Abstrakt
Humane tyktarmskræft almindeligt havnen tab af funktion mutationer i APC, en repressor af den kanoniske WNT vej, hvilket fører til hyperaktiv WNT-TCF signalering. Re-etablering af Apc funktion i mus, manipuleret til betinget undertrykke Apc gennem RNAi, løse intestinale tumorer dannet på grund af hyperaktiveret Wnt-Tcf signalering. Disse og andre resultater har bedt søgningen efter specifikke Wnt pathway antagonister som lægemidler til klinisk problematiske menneskelige kolon kræft og tilknyttede metastaser, som fortsat stort set uhelbredelig. Denne bredt accepteret synspunkt synes i modstrid med en række konstateringer bruger patient-afledt materiale: Canonical TCF mål undertrykt, i stedet for at blive hyperaktiveret, i avanceret tyktarmskræft, og undertrykkelse af TCF fungerer ikke normalt resulterer i tumorregression i xenotransplantater. Resultaterne af en række genetiske mus undersøgelser har også foreslået, at kanoniske WNT-TCF signalering drev metastaser, men direkte in vivo tests mangler, og, overraskende kan TCF undertrykkelse forbedre direkte podet metastatisk vækst. Her har vi rettet evner forbedret og blokerede WNT-TCF signalering at ændre tumorvækst og fjernmetastaser hjælp xenografter af avancerede humane tyktarmskræft hos mus. Vi finder, at endogene WNT-TCF signalering er for det meste anti-metastatisk da nedregulering af TCF funktion med dnTCF generelt forbedrer metastatisk spredning. Konsekvent, hæve niveauet af WNT signalering, ved at øge niveauet af Wnt ligander, er generelt ikke pro-metastatisk. Vores nuværende og tidligere data viser en heterogen reaktion på modulerende WNT-TCF signalering i humane cancerceller. Ikke desto mindre er resultaterne, at en brøkdel af tyktarmskræft testede kræver WNT-TCF signalering for tumorvækst, men alle reagerer på undertrykt signalering ved at øge metastaser tigge om en revurdering af målet om at blokere WNT-TCF signalering til universelt behandle tyktarmskræft. Vore data antyder, at WNT-TCF blokade kan være effektive til inhibering af tumorvækst i kun en delmængde af tilfælde, men vil generelt øge metastaser
Henvisning:. Seth C, Ruiz i Altaba A (2016) metastaser og Colon Cancer Tumor vækst Display Forskellige reaktioner på Modulering af Canonical WNT signalering. PLoS ONE 11 (3): e0150697. doi: 10,1371 /journal.pone.0150697
Redaktør: Michael Klymkowsky, University of Colorado, Boulder, UNITED STATES
Modtaget: 30 oktober, 2015; Accepteret: 18 februar 2016; Udgivet: Marts 3, 2016
Copyright: © 2016 Seth, Ruiz i Altaba. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret
Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra den schweiziske National Foundation, EU-FP7 konsortiet HEALING, den schweiziske Cancer League og departementet d’Instruction Publique de Genève til ARA. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
der er en stor mængde beviser, der understøtter den opfattelse, at WNT signalering er kritisk for humane kolon kræft, som måske bedst eksemplificeret ved to vigtigste resultater i- det store flertal af tyktarmskræft havnen mutationer i tumor suppressor APC, et centralt WNT-TCF pathway antagonist [1], og II restaurering af Apc funktion i
apc
kompromitterede mus resulterer i tab af intestinale tumorer [2]. Disse og andre resultater har fremmet en søgning efter terapeutiske WNT-TCF blokkere til universelt behandle humane coloncancerformer med hyperaktiv kanoniske WNT signalering (for eksempel [3]). I betragtning af at APC er indtil videre ikke druggable, at indsatsen udvikle WNT-TCF-antagonister har centreret om trin opstrøms (f.eks Porcupine og Tankyrase hæmmere [4-6] eller nedstrøms (CBP blokkere [7], Ivermectin [8]) fra APC funktion i ß-cateninkomplekset ødelæggelse kompleks. Uafhængigt af trin målrettet, mange skærme eller validering analyser har brugt en TCF-luciferase reporter til at overvåge kanoniske WNT pathway svar [9].
de linjer af beviser sammenfattet ovenfor tyder a. robust indsats WNT-TCF signalering i slutningen stage tyktarmskræft og kan give en overbevisende sag for udvikling og anvendelse af kanoniske Wnt antagonister, et centralt fund er imidlertid i strid med denne almindelige opfattelse: udtrykket af WNT-TCF mål er undertrykt-ikke forbedret-i avanceret kolon kræft og metastaser i forhold til fase tumorer tidligt [10], [11].
