PLoS ONE: Klinisk Validering af en PCR analyse til påvisning af EGFR mutationer i ikke-småcellet lungekræft: Retrospective Test af Prøver fra EURTAC Trial

Abstrakt

EURTAC forsøg har vist, at tyrosinkinasen inhibitor (TKI) erlotinib var overlegen i forhold til kemoterapi som første-linje behandling for avancerede ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), som havnen

EGFR

aktiverende mutationer i en overvejende kaukasisk population. Baseret på EURTAC og flere asiatiske forsøg anti-

EGFR

TKI’er er standard for pleje af

EGFR

mutation-positiv NSCLC. Vi søgte at validere en hurtig multiplex

EGFR

mutation assay som en følgesvend diagnostisk assay til at vælge patienter til denne behandling. Prøver fra EURTAC forsøget blev prospektivt screenet for

EGFR

mutationer ved hjælp af en kombination af laboratorie-udviklede tests (LDTs) og testet med tilbagevirkende kraft med cobas

EGFR

mutation test (

EGFR

PCR-test).

EGFR

PCR testresultater blev sammenlignet med de oprindelige LDT resultater og Sanger sekventering, ved hjælp af en delmængde af prøver fra patienter screenet for forsøget. Resterende væv var tilgængelig fra 487 (47%) af de 1044 patienter screenet for forsøget.

EGFR

PCR test viste høj konkordans med LDT resultater med et 96,3% samlet aftale. Det kliniske resultat af patienter, der var

EGFR

-mutation opdaget af

EGFR

PCR test var meget lig den hele EURTAC kohorte. Den overensstemmelse mellem

EGFR

PCR-test og Sanger sekventering var 90,6%. I 78,9% af de uoverensstemmende prøver,

EGFR

PCR-testresultatet blev bekræftet af en følsom dyb sekventering assay. Denne retrospektive undersøgelse viser den kliniske anvendelighed af

EGFR

PCR test i præcis udvælgelse af patienter til anti-

EGFR

TKI-terapi.

EGFR

PCR-test viste forbedret ydeevne i forhold til Sanger sekventering

Henvisning:. Benlloch S, Botero ML, Beltran-Alamillo J, Mayo C, Gimenez-Capitán A, de Aguirre I, et al. (2014) Klinisk Validering af en PCR analyse til påvisning af

EGFR

Mutationer i ikke-småcellet lungekræft: Retrospective Test af Prøver fra EURTAC Trial. PLoS ONE 9 (2): e89518. doi: 10,1371 /journal.pone.0089518

Redaktør: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center på Dallas, USA

Modtaget: 23, 2013; Accepteret: 21 januar 2014; Publiceret: 25 feb 2014

Copyright: © 2014 Benlloch et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af Roche. De finansieringskilderne bidraget til undersøgelsen design, dataindsamling, analyse, beslutning om at offentliggøre og forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. BK, MS, WB, DC, GZ, JFP, LW er alle nuværende medarbejdere i Roche . BK, DC, JFP og LW har lager beholdning i Roche. BK og HJL er tidligere Roche medarbejdere og HJL har lager i Roche og har tjent som en betalt konsulent. FS var en betalt konsulent til Roche. SB, JBA, CM, AGC er nuværende medarbejdere i Pangaea Biotech. MLB er en tidligere Pangaea medarbejder. MT og SRyC har lager bedrifter i Pangaea Biotech. Ida, CQ, JLR er nuværende medarbejdere i Medical Oncology service-ICO, Sygehus tyskere Trias i Pujol. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Effekten af ​​mange roman målrettet kræftbehandling kan forudsiges ved påvisning af specifikke biomarkører i tumoren. FDA har tilkendegivet, at hvis identifikation af en specifik biomarkør er nødvendig for sikker og effektiv administration af et lægemiddel, der er et godt valideret FDA godkendt følgesvend diagnostisk analyse kræves for dette lægemiddel. Den optimale godkendelse vej for en ny målrettet terapi og dens følgesvend diagnostik er en parallel udviklingsproces klinisk, der involverer kliniske forsøg for det undersøgte stof, hvor det undersøgte diagnostiske test bruges til enten vælge patienter til forsøgene eller til at forudsige respons på behandling, og ender ideelt med sundhedsmyndighed godkendelse af lægemidlet samtidige og følgesvend diagnostiske. Vellykkede eksempler på dette omfatte fælles udvikling (og co-godkendelse) af BRAF-hæmmer vemurafenib og dens følgesvend diagnostisk BRAF V600E mutation assay for BRAF-mutant metastatisk melanom [1], og ALK-hæmmer crizotinib og dens følgesvend diagnostisk ALK fusion gen test i avanceret ALK-fusion positive ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) patienter. [2], [3], [4]

