ROX Mix (Thermo Scientific) og 330 nM af hver primer, i henhold til producentens protokol. Primere blev konstrueret under anvendelse af computerprogrammet Oligo Primer Analysis Software version 6.22 (Molecular Biology Insights Inc., USA). Gene specificitet blev kontrolleret af BLAST og så vidt muligt, intronbaserede spænder primere blev valgt for at undgå opformering af kontaminerende DNA. Primersekvenser er beskrevet i tabel 2. TMPRSS2, PSA og GAPDH blev kvantificeret ved TaqMan real-time PCR-analyse, under anvendelse af absolut QPCR ROX Mix (Thermo Scientific). TMPRSS2 (assay ID Hs00237175_m1) og GAPDH (assay ID Hs99999905_m1) kits blev anskaffet fra Applied Biosystems og kørsel ved at følge producentens instruktioner. PSA blev kvantificeret som tidligere beskrevet [8]. For hvert gen, blev en standardkurve konstrueret ud fra seriefortyndinger af en revers-transkriberet PC346 RNA pool, som derefter blev anvendt til at bestemme mængden af ​​mål-besked fra tærskelcyklus (Ct) værdi. Den GAPDH housekeeping genet blev anvendt som endogen kontrol.

Til kvantitativ PCR analyse af humant væv panel, blev normale og tumor prøver fra patienter fås fra frosne vævsbank af Erasmus Medical Center (Rotterdam , Nederlandene). Yderligere oplysninger om disse prøver blev leveret tidligere [27]. TaqMan real-time PCR-analyse blev udført i en ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) under anvendelse af AmpliTaq Gold DNA polymerase (Applied Biosystems) ifølge producentens specifikationer. Validerede primere og prober fra TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems) blev anvendt til kvantificering af ACSL3 (Hs01071247_m1), MCCC2 (Hs00223257_m1), ENDOD1 (Hs00826684_m1) og GAPDH (Hs99999905_m1), i overensstemmelse med PCR-indstillingerne leveret af Applied Biosystems. PBGD blev kvantificeret ved hjælp af 330 nM af primere forward: 5′-CAT GTC TGG TAA CGG CAA TG-3 ‘og reverse: 5′-GTA CGA GGC TTT CAA TGT TG-3’ primere, i Power SybrGreen PCR Master mix (Applied Biosystems ), ifølge termocykling protokol anbefalet af producenten. Udskrift mængder for hver prøve blev normaliseret mod gennemsnittet af to endogene referencer og i forhold til en kalibrator. De to housekeeping-gener, der anvendes som endogene referencer var PBGD og GAPDH; en blanding af cDNA’er fra prostatacarcinom xenotransplantater blev anvendt som kalibrator. Grafer og statistik blev udført med GraphPad Prism (version 3.0). P-værdier. 0,05 blev betragtet som signifikante

Resultater

Gen-ekspression mønster af PC346 celler behandlet med R1881 og hydroxyflutamid

For at karakterisere udtryk profil androgen receptor målgener i prostatacancerceller anvendte vi udtryk microarray analyse på PC346 cellelinie panel inkuberet med det androgenanalog R1881 eller antiandrogenet OH-flutamid. Det PC346 model system består af fire cellelinjer: androgen følsomme PC346C og tre hormonale terapi-resistente underlinjer, stammer fra forældrenes PC346C af langvarig androgen ablation (PC346DCC), suppleret med antiandrogen OH-flutamid (PC346Flu1 og PC346Flu2 ). Alle disse underlinjer udviser forskellige egenskaber med hensyn til AR status og reaktionsevne (opsummeret i tabel 1) [8].

I den ekspressionsanalyse vi stimulerede cellerne med 1 nM R1881 eller 1 uM OH-flutamid til 4, 8 eller 16 timer og cohybridized det mærkede RNA med sin tid-matchede køretøj (ethanol) kontrol. To mikroarrays blev udført pr tilstand, ved hjælp af to uafhængige cellepassager i farvestof-swap, for at tage højde for den biologiske variabilitet og potentielle dye-præferentiel virkninger. Tidlige tidspunkter blev valgt for at berige for primære AR mål, og minimere indirekte sekundære mål.