WNT-TCF signalering er også almindeligt menes at drive metastaser (f.eks [12]) , fremme podning potentiale af cirkulerende tumorceller og øge ligand-medieret signalering i den metastatiske niche [13], [14]. Det er dog bemærkelsesværdigt, at ingen direkte test til accepterede evne forbedret kanonisk WNT-TCF-signalering at fremme metastaser fra human coloncancer-celler er blevet rapporteret. Det bedste bevis for en rolle kanonisk WNT signalering i tyktarmskræft metastaser stammer fra studier med mus [13], [14] eller fra in vitro analyser (f.eks [15], [16]), og andre undersøgelser indebærer en gennemprøvet rolle for forbedret WNT signalering i metastaser (fx [17]). Men under forudsætning af in vivo funktion fra in vitro-data, eller humanbiologi fra mus data, kan være problematisk, da mus og mennesker er temmelig fjernt arter, og in vitro betingelser kan pålægge en WNT-afhængighed til humane colon cancerceller [10].
Eksperimentelt undertrykkelse af kanoniske WNT signalering er blevet forsøgt ved at blokere TCF-funktion, som er det sidste trin af kanoniske WNT signalering. Undertrykkelse af WNT-TCF signalering med pan dominant negative TCF (dnTCF4), vist at være effektive in vitro på humane coloncancer-celler (f.eks [18]), er paradoksalt nok generelt ineffektive til at undertrykke tumorvækst efter podning avancerede humane coloncancerformer ; Derimod kan det sætte skub metastatisk vækst efter direkte såning af kræftceller i lungerne [10], [11], [19-21]. Disse resultater rejste den mulighed, at blokade af aktiv WNT-TCF signalering i humane coloncancer-celler ikke kan være i hovedsagen terapeutisk gunstige modsætning hvad der er blevet hævdet (fx [2], [18]). Ikke desto mindre er de tilgange og model anvendes, er forskellige, og der kunne være metodiske forskelle, der ligger til grund for divergerende resultater. For eksempel betyder direkte seeded metastaser ved haleveneinjektion af humane cancerceller [10] ikke fuldt ud rekapitulere fjernmetastaser. Desuden accepterede tanken om, at Wnt-ligander fremmer metastatisk vækst stammer fra gensplejsede mus [13], [14], er stadig at blive testet direkte ved hjælp patient-afledte kolon kræftceller.
Her har vi sammenlignet gevinst og blokade af funktion tilgange til direkte imødegå konsekvenserne af modulerende WNT-TCF signalering på menneskers tyktarmskræft xenograft vækst hos mus og på fjerne orgel metastaser in vivo, ved hjælp af både patient-afledte primære kolon kræftceller og to etablerede cellelinjer. Vi finder, at kun et mindretal af tumorceller testede reagere på TCF blokade ved aftagende tumorvækst, men i modsætning alle celler testet reagerede ved at øge fjernt orgel metastaser. Hertil kommer, at forhøjede WNT signalering gennem bedre ligand-niveauer i cancerceller booster ikke tumorvækst i alle tilfælde. I stedet resulterede i en heterogen metastatisk svar: forbedret WNT signalerer undertrykte metastatisk vækst i ét tilfælde, tre tilfælde var statistisk upåvirket, og det forbedrede metastaser i en anden sag. Yderligere analyse af forøgelsen af metastaser i mCC11 celler afslørede, at dette skete kun i én af tre immunkompetente musestammer begrundelse, at dette ikke er en tumor celle iboende respons.
Alt i alt, vores nuværende og tidligere data [10] tyder på, at blokade af WNT-TCF signalering i patienter med tyktarmskræft vil sandsynligvis være til skade i alle tilfælde, da dette vil føre til en stigning i metastaser, uafhængig af enhver reduktion i primær tumor størrelse i en delmængde af sager. I modsætning hertil de resultater, vi rapporterer her antyder, at restaurering af WNT-TCF pathway aktivitet i humane coloncancer-celler i stedet kan have terapeutisk værdi i en delmængde af metastatiske cancere.