Men i nogle tilfælde, prædiktive biomarkører for en målrettet terapi indregnes ikke indtil efter at lægemidlet er først godkendt. Som et eksempel, anti

EGFR

antistof cetuximab først blev godkendt i USA til behandling af metastatisk kolorektal cancer i 2004. Talrige retrospektive og prospektive forsøg senere afsløret, at tumorer huser

KRAS

mutationer var meget usandsynligt at reagere på cetuximab. I juli 2009, FDA krævede ændringer i mærkningen for cetuximab og anden anti-

EGFR

antistof panitumumab kræver, at indikationer og forbrug tilstand var der ingen behandling fordel med lægemidler til patienter, hvis tumorer havde

KRAS

mutationer i codon 12 eller 13, på et tidspunkt hvor der ikke var nogen FDA-godkendt diagnostiske analyser for

KRAS

mutationer. [5] Kun senere, i juli 2012, gjorde en

KRAS

mutation assay modtage FDA-godkendelse, baseret på resultaterne af et prospektivt randomiseret forsøg, fremhæver de udfordringer, efterfølgende validering af en kammerat diagnostisk assay efter de pivotale lægemiddelforsøg er afsluttet. [6]

anti-

EGFR

TKI erlotinib blev oprindeligt godkendt til alle patienter med fremskreden NSCLC, som havde udviklet sig på første linje kemoterapi. En række efterfølgende undersøgelser fastslået, at patienter med

EGFR

-mutant NSCLC havde en høj sandsynlighed for at reagere på disse TKI, hvilket fører til forsøg i indstillingen første linje til

EGFR

-mutant kræft. [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13] Fire prospektive randomiserede kliniske forsøg undersøgt i asiatiske befolkningsgrupper viste, at erlotinib og gefitinib resulterede i forbedret progressionsfri overlevelse i forhold til kemoterapi for første linie behandling i NSCLC patienter med

EGFR

mutationer. [7], [8], [9], [13] Andre kliniske studier i blandede etnicitet kohorter har indgået med lignende resultater. [10], [12]

EURTAC forsøget var en randomiseret fase 3 forsøg til vurdering af sikkerhed og effekt af erlotinib sammenlignet med standard platinbaseret kemoterapi for første linie behandling af en patientgruppe med avanceret

EGFR

-mutation opdaget NSCLC i en stort set kaukasisk population af europæiske patienter. Erlotinib-behandlede patienter oplevede betydelige forbedringer i median PFS (9,7 måneder versus 5,2 måneder) sammenlignet med kemoterapi. Patienter på erlotinib armen havde også en betydeligt højere procentdel af svarene (58% vs. 15%) i intent-to-treat population. Er blevet indsendt [11] Denne retssag for første linje indikation af erlotinib i

EGFR

muterede NSCLC patienter.

De fleste aktivere

EGFR

mutationer er placeret i exon 19 (45%) og 21 (40-45%). [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20] retningslinjer fra organisationer som ASCO, CAP /AMP, og NCCN anbefaler brugen af ​​anti-

EGFR

TKI’er som første-line behandling af patienter med

EGFR

-mutant fremskreden NSCLC baseret på resultaterne af disse pivotale kliniske forsøg. [21], [22], [23] De seneste anbefalinger fra CAP /IASLC /AMP rådgive identifikation af EGFR-mutationer til stede på 1%, hvoraf exon 19 sletninger og en exon 21 mutation (L858R) tegner sig for mere end 90% af alle mutationer. [24] Ingen af ​​de retningslinjer, angiver test, der skal anvendes, men de cobas

EGFR

Mutation test er CE-IVD godkendt og er for nylig FDA godkendt. [25]

Her præsenterer vi den retrospektive analyse af et klinisk validering undersøgelse af

EGFR

PCR test på en delmængde af lungekræft prøver fra patienter screenes for EURTAC forsøget.