De to gentagelser pr tid-point blev i gennemsnit og i alt 107 differentielt udtrykte udskrifter blev udvalgt til at udgøre AR pathway signatur: 74 opreguleret og 33 nedreguleres af R1881 og /eller OH-flutamid (tabel 3, 4, 5, 6). Pletter blev anset for at være differentielt udtrykt, hvis den absolutte 2log forholdet ≥0.5 (forhold ≥1.42 eller ≤0.71) for alle tre tidspunkter, for mindst én celletype. Betydning Analyse af microarrays (SAM) blev anvendt til at bestemme, hvilke gener var statistisk forskellige mellem stimulerede prøver og ikke-stimulerede referencer. I den eksperimentelle design, valgte vi at udføre de hormonelle stimulationer på 3 forskellige tidspunkter, så udskrifter med en hurtigere eller langsommere respons ikke ville gå glip af. Men den tid effekten var ubetydelig: fleste androgen-regulerede transkripter blev differentielt udtrykt på alle tidspunkter tre tidspunkter og for den statistiske analyse besluttede vi at samle alle de 3 tidspunkter pr tilstand. I alt var der 253 SAM betydelige gener, med en falsk opdagelse sats (FDR) fastsat til 0,05 (tabel S1, S2, S3, S4). Fra vores 107 signatur udskrifter, der anses for differentielt udtrykte efter ovennævnte udvælgelseskriterier, 77 var statistisk signifikant ved SAM. Faktisk udtryk for de resterende 30 (28%) udskrifter af vores AR-target signatur varierede på tværs af de 3 tidspunkter, således at disse ikke nåede statistisk signifikans i den poolede SAM-analyse. Denne variation kan ikke forklares ved en tilsyneladende fremherskende kinetisk mønster, kan heller ikke tilskrives den 4 timer tidspunkt i særdeleshed. Da blev observeret tidsmæssig forskrift for disse par udskrifter, blev der ikke analyse udført på dynamikken i gen-ekspression variation på tværs af tid. Udtrykket nøgletal præsenteres i tabeller og figur 4 er fra gennemsnittet af alle tre tidspunkter pr tilstand. Endelig kan den omstændighed, at et betydeligt antal SAM signifikante udskrifter ikke indgik i vores AR-reguleret signatur skyldtes vores valg at indstille tærsklen 2log ratio på 0,5.

androgen-følsomme PC346C sublinie reagerede på R1881 stimulering med øget ekspression af 18 gener, mens 2 blev nedreguleret. Blandt disse er nogle velkendte AR regulerede gener, såsom KLK2, STEAP1, TMPRSS2 og FKBP5. De terapi-resistente underlinjer viste tydelige reaktioner på R1881 og OH-flutamid. PC346Flu1, som udtrykker 4 gange højere AR niveauer end den parentale cellelinje, udviste en “super-aktivering” af AR-vejen ved R1881, ikke kun i størrelsen af ​​genekspression, men også i antallet af regulerede gener (20 androgen -regulated gener i forældrenes PC346C versus 91 i PC346Flu1). Omvendt PC346DCC delområde, som udtrykker resterende niveauer af AR protein, viste ingen påviselige ændringer i genekspression efter hormon behandlinger. Hverken PC346C, PC346DCC eller PC346Flu1 viste signifikante ændringer i transkriptionel profil som reaktion på OH-flutamid. I modsætning hertil PC346Flu2 celler, som udtrykker T877A muterede AR, svarede på både R1881 og dette antiandrogen, selv om reaktionen på sidstnævnte var svagere (14 gener opreguleret af R1881 versus 8 opreguleret med OH-flutamid, tabel 3 og 5, henholdsvis)