Materialer og metoder Salg
Menneskelig tyktarmskræft prøver og cellekultur
Primær menneskelig tyktarmskræft (CC) prøver CC36 (TNM3), CC14 (TNM4) og mCC11 (levermetastaser fra CC patient) blev anvendt til denne undersøgelse var som i referencer [10], [21], [22], [23]. Den humane CC HT29 og T84 cellelinier, sidstnævnte afledt af en lunge metastase, blev opnået fra cellelinien Services. Alle primære CC celler blev anvendt i en tidlig in vitro passage i standard dyrkningsbetingelser (DMEM-F12 med 10% FBS, 5% CO
2).
Lentivirale værktøjer og infektion af humane CCs
Stabil indførelse af beta-galactosidase (ßGal) udtrykkende (
lacZ
+) reporterkonstruktioner anvendte lentivirale partikler ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 2. Alle inficerede kulturer blev kontrolleret for ßGal ekspression in vitro af X-Gal-farvning. Cellekultur batches med 90% homogen udtryk for ßGal blev udvalgt til yderligere infektioner (MOI = 2) med GFP
+ lentivectors med eller uden dnTCF4, Wnt1 eller Wnt3a. Partier med 85% GFP
+ celler blev valgt til alle eksperimenter
Real-time kvantitativ PCR
3-5d efter infektion, inficerede celler blev indsamlet i Trizol og mRNA. udvundet (Life Technologies). Standard PCR-reaktioner blev udført på afledte cDNA med følgende primere:
Menneske-specifikke primere:
TBP F: CCACAGCTCTTCCACTCACA
TBP R: GGATTATATTCGGCGTTTCG
HPRT F: GCCAGACTTTGTTGGATTTG
HPRT R: CTCTCATCTTAGGCTTTGTATTTTG
AXIN2 F: AGTGTGAGGTCCACGGAA AC
AXIN2 R: ACTGCCCACACGATAAGGAG
LGR5 F: GGAGCATTCACTGGCCTTTA
LGR5 R: CTGGACGGGGATTTCTGTTA
ASCL2 F: GCGTTCCGCCTACTCGT
ASCL2 R: GGCTTCCGGGGCTGAG
mus-specifikke primere:
Wnt1 F: GACGGATTCCAAGAGTCTGC
Wnt1 R: ATTGCGAAGATGAACGCTGT
Wnt3a F: GCACCACCGTGGACGACAG
Wnt3a R: CCTCGCTACAGCCACCCCAC
halevenen injektioner i NSG mus: Pure
lacZ
+ cellepopulation
10
6 menneskelig CC celler i HBSS blev injiceret i halevenen af 6 uger gamle kvindelige immunkompromitterede NSG mus (mangler modne T, B og NK-celler) under godkendte operationelle procedurer på dyret facilitet i UNIGE. Dyrene vejes 20-25g ved begyndelsen af eksperimentet. Dyrene blev rutinemæssigt kontrolleret for symptomer på ubehag og samlet 4 uger efter podning efter godkendte protokoller. Lunger blev indsamlet i PBS efter dissektion
Subkutan xenografter i NSG, Nude og SHO mus:. LacZ
+ celler
5×10
5 CC celler i HBSS blev injiceret i det subkutane lag af 6 uger gamle nøgne hunmus (NMRI-Foxn1nu /Foxn1nu, mangler modne T-celler) eller SHO mus (SHO-PkrdcscidHrhr; mangler modne T-celler og B-celler) eller immun-kompromitteret NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl /SzJ). Hver mus gennemført 3 xenografter i flankerne. Nøgne og NSG mus blev købt fra Janvier Labs (Frankrig) og SHO mus fra Charles River (Frankrig). Alle dyr blev 20-25g ved starten af eksperimentet og blev efterfølgende kontrolleret rutinemæssigt for symptomer på ubehag på tidspunktet for tumormålinger. Dyr blev aflivet ved afslutningen af 4 uger efter podning, og xenotransplantater og organer blev opsamlet i PBS efter dissektion. Xenografter blev hakket og opbevaret i Trizol efter solubilisering og senere bearbejdet til genekspression analyser af real time kvantitativ PCR.