EGFR

PCR-test viste forbedret prøve workflow i forhold til de LDTs ​​anvendes i EURTAC forsøget, så

EGFR

mutation screening i et enkelt assay med en en-dags turn-around tid.

EGFR

PCR test viste overlegen sensitivitet og specificitet sammenlignet med konventionel Sanger sekventering.

Metoder

De vigtigste mål undersøgelsen var 1) at korrelere de kliniske resultater (PFS, Borr ) fra undergruppen af ​​tilgængelige prøver pr

EGFR

PCR test til resultaterne fra hele EURTAC befolkning, og 2) at sammenligne den analytiske ydeevne

EGFR

PCR-testen med den for den oprindelige LDT og Sanger sekventering, ved hjælp af massivt parallelle pyrosekventering (MPP) for at løse uoverensstemmelser observeret mellem de øvrige 3 testmetoder.

i EURTAC forsøget, 1.044 patienter fra hospitaler i Frankrig, Italien og Spanien blev screenet ved hjælp af den LDT. Til denne undersøgelse blev alle prøver retrospektivt analyseret under IRB godkendelse fra Copernicus IRB (00.001.313). Stedsspecifikke IRB godkendelse fra hvert klinisk sted og skriftligt samtykke fra alle patienter blev opnået forud for forsøgets gennemførelse fase af NCT00446225. [11], [26] I 487 tilfælde resterende prøver var tilgængelige for genprøvning med

EGFR

PCR-testen (Figur 1). Et enkelt 5 um sektion med mindst 10% tumor indhold fra hver af de 487 prøver blev anvendt til

EGFR

PCR-test. Genomisk DNA fra eksisterende eluat eller udvindes fra yderligere sektioner blev testet på Sanger sekventering og MPP. Tabel 1 viser demografien for de patienter, screenet for EURTAC retssagen ved LDT, sub-kategoriseret efter patienter testet eller ikke testet af

EGFR

PCR-test. Patienter indskrevet i EURTAC forsøget blev udvalgt ved hjælp af et laboratorium udviklet test, valideret af Laboratory of Oncology (ICO-Hospital tyskere Trias i Pujol, Badalona, ​​Spanien), der består af tre metoder. [26] I denne undersøgelse en enkelt PCR- baseret assay til påvisning

EGFR

mutationer blev anvendt. Nærmere oplysninger om den analytiske ydeevne dette assay er tidligere beskrevet [27]

E1 prøver:. Tumor blok ikke tilgængelig for analyse. E2 prøver: tumormateriale utilstrækkelig til analyse. LDT = laboratorie-udviklet test.

Statistiske overvejelser

Mutation Detected (MD) blev defineret som tilstedeværelse af enten en exon 19 sletning eller L858R mutation. Mutation ikke påvist (MND) blev defineret som fravær af begge exon 19 deletioner og L858R mutation. SAS /STAT® software blev anvendt til alle dataanalyse.

studere statistik

kliniske resultat

Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev anvendt til at vurdere PFS ved behandling metode (kemoterapi eller erlotinib) blandt patienter, der blev indskrevet i EURTAC forsøg og screenet med LDT samt den delmængde af patienter, som blev bestemt til at være mutation-positive af

EGFR

PCR-test. Parametrisk log-rank test blev udført for at vurdere PFS mellem patienter, som blev randomiseret til kemoterapi eller erlotinib. Den hazard ratio (kemoterapi vs. erlotinib) i forhold til PFS blev også beregnet. Bedste respons var den bedste respons registreres fra starten af ​​behandlingen indtil sygdomsprogression og Borr (Best samlede responsrate) blev sammenfattet med 95% konfidensgrænser ifølge Pearson-Clopper metoder baseret på efterforskere vurdering for hver behandling arm.

analytisk effektivitetsstatistikker

for analytisk ydeevne, blev udført en aftale analyse mellem

EGFR

PCR-testresultatet og LDT test. Mutation detektion af exon 19 deletioner og L858R mutationer blev analyseret samlet. Separat blev

EGFR

PCR-test også sammenlignet med Sanger sekventering og MPP af en CLIA-certificeret laboratorium. For aftalen analyser, blev den positive procent aftale (PPA), negativ procent aftale (NPA), og den samlede procent aftale (OPA) med deres tilsvarende 95% konfidensintervaller (CIS) beregnes. Desuden 3-vejs-analyser ved hjælp af MPP som en anden referencemetode blev udført for at løse uoverensstemmelsen resultater.