Validering af microarray data

microarray data blev valideret af to tilgange:. en eksperimentel tilgang med kvantitativ RT-PCR, og en bioinformatik tilgang forbinder vores gen signatur til en sæt af offentligt tilgængelige databaser om androgen respons. Vi valgte 10 androgen-regulerede gener for at blive yderligere valideret af kvantitativ RT-PCR: PSA, KLK2, PART1, TPD52, GPR88, FKBP5, TMPRSS2, STEAP1, ID3 og TRIB1. Det er værd at bemærke, at vores microarray analyse ikke registrerede regulering af PSA-ekspression som reaktion på de hormonbehandlinger, men da dette er en fremtrædende AR målgen, blev det inkluderet i RT-PCR validering trin. Den kvantitative PCR-analyse bekræftede den differentielle ekspression af alle udvalgte gener i samme retning forudsagt af microarray analyse (fig. 1). Endvidere RT-PCR viste, også en stærkere virkning af hormonet-behandling på PC346Flu1 cellelinie, i modsætning til den næsten fraværende induktion af PC346DCC celler, sammenlignet med den parentale PC346C, for de fleste gener analyseret. Som observeret i mikroarray-assayet, viste PC346Flu2 ækvivalente responser til R1881 og OH-flutamid for mange regulerede gener (fig. 1, tabel 3, 4, 5, 6).

Kvantitativ RT-PCR-analyse af et sæt 10 androgen-regulerede gener i PC346 cellelinier. Celler blev stimuleret med 1 nM R1881 (R1881), 1 mM OH-flutamid (Flut) eller kontrol køretøj (DCC-FCS) i 16 timer. Graferne viser middelværdien (± SE) af den normaliserede genekspression (n.g.e.) i forhold til housekeeping-genet GAPDH, for to uafhængige cellepassager. ID3 og TRIB1 blev androgen-undertrykt i microarray-analyser, mens de andre gener var opreguleret af androgener. Vejviser

I de seneste år, en række undersøgelser der er offentliggjort som analyseret genekspression som reaktion på androgener stimulering i cellelinier og xenotransplantater (tabel 7). Af de 107 udskrifter i vores underskrift, 73 var til stede i mindst 3 af de 5 databaser og blev inkluderet til yderligere analyse. Mere end 90% af de koblede gener overlappede med tidligere rapporterede androgen-regulerede mål. Gener med de stærkeste induktioner i vores nuværende arbejde viste også konsekvent høje induktioner i flere tidligere rapporter, hvilket tyder på, at produkter af disse gener kan spille en grundlæggende rolle i den biologiske funktion af prostata (fig. 2). Ved hjælp af vores unikke cellelinje panel, var vi i stand til at identificere nye androgen-responsive gener såsom MAFB, KLF9, NFIB, STBD1, BIK og HLX.

På venstre side, PC346C, PC346Flu1 og PC34Flu2 blev udsat for 1 nM R1881 eller en uM OH-flutamid til 4, 8 og 16 timer, mens PC346DCC blev stimuleret med kun 1 nM R1881. På højre side, blev vores gen signatur vurderet i databaserne fra DePrimo

et al.

, Nelson

et al.

, Nickols

et al.

, Wang

et al.

Hendriksen

et al.

(se tabel 7 for database detaljer). Heat-map præsenteres for 2log udtryk forholdet mellem hormonbehandlede prøver og respektive tid-matchede kontroller køretøjer. Røde og grønne farver repræsenterer induktion og undertrykkelse, henholdsvis, mens sort angiver ingen regulering. Grå firkanter angiver manglende data på grund af lav udtryk, dårlig datakvalitet eller fravær af sonder for den pågældende udskrift i array platform, der anvendes til undersøgelsen. Vejviser

Biologiske processer koordineres af AR vej

de androgen-regulerede signatur gener blev klassificeret i henhold til Gene Ontology (GO) biologiske processer ved hjælp af Database til anmærkning, Visualisering og integreret Discovery (DAVID: https://david.abcc.ncifcrf.gov) [25], [26].