Sub-kutant
lacZ
+/-
xenografter i NSG mus
mCC11
lacZ
+ celler blev inficeret med en lentivector på 90% effektivitet. Parallelt hermed mCC11 vægt (
lacZ
-) celler blev inficeret med GFP
+ lentivectors udtrykker Wnt1. mCC11-
lacZ
+ blev derefter blandet 1: 1 med mCC11-
lacZ
– /Wnt1
+ celler og i alt 5×10
5 celler blev injiceret i hver af tre steder pr 6 uger gamle kvindelige immunkompromitterede NSG mus under godkendte forhold. Dyrene blev rutinemæssigt kontrolleret for symptomer på ubehag dagligt på tidspunktet for målingerne tumorvækst. Alle dyr blev aflivet ved afslutningen af 4 uger efter podning, og tumorer og organer indsamles i PBS i slutningen af eksperimenter.
Beta-galactosidase X-Gal-farvning
Alle organer blev vasket med kold PBS efter indsamling og fikseret med 4% PFA ved 4 ° C i 2-12h. Farvning blev gjort for 4-8h med X-Gal. Farvede prøver blev derefter vasket med sterilt PBS og undersøges for synlige metastase under et dissektionsmikroskop.
lacZ
+ metastaser blev talt og fotograferet.
Exome sekventering af APC
Exome sekventering af DNA af tyktarmskræft primære celler, der anvendes blev udført ved Genomics Facility fra University of Geneva Medical School. Kun APC blev analyseret i detaljer for denne undersøgelse. Kun kendte APC-mutationer, der fører til tab af funktion rapporteres her.
Animal pleje
Alle mus blev anvendt under godkendte protokoller fra Office Cantonale de vétérinaire de Genève (OVC). Dyr blev overvåget adskillige gange ugentligt i trivsel under dyrlæge vejledning. Mus blev aflivet ved afslutningen af forsøgene, og før tumorer nåede den lokale juridiske grænse gennem injektion af ketazol /xylazin eller CO
2 inhalation.
Resultater
Modulation af kanonisk WNT signalering i humane coloncancer-xenotransplantater i mus ikke generelt ændrer tumorvækst
Primære humane coloncancer-celler (CC14 og CC36) samt metastatiske coloncancer-celler (mCC11) og en metastatisk cellelinie (T84) blev stabilt transduceret med GFP
+ dominant-negativ TCF4 (dnTCF), Wnt1, eller med kontrol lentivectors. Subkutane transplantater i immunkompromitterede NSG mus blev valgt, da kutan tyktarmskræft metastaser forekommer hos patienter, og fordi ingen præfekten ortotopisk transplantater er mulige i mus: selv injektion i endetarmen væggen fører til fartøj lækage, givet sin tyndhed og de mængder og tryk involveret i indsprøjtning , hvilket fører til systemisk spredning. Desuden subkutan transplantater er enkle og meget reproducerbar.
Niveauerne for udtryk for bona fide tyktarmskræft WNT-TCF aktivitet biomarkør
AXIN2
, samt WNT-regulerede stamcellemarkører
LGR5
ASCL2
(f.eks [2]), blev bestemt ved RT-qPCR i transducerede celler in vitro og i subkutane xenotransplantater (fig 1A). Alle celler in vitro og in vivo reageret på undertrykt eller forbedret WNT-TCF signalering, hvilket fremgår af de endogene niveauer af
AXIN2
mRNA; alle celler undertrykt
AXIN2
mRNA-niveauer som reaktion på pathway blokade af dnTCF, og alle celler forøget
AXIN2
mRNA-niveauer i respons på-aktivering af Wnt1 (Fig 1A).
LGR5
ASCL2
blev ligeledes reguleret omend med celle typen forskelle (figur 1A).
(A) Kvantificering af indholdet af
AXIN2
,
LGR5
ASCL2
ved RT-qPCR in vitro og in vivo i xenografter i de fire celletyper anvendt i denne undersøgelse, med WNT-TCF nedregulering via dnTCF4 eller opregulering via Wnt1 misexpression. Tallene er forholdene mellem eksperimentelle løbet kontrol- Ct-værdier, efter normalisering med husholdning gener
TBP
og
HPRT
. Bemærk, at i alle tilfælde den kanoniske WNT-TCF mål og aktivitet reporter
AXIN2
induceres af Wnt1 (grønne kasser) og undertrykt af dnTCF4 (røde kasser). (B) GFP + fluorescerende billeder af dissekerede tumorer i mCC11 (øverste række) og T84 (nederste række) celler. Modulering af WNT-TCF signalering in vivo forårsager små ændringer i voksende tumorer. Scale barer = 0,6 cm. (C) Histogram af kvantificeringen af tumor vægt efter dissektion, for hver af de fire tyktarmscancerceller anvendte. Se tekst for detaljer. p-værdier blev bestemt med to-tailed Students t test.