Mutation prøvningsmetoder

EGFR PCR test.

EGFR

PCR test (cobas

EGFR

Mutation test, Roche Molecular Systems, Inc, Branchburg, NJ, USA) er en CE-IVD mærket multiplex allel-specifik PCR-baserede assay designet til at detektere 41 mutationer i exonerne 18, 19, 20 og 21 i FFPET enheder af humant NSCLC. [28] DNA isoleres under anvendelse af cobas DNA Sample Preparation Kit (Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ). [29] Et minimum på 150 ng af genomisk DNA er påkrævet for PCR-amplifikation, som typisk kan isoleres fra en enkelt 5 um FFPET sektion.

EGFR

PCR test softwareversion anvendt i denne undersøgelse blev designet til at detektere 29 deletioner i exon 19 og 2 L858R varianter i exon 21. Macrodissection anbefales kun, hvis tumor er mindre end 10%; laser capture microdissection er ikke påkrævet.

EGFR

PCR blev udført pr producentens indlægsseddel og resultaterne blev automatisk analyseret og rapporteret. Detektionsgrænsen er valideret til 5% mutant alleler. Arbejdsgangen fra DNA isolation til resultaterne rapportering kan udføres i en periode på 8 timer. [27]

LDT.

Patienterne i EURTAC undersøgelsen blev screenet ved hjælp af en kombination af metoder udviklet af Laboratoriet for Oncology, ICO-Hospital tyskere Trias i Pujol, Barcelona, ​​Spanien. [11] kort sagt, EGFR-aktiverende mutationer i exon 19 og 21 blev oprindeligt identificeret af Sanger sekventering og bekræftet af fragment længde analyse for exon 19 sletninger (FAM-mærket primer i en ABI prisme 3130 DNA-analysator (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) og af Taqman assay for exon 21 (L858R) mutation. Alle tumorprøver var fra den oprindelige biopsi taget forud for enhver behandling og før randomisering. Testning blev udført på ≥ 2mm

2 af væv opnået fra en til tre lysbilleder af 4-micron vævssnit, der har gennemgået laser capture microdissection at berige for tilstedeværelse af tumorceller. DNA blev ekstraheret under anvendelse af en standard laboratorieprotokol og testet på et enkelt sted i Spanien i Laboratoriet for Oncology for

EGFR

aktiverende mutationer i exon 19 og 21 ved hjælp af en tidligere beskrevet metode. Den gennemsnitlige ekspeditionstid var ca. 5 dage. [26]

Tovejs Sanger sekventering.

Alle testet af

EGFR

PCR-test blev også testet af Sanger sekventering prøver anvendelse af DNA fra FFPET prøver fremstillet ved cobas DNA Sample Preparation Kit og sekventeret med 2 x tovejs Sanger sekventering ved en CLIA-certificeret laboratorium (SeqWright, Houston, TX, USA) under anvendelse af en valideret protokol. Gentag Sanger sekventering blev udført for at sammenligne påvisningen af ​​

EGFR

mutationer fra tilstødende sektioner af væv for at minimere eventuelle virkninger af væv heterogenitet anvendes til

EGFR

PCR-test i forhold til de oprindelige LDT resultater. Også, sekventering protokoller varierer fra laboratorium i form af procent tumor indhold /prøve, der kræver macrodissection. DNA isoleret med cobas DNA Sample Preparation Kit og anvendes til sekventering kræves ≥10% tumor indhold. Gennemsnitlig behandlingstid til resultaterne var 7 dage. Den anslåede detektionsgrænse er ca. 20% mutant alleler. [30]

Massively parallel pyrosekventering (MPP).