i overensstemmelse med de fysiologiske roller af androgener, denne fremgangsmåde vist, at AR målgener udvalgt i den foreliggende undersøgelse operere i reguleringen af ​​transkription og intracellulære signalveje, metabolismen af ​​proteiner , lipider og kulhydrater og regulering af celledeling og differentiering (fig. 3A). Den største kategori omfatter gener, der koder for transkriptionsfaktorer og transskription regulatorer, såsom NFIB, KLF9, HIF1A, MAFB, EHF, NCOR1, NCOR2, PIAS1 og flere zinkfinger proteiner (ZNF189, ZBTB10, ZBTB16 og CASZ1). Dette blev efterfulgt af gener involveret i intracellulær signaltransduktion, herunder G-proteinkoblede receptorer pathway (GPR88, RGS2, GNAI1), små GTPaser af ras-familien (RHOB, RHOU), mitogenaktiveret proteinkinase kaskade (MAP2K4, MKNK2, TRIB1) og andre protein kinaser /fosfataser (PPM1A, PPP2CB, PIK3R3, SGK1). Andre AR responsive gener har en effekt på celleproliferation gennem regulering af cellecyklus og apoptotiske processer (fx RCC1, BBX, BIK, TP53INP1). Samtidig med rollen som androgener på prostata udvikling og modning, en anden stor klynge inkluderet gener involveret i cellulær differentiering, såsom TPD52, TWSG1, NDRG1, ID1 og ID3. Endelig androgen inducerede metabolismen af ​​proteiner, kulhydrater og lipider, der bidrager til produktion og sekretion af prostata væske. Sådanne R1881 målgener inkluderet MTHFD1, PSPH, PSAT1 og MCCC2, der koder enzymer i metabolismen af ​​methionin, serin og leucin aminosyrer. Endvidere opregulering af translationsinitiering faktor EIF2C3 potentielt fremmer peptidsyntese. Desuden gener, der deltager i protein foldning (PDIAS5, FKBP5), glykosylering (FUT8, GALNT1) og handel (DMN1L, KDELR2) blev også reguleret af R1881. Bortset fra proteiner og aminosyrer, prostata væske er også rig på lipider, polyaminer, sorbitol og flere metalioner. Faktisk R1881 stimulerede også ekspression af ACSL3 og ELOVL5, der deltager i forlængelse af fede-syrer, spermin synthase (SMS), en del af polyaminen syntesevej, sorbitol dehydrogenase (Sord), der udskilles af prostata i sædvæsken, og de ionkanaler ACCN4 og KCNJ10.

(A) Pie-graf, der repræsenterer gener kategoriseret efter mest fremtrædende biologiske funktion. Gene ontologi anmærkninger blev udvundet ved hjælp af DAVID [25], [26]. (B) Inddragelse af AR pathway gener i sygdom bestemmes ved hjælp Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).

For at automatisere den funktionelle klassificering, kvantificere graden af ​​berigelse af hvert klynge og vælg statistisk signifikante funktionelle kategorier, vi brugte den DAVID Funktionel Annotation Clustering værktøj. Dette værktøj identificeret 6 statistisk signifikante Annotation klynger, der er forbundet med metabolismen af ​​organiske syrer (lipider og aminosyrer), apoptose, celledifferentiering, udviklingsprocesser, regulering af transskription og regulering af cellulære processer (tabel 8).

inddragelsen af ​​androgen-regulerede gener i patologiske tilstande blev yderligere undersøgt ved hjælp af Ingenuity database (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com). De stærkeste foreninger blev fundet for kræft, reproduktive system, dermatologisk og hjertekarsygdomme (fig. 3B).

AR vej i prostatakræft udvikling og progression

For at undersøge, hvordan AR pathway er moduleret under udviklingen og progressionen af ​​prostatakræft vi knyttet vores androgen-reguleret gen signatur til syv uafhængige prostata kræft microarray databaser. Disse undersøgelser omfattede eksemplarer af “normal prostata” og prostata tumorer fra forskellige sygdomstilstande etaper, hvis vigtigste karakteristika er sammenfattet i tabel 7. I alt 89 hormon-responsive gener var til stede i mindst 4 af de 7 databaser, og blev udvalgt til yderligere analyse. I figur 4, viser vi den hierarkiske gruppering af de R1881-responsive gener (første blok af 4 kolonner), ved siden af ​​primær kræft versus normal prostata (anden blok), metastase versus primær cancer (tredje blok), og endelig tilbagevendende versus ikke- tilbagevendende og hormonbehandling-resistente versus hormon-naive sygdom (fjerde blok). PC: prostatakræft;