Tumorvækst blev overvåget hver anden dag ved at måle volumen før tumorer nåede de juridiske grænser. Ved slutningen af forsøget blev alle GFP
+ tumorer indsamlet på samme tid og fotograferet. I intet tilfælde var eksperimentelle tumorer større end kontroller (Fig 1B og 1C). I stedet 4/8 T84 xenografter udtrykker dnTCF (T84
dnTCF) undlod at vokse, og dem, der gjorde var inden for området af kontrol. Desuden var der et mindre fald i tumor vægt for mCC11
Wnt1 sammenlignet med kontroller (Fig 1B og 1C). Disse resultater antyder, op eller ned modulering af kanonisk WNT signalering kan have sammenhæng-afhængige og divergerende virkninger in vivo. Men under ingen omstændigheder gjorde forbedret WNT signalering resulteret i større tumorer og blokade af WNT-TCF signalering havde ikke universelle anti-tumor effekt.
Blokade af TCF aktivitet fører til en generel stigning i fjerne orgel metastaser
for at klart spore metastatiske kolonier i fjerne organer, vi podet kræftceller med integrerede
lacZ
udtrykkende lentivectors at muliggøre identifikation af humane ßGalactosidase
+ (ßGal
+) celler i mus væv efter XGal reaktion (figur 2A; [10], [24]). Podning
lacZ
+ CC14
dnTCF, CC36
dnTCF eller mCC11
dnTCF (Fig 2B) resulterede i en nettostigning i metastaser i lungerne hos NSG mus, og i deres metastatisk indeks (antal
lacZ
+ metastatiske kolonier divideret med samlede tumor vægt i gram, da hver mus gennemført 2-3 subkutane flanke xenografter) (fig 2C). Dette indikerer, at ned modulering af WNT-TCF-aktivitet (med ca. 50% som foreslået af
AXIN2
niveauer (Fig 1A) forøger den fulde eksperimentel metastatisk fænotype. Eftersom dnTCF aktivitet forhindrede vækst af en tredjedel (4 /12) T84
dnTCF tumorer (fig 1C), en generel metastatisk respons i denne celletype ikke var helt meningsfuldt at kvantificere. Men den metastatiske indeks af T84
dnTCF mus, der udviklede tumorer var svarende til den i T84
kontrol (ikke vist).
(A) diagram af proceduren anvendt til at analysere effekten af nedregulering af af WNT signalering på fjernmetastaser in vivo. Podede celler er
lacZ
+, hvilket tillader visualisering af store kolonier og selv individuelle metastatiske celler i fjerntliggende organer, især lungerne (nederst indsat). Indsættelsen til højre viser en stor forstørrelse af
lacZ + Salg metastaser af forskellige størrelser efter i toto XGAL farvning at afsløre
lacZ
+ metastatiske celler (mørkeblå pletter). (B) Repræsentative billeder af venstre lunge lapper fra mus podet subkutant med kontrol celler eller dem med blokeret WNT-TCF signalering gennem ekspressionen af dnTCF4 som angivet. (C) Kvantificering af antallet af lungemetastaser per dyr vist som den metastatiske indeks (antal metastaser end tumorvægt) (øverste række), og tumorvægt (nederste række) som angivet i hvert tilfælde. (D) Kvantificering af størrelsen af lunge metastatiske kolonier som fremgår venstre lungelap side. I alle figurer fejl barer er S.E.M. og p-værdier stammer fra uparret, to-halet Students t test. Scale bar = 7mm for (A); 25mm for (B).