Prøver med gyldige

EGFR

PCR testresultater med tilstrækkelig DNA tilbage fra den indledende ekstraktion blev testet ved en MPP metode (454 GS Titanium, 454 Life Sciences, Branford, CT, USA) en CLIA-certificeret laboratorium (SeqWright, Houston, TX, USA) ved hjælp af en valideret protokol. [31] Denne metode er en 5-7 dages proces, der involverer amplicon generation, pooling, ligering, emulsion PCR, amplifikation og massivt parallelle pyrosekventering med manuel dataanalyse. Den anslåede detektionsgrænse for analysen er 1,25% mutant alleler. [27] MPP fremgangsmåde blev anvendt til påvisning af virkning af EGFR PCR test til en mere følsom metode, og som mægler for afvigende tilfælde observeret mellem LDT eller gentagelsen Sanger-sekventering. For at bevare patientens privatliv i forbindelse med testede kliniske prøver, blev rå MPP sekventeringsresultaterne anonymiseret og præsenteres i tabel S1.

Resultater

Specimen demografi

487 (47%) af 1.044 prøver screenet for EURTAC undersøgelse med LDTs ​​var tilgængelige for afprøvning ved hjælp af

EGFR

PCR-test. Strømmen af ​​prøver gennem studiet er vist i figur 1. Patientdemografi og baseline tumor egenskaber for alle patienter med LDT status er vist i tabel 1. Der var ingen signifikante forskelle mellem undergrupper af testede patienter og patienter ikke testet af

EGFR

PCR-test (p 0,05) for hver LDT status (mutation opdaget, mutation ikke detekteret), med undtagelse af landet af screeningen klinik

Kliniske resultater for patienter, baseret på EGFR PCR testresultater.

af de 174 patienter, der deltog i EURTAC forsøg, prøver fra 134 (77%) patienter var tilgængelige for afprøvning ved hjælp af

EGFR

PCR-test. Eksklusive 11 patienter med ugyldige

EGFR

PCR testresultater og 7 patienter med et resultat af

EGFR

mutation ikke opdaget, i alt 116 (67%) patienter blev mutation opdaget af

EGFR

PCR-test og evaluerbare for klinisk resultat analyse (57 patienter i kemoterapi armen og 59 i erlotinib armen). Kliniske udfald (PFS, Borr, og OS) er præsenteret i tabel 2. Blandt

EGFR

PCR test positive patienter, der blev behandlet med erlotinib havde en signifikant forlænget progressionsfri overlevelse sammenlignet med patienter behandlet med kemoterapi (p-værdi den mediane PFS var 10,4 måneder (95% CI: 8,0 til 13,8 måneder) og 5,4 måneder (95% CI: 4,4 til 6,8 måneder) for patienter behandlet med erlotinib eller kemoterapi, henholdsvis (figur 2). HR baseret på Cox proportional hazards model blev reduceret med 66% (HR 0,34; [95% CI 0,21 til 0,54]) for patienter i erlotinib versus kemoterapi arm. Et år efter randomisering, en højere procentdel af patienterne i erlotinib sammenlignet med kemoterapi armen var event-fri (45% [95% CI: 32% til 59% versus 6% [95% CI: 0% til 15%], henholdsvis)

borr var højere hos patienter i erlotinib armen (59,3% [95% CI: 45,7% til 71,9%].), sammenlignet med kemoterapi armen (14,0% [95% CI: 6,3% til 25,8%]). Patienterne i erlotinib armen var langt mere tilbøjelige til at reagere på behandlingen end patienter i kemoterapi arm (odds ratio på 8,93, [95% CI: 3,59-22,19])

Der var ingen signifikant forskel i OS imellem. behandlingen arme (25,8 måneder i erlotinib armen (95% CI: 16,1-30,0) og 20,8 måneder i kemoterapi armen (95% CI: 17,3-29,4) (log-rank test p-værdi = 0,5381))

PFS, borr og OS resultater for

EGFR

PCR test positive patienter adskilte sig ikke væsentligt fra dem, der opnås i alle patienter indskrevet i EURTAC retssag, der tyder på, at

EGFR

PCR-test positive patienter er repræsentative for alle EURTAC inkluderede patienter.

for de 7 tilfælde, hvor

EGFR

PCR-testresultatet blev mutation ikke opdages og afvigende med LDT, to tilfælde løst til fordel for LDT af MPP, tre tilfælde løst til fordel for

EGFR

PCR-test og en prøve var ugyldig for både Sanger og MPP og den anden var i aftale mellem

EGFR

PCR-test og Sanger, men ikke MPP (tabel S2). Anekdotisk, 6 af de 7 patienter blev behandlet med erlotinib og kun én patient opnåede større end eller lig med median PFS baseret på LDT eller

EGFR

PCR-test.

Sammenligning af EGFR PCR-test og LDT resultater

Blandt 432 prøver med gyldige resultater fra både

EGFR

PCR-test og LDT, PPA, NPA og OPA var 94,2% (146/155, CI: 89,3%, 96,9 %), 97,5% (270/277, CI: 94,9%, 98,8%), og 96,3% (416/432, CI: 94,1%, 97,7%) (tabel 3). Der var således en stor overensstemmelse mellem den oprindelige LDT og

EGFR

PCR testresultater. Blandt seksten prøver med uoverensstemmende resultater, de

EGFR

PCR-testresultatet blev bekræftet af MPP i 68,8% (11/16) tilfælde (tabel S3).

Sammenligning af EGFR-PCR testresultater med Sanger sekventering

af 487 prøver blev testet ved hjælp af

EGFR

PCR-test og Sanger sekventering, 406 gav gyldige resultater ved begge metoder (38 var ugyldige ved begge metoder, fem var ugyldige af

EGFR

PCR-test og 38 blev ugyldige af Sanger sekventering). PPA, NPA og OPA for

EGFR

PCR-test sammenlignet med Sanger sekventering var 96,6% (112/116, CI: 91,7%, 98,7%), 88,3% (256/290, CI: 84,1%, 91,5 %), og 90,6% (368/406, CI: 87,4%, 93,1%; tabel 4), henholdsvis. Blandt 38 uoverensstemmende resultater mellem de

EGFR

PCR-test og Sanger sekventering, MPP aftalt med

EGFR

PCR-testresultatet i 30 (78,9%) tilfælde (Tabel S4). Sanger sekventering opdaget en L858R ikke opdaget af MPP og undlod at opdage 22 exon 19 sletninger og 7 L858R mutationer bekræftet af MPP. Fire MPP resultater var ugyldige, og de resterende fire resultater er aftalt med Sanger. Rækken af ​​procent mutant alleler af de sager, savnet af Sanger var 3% til 60%, med flere eksemplarer (n = 16) under den estimerede detektionsgrænse for Sanger.

Diskussion

Denne undersøgelse understøtter muligheden for at udføre en retrospektiv klinisk validering af en kammerat diagnostisk fra potentielle, terapeutiske kliniske forsøg.

EGFR

PCR testresultater var meget overensstemmende ( 96%) med LDT resultater bruges til at vælge patienter til EURTAC forsøget. Som en konsekvens, PFS og Borr af undergruppen af ​​patienter med

EGFR

mutationer detekteret med

EGFR

PCR-test var sammenlignelige med den fulde kohorte af patienter, der deltog i EURTAC retssagen, således at validere brug af

EGFR

PCR-test for at vælge patienter til behandling med anti-

EGFR

TKI’er såsom erlotinib. Median PFS overlevelse var 9,7 versus 10,4 måneder for erlotinib gruppen og 5.2 versus 5,4 måneder for de LDTs ​​og

EGFR

PCR-test, hhv. Den Borr var 58% mod 59,3% måneder for erlotinib-gruppen og 15% mod 14,0% for LDTs ​​og

EGFR

PCR-test, hhv. Blandt de 16 disharmoniske prøver mellem

EGFR

PCR-test og LDTs, en tredje mutation testmetode aftalt med

EGFR

PCR-testresultatet i 11 tilfælde. Af syv sager, der blev mutation opdaget af

EGFR

PCR-test og mutation ikke opdaget af LDT, fem blev bekræftet af MPP. Disse patienter kunne have potentielt nydt godt af anti-

EGFR

TKI-terapi.