Kvantificering af størrelsen af
lacZ
+ metastatiske kolonier i lungerne viste, at der var en konsistent stigning i antallet af store ( 100 celler pr koloni) metastaser efter undertrykkelse af WNT-TCF signalering i mus med CC36
dnTCF, CC14
dnTCF og mCC11
dnTCF xenografter i forhold til kontroller (fig 2D). Desuden er både CC36
dnTCF og mCC11
dnTCF tumorbærende mus vises også et større antal mikrometastaser ( 10 celler pr koloni) i forhold til kontroller (Fig 2D). Disse resultater antyder, at nedregulering af kanoniske WNT signalering kan føre til både en stigning i antallet af metastatiske celler der strækker en fjern organ samt en stigning i størrelsen af de metastatiske kolonier.
Forøgelse af Wnt ligand niveauer gør generelt ikke øge antallet af fjerne orgel metastaser
for at teste for fjernmetastaser fra en primær tumor websted til en fjern orgel, lungerne i denne sag, kontrol og Wnt1 udtrykker
lacZ
+ -celler blev podet i fuldt immunkompromitterede NSG mus subkutant (fig 3A). Betragtninger CC14
Wnt1 eller CC36
Wnt1 tumorer havde ingen signifikant ændret niveauer af lungemetastaser sammenlignet med kontroller (Fig 3B og 3D), T84
Wnt1 tumorer produceret færre og mCC11
Wnt1 tumorer producere mere metastaser og havde en ændret metastatisk indeks og koloni størrelsesfordeling (fig 3C og 3D). Dette viser, at metastatiske resultat af WNT signalering udløst af ligand handling kan være kontekstafhængig, men at øget WNT signalering er ikke universelt pro-metastatisk.
(A) Diagram af proceduren anvendt til at analysere effekten af opregulering af WNT signalering på fjerne metastaser in vivo. (B) Repræsentative eksempler på venstre lunge kamre af mus der bar subkutane tumorer i forskellige coloncancerceller som angivet, enten transporterer kontrol (øverste række) eller Wnt1-udtrykkende (nederste række) lentivectors, efter X-gal-farvning. Scale bar = 25 mm. (C) Kvantificering af den metastatiske indeks i hvert tilfælde pr mus. (D) Kvantificering af størrelsen af lunge metastatiske kolonier som fremgår venstre lungelap side. Bemærk, at kontrollerne er de samme bruges til figur 2 som blev udført Wnt1 og dnTCF eksperimenter samtidigt, men vises særskilt for klarhed.
Forbedret WNT signalering modulerer antallet af direkte seedede metastaser i en kontekst- afhængig måde
for at give yderligere støtte den metastatiske fænotype observeret med mCC11
Wnt1 og T84
Wnt1 celler i fuld metastatiske analyser beskrevet ovenfor, vi direkte seeded tumorceller i lungerne, ved at injicere
lacZ
+ mCC11
Wnt1 eller
lacZ
+ T84
Wnt1 celler i cirkulationen af NSG mus via halevenen (fig 4A). mCC11
Wnt1 celler dannes mange flere og T84
Wnt1 celler langt færre metastaser i forhold til kontroller (Fig 4B og 4C). Kvantificering af metastatiske kolonier pr størrelse afslørede ændringer i alle kategorier, fra encellede mikrometastaser til store kolonier med 100 celler (Fig 4D). Disse data understøtter de fjerne metastase resultater og hævder, at WNT signalering kan påvirke metastatisk vækst, uafhængigt af andre effekter, herunder på stroma af den primære tumor. Disse resultater bekræfter også, at paradoksalt nok forbedrede Wnt ligand niveauer er pro-metastatisk i én celletype og anti-metastatisk i en anden.
(A) Skematisk diagram af den anvendte protokol til at teste effekten af forbedret WNT signalering på metastatisk vækst efter direkte injektion i kredsløbet hætteglas halevenen. (B-D) Repræsentative eksempler (B), total kvantificering (C) og kvantificering af metastatisk koloni størrelse (C) på X-Gal farvede lungeregioner efter injektion af kontrolceller eller celler med ekstraudstyr eller WNT signalering som angivet. mCC11 metastatisk vækst forøges mens anlægget på T84 undertrykkes (C, D). Bemærk, at det samlede antal metastatiske kolonier repræsenteret i (C) til mCC11 er pr venstre lunge lap, mens givet deres knaphed, at for T84 er for hele lunger. Scale bar = 7mm for (B).