EGFR

PCR-test havde en række tekniske fordele i forhold til LDT anvendes i EURTAC forsøget. Den LDT krævede laser capture mikrodissektion af flere vævssnit og involverede 3 separate analyser med en median behandlingstid på 4,5 dage. Til sammenligning

EGFR

PCR-test kræves macrodissection kun hvis tumor indholdet var 10% og kan udføres på én dag ved hjælp af en enkelt 5 um sektion. Endvidere

EGFR

PCR-testen er et kommercielt tilgængeligt kit-baseret assay, som tilvejebringer en automatiseret resultat, i stedet for en manuel proces genstand for fortolkning, og som kan udføres af enhver kvalificeret klinisk laboratorium.

mere end 80% af de testede i denne undersøgelse prøver var små biopsiprøver. Den samlede ugyldig sats for Sanger sekventering var 15,6% (76/487) i forhold til

EGFR

PCR analyse ved 9% (43/487). Men den ugyldige sats for den delmængde af prøvemateriale fra resektion prøver var 0% (0/109) sandsynligvis på grund af tilstrækkelig væv tilgængelighed. Således assayet er yderst robust, når udført på reseceret tumorprøver og har en ca 90% succesrate på biopsiprøver, som ofte er den eneste tumorprøve tilgængelige til test i NSCLC.

Sanger-sekventering har været meget anvendt til opdage

EGFR

mutationer. [30], [32] Svarende til de overordnede ugyldige satser, for 134

EGFR

mutation detekteret LDT prøver indskrevet i EURTAC forsøget, Sanger sekventering havde en højere ugyldig sats (15,7%) sammenlignet med 8,2% for

EGFR

PCR-test. Der var også 30 mutation ikke påvises resultater for Sanger sekventering (22,4%) og 7 mutation ikke registreret resultater for

EGFR

PCR test (5,2%). Med 21 ugyldige resultater og 30 mutation ikke påvises resultater, ville Sanger sekventering have fejlklassificeres 38% af patienterne i den EURTAC forsøget. Lignende ugyldige satser er blevet rapporteret i tre andre studier, hvilket antyder, at denne metode har begrænsninger, når de anvendes til DNA fra FFPET prøver. [33], [34], [35] Desuden har Sanger-sekventering vist ringe følsomhed i prøver indeholdende mindre end 20-25% mutant alleler. [35], [36], [37] Når vi sammenlignet aftalen mellem gyldige resultater for

EGFR

PCR test med Sanger sekventering (n = 406), der var 38 uharmonisk tilfælde af hvilke 30 blev bekræftet af MPP. Tyve-ni af de 30 sager resulterede i mutation opdaget status af

EGFR

PCR-test og ville gøre disse patienter er berettiget til anti-

EGFR

terapi. Dårlig følsomhed Sanger sekventering forklarer således den relativt lave NPA sammenlignet med

EGFR

PCR-test observeret i denne undersøgelse.

I betragtning af den kritikalitet

EGFR

mutation test i at vælge specifikke behandlinger for livstruende kræftformer såsom fremskreden NSCLC, robuste og præcise analyser med hurtig ekspeditionstid foretrækkes. Nylige kvalitetssikring forsøg for at fastslå mutation status for en standard panel af tumorer har vist, at forskellige kliniske laboratorier ikke korrekt identificerer mutationen status på 100% af paneldeltagerne, selv når de bruger de samme eller lignende testmetoder. [38 ], [39] for analyser, der involverer mutation analyse af tumor prøver, vigtige faktorer, der bidrager til analysen ydeevne omfatter analytisk standardisering, validering af reagenser og metoder, laboratorieudstyr erfaring, og den passende inddragelse af patolog.

i konklusion, resultater af denne undersøgelse indikerer, at cobas

EGFR

mutation test er en meget robust og meget præcise følgesvend diagnostisk assay til at vælge patienter til behandling med anti-

EGFR

behandlingsformer såsom erlotinib.

Støtte oplysninger

tabel S1.

Notering af MPP Resultat

doi:. 10,1371 /journal.pone.0089518.s001

(PDF)

tabel S2.

Resultatet fra prøver afvigende mellem cobas EGFR PCR test og LDT, der blev indskrevet i det kliniske forsøg (cobas MND /LDT MD)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0089518.s002

(PDF)

tabel S3.

aftale resultater mellem disharmoniske EGFR PCR og LDT tests

Doi:. 10,1371 /journal.pone.0089518.s003

(PDF)

Tabel S4.

MPP skyldes opløsning analyse af uharmoniske prøver mellem EGFR PCR-test og Sanger sekventering

doi:. 10,1371 /journal.pone.0089518.s004

(PDF)

Tak

Vi vil gerne anerkende Patrick O’Donnell og Karen Yu for deres bidrag til denne undersøgelse.