Manglende korrelation af APC status og WNT-TCF modulation fænotype
Det kan hævdes, at vi har valgt celler, der måske ikke har mutant APC, hvilket gør vores resultater ikke generelt anvendelig til de fleste humane coloncancerformer. Men vi konstatere, at T84 havne
APC
mutationer, og at exome sekventering af
APC
i CC14 afslører tilstedeværelsen af tab af funktion mutationer (CHR5 112.173.848 G- T, Cosmic id 18.566, E
853- STOP; CHR5 112.175.951 G- A, E
1554- . læserammeforskydning)
for at udvide disse resultater, vi gentagne forsøgene med dnTCF og Wnt1 hjælp brønden -known
APC
mutant coloncancercellelinie HT29 (fig 5A). I disse celler Wnt1 og dnTCF4 reguleret TCF mål som forventet (fig 5B). Tumorer, der udtrykker HT29
dnTCF var lidt, men betydeligt mindre, men dette var også tilfældet for HT29
Wnt1 tumorer (Fig 5C), hvilket tyder på manglen på en klar tumorvækst svar på modulering af WNT signalering. Desuden var der ingen signifikans forskel i antallet af
lacZ
+ metastaser fra HT29
Wnt1 tumorer sammenlignet med HT29
kontroller (Fig 5D og 5E). I modsætning hertil øges med HT29
dnTCF var signifikant (Fig 5D og 5E). Analyser af metastatisk koloni størrelse bekræftede stigninger i mikro- og macrometastases fra HT29
dnTCF, men ikke HT29
Wnt1, tumorer i forhold til HT29
kontroller (Fig 5F).
(A) strategi, der anvendes til subkutan til lungemetastaser. (B) Heat kort over normaliserede mRNA ekspressionsniveauer i forhold til kontroller (og over housekeeping gener) for de fremhævede gener i HT29 celler dyrket in vitro eller i xenotransplantater in vivo. Alle tal er forhold i forhold til kontroller. (C, D) Virkninger af modulation af WNT signalering med dnTCF eller Wnt1 udtryk subkutan tumorvækst (C) og metastatisk indeks (Met-indeks) (D). (E) Repræsentative eksempler på venstre lunge billeder for hvert enkelt tilfælde som bemærket. Metastaser er farvet mørkeblå efter XGal reaktion på grund af deres celle-iboende udtryk for
lacZ
. (F) Kvantificering af
lacZ
+ metastatisk koloni størrelse i tre kategorier, som vist. Scale bar = 20mm for (E).
Sammen understøtter disse data den generelle opfattelse, at celle iboende reduktion af kanonisk WNT signalering reaktioner i cancerceller er pro-metastatisk, og hævder, at status for APC er ikke blot korreleret til resultatet af modulation af WNT-TCF-signalering.
Forskellige kanoniske Wnt-ligander øger antallet af fjerne mCC11 metastaser
for at udelukke muligheden for, at virkningerne af øgede metastaser ved forbedret Wnt1 skyldtes en specificitet af liganden anvendes, gentog vi fuld metastatisk protokol med mCC11 celler, der udtrykker Wnt3a eller Wnt1, som begge aktiverer kanoniske WNT-TCF signalering og som forventet, forbedre niveauerne af WNT-TCF target
AXIN2
og WNT-regulerede kolon stamcelle markør
LGR5
i forhold til dem i kontrol-celler (fig 6A). mCC11
Wnt3a
lacZ
+ celler produceret tumorer ligner kontroller i størrelse, men gengives forøgelsen af fjerne lungemetastaser fra mCC11
Wnt1 tumorer med lignende koloni størrelsesfordelingen (Fig 6B og 6C og ikke vist).
(A) Forbedret Wnt1 og Wnt3a producerer lignende ændringer i target genekspression foranstaltninger ved RT-qPCR. (B) Repræsentative eksempler på X-Gal farvede venstre lungelapper med metastatiske kolonier som beskrevet. (C) Kvantificering af den metastatiske indeks og vægten for mCC11 vægt, mCC11
Wnt1 og mCC11
Wnt3a. Både Wnt1 og Wnt3a forbedre metastaser end kontrol, men kun Wnt1 tumorer er lidt mindre. Scale bar = 20mm for (B).
mCC11
Wnt1 celler fremmer metastaser fra søskende ikke-Wnt1-udtrykkende celler
For at sikre, at Wnt-ligander fra mCC11
Wnt1 celler udøver ikke-celle autonom signalering in vivo,
lacZ
ekskluderet mCC11
Wnt1 celler blev blandet med
lacZ
+ wt søskende mCC11 celler og co-injicerede at danne subkutane tumorer ( fig 7A). Efter tumorvækst testede vi for den forøgede tilstedeværelse af ßGal
+ mCC11 wt celler i lungerne. mCC11
Wnt1 celler betydeligt fremmet metastatiske adfærd søskende mCC11 vægt celler (Fig 7B og 7C), hvilket indikerer, at Wnt1 ligander også kan fungere ikke-selvstændigt i denne sammenhæng.
(A) Diagram af protokollen anvendes til at prøve ikke-selvstændige effekter af overeksprimeres Wnt ligander på søskende, ikke-overudtrykkende mCC11 celler podet på samme tid. Kun
lacZ
+
Wnt1
– celler spores efter XGAL reaktion. (B) Repræsentative billeder af X-Gal farvede venstre lungelapper under de beskrevne betingelser. (C) Kvantificering af den metastatiske indeks og tumorvægt pr tilstand. Scale bar = 25mm for (B).
mCC11
Wnt1 celler ikke vise øget metastaser end kontrol i nøgen eller SHO mus
Resultaterne præsenteret ovenfor viser, at kanoniske WNT signalering er pro-metastatisk i mCC11 celler, og at Wnt ligander fungere både autocrinely og ikke-autonomt i vivo, hvilket tyder på, at den primære tumor stroma er usandsynligt at være eneste mål af pro-metastatisk WNT signalering. Men vi også opleve, at celle-autonome undertrykkelse af TCF funktion med dnTCF fører til en markant øget i fjerne orgel metastaser fra disse celler, som med alle andre celler testet. Vores hypotese således at blokade af WNT-TCF signalering i mCC11 celler kunne have iboende og generelt pro-metastatisk (i overensstemmelse med resultaterne i de andre testede celler), men at øget WNT signalering kan øge metastaser fra mCC11 celler gennem en ikke-celle autonome, mCC11-specifik mekanisme.
for at teste, om den forøgede metastatiske fænotype af mCC11
Wnt1 afhang af miljø, vi ændret radikalt miljøet af de podede tumorceller ved at ændre stamme af mus værter ( fig 8A). mCC11
Wnt1 subkutane tumorer voksede som kontroller gjorde i nøgen eller SHO mus (Fig 8B og 8C), men i modsætning til den potente metastatisk fænotype af mCC11
Wnt1 celler i NSG mus er beskrevet ovenfor, mCC11
Wnt1 tumorer viste ikke et forøget antal af metastaser i sammenligning med kontroller i podede nøgen eller SHO mus (fig 8B og 8C). Disse resultater antyder, at mCC11 celler ikke vise en celle iboende metastatisk forbedring som reaktion på øget WNT signalering.
(A) Diagram over den anvendte procedure til at indpode mCC11 celler subkutant og analyserne af resulterende fjerne lungemetastaser. (B) Kvantificering af tumor vægte og metastatiske indekser viser mangel på fremme af metastaser af mCC11
Wnt1 celler podet på nøgen eller SHO mus værter.
Diskussion
Ninety tre procent af humane coloncancerformer havnen hyperaktivering af den kanoniske WNT pathway, oftest gennem tab af funktion af APC (https://cancergenome.nih.gov/). Dette, sammen med resultaterne med genetiske musemodeller, har ydet støtte til en funktionel rolle hyperaktiv Wnt-Tcf signalering i initiering og udvikling af intestinale tumorer med celler i kultur in vitro og i musemodeller in vivo (f.eks [2], [18], [25], [26]). Flere linjer af beviser stammer også fra arbejde med transgene mus har vist foreslået, at forøgelse af Wnt aktivitet i metastatisk niche gennem handling af Periostin [13], eller ved at fremme vandringsadfærd af cirkulerende tumorceller [14], driver metastaser i forskellige kræftformer. Disse og andre data er blevet taget for at foreslå, at høje kanoniske WNT signalering i forskellige menneskelige kræftformer, herunder colon, er afgørende for tumorvækst og metastaser hos patienter, argumentere for udviklingen af terapeutiske WNT-TCF pathway antagonister (f.eks [3 ]).
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.