PLoS ONE: genom-Wide analyse i Human Kolorektal Cancer Cells afslører Iskæmi-medieret ekspression af motilitet Gener via DNA Hypomethylation

Abstrakt

DNA hypometylering er en vigtig epigenetisk modifikation fundet at forekomme i mange forskellige typer cancer, der fører til opregulering af tidligere tavshed gener og tab af genomisk stabilitet. Vi har tidligere vist, at hypoxi og hypoglykæmi (iskæmi), to almindelige mikro-miljø ændringer i solide tumorer, fald DNA methylering via nedregulering af DNMTs i humane kolorektal kræftceller. Her har vi udnyttet en genom-dækkende cross-platform tilgang til at identificere gener hypomethylated og opreguleres af iskæmi. Efter udsættelse for hypoxi eller hypoglykæmi, blev methyleret DNA fra humane kolorektale cancerceller (HCT116) immunopræcipiteret og analyseret med en Affymetrix promotor array. Derudover RNA blev isoleret og analyseret parallelt med en Affymetrix udtryk array. Opfindsomhed pathway analyse software afslørede, at en betydelig del af de gener, hypomethylated og opreguleres var involveret i cellulær bevægelse, herunder

PLAUR

og

Cyr61

. En Matrigel invasion assay viste, at faktisk HCT116 celler dyrket i hypoxiske eller hypoglykæmiske tilstande har øget mobilitet kapaciteter. Bekræftelse af opreguleret ekspression af cellulære bevægelse gener blev udført med qPCR. Sammenhængen mellem iskæmi og metastase er veletableret i kræft progression, men de molekylære mekanismer, der er ansvarlige for denne fælles observation er ikke blevet klart identificeret. Vores roman data tyder på, at hypoxi og hypoglykæmi kan være drivende ændringer i DNA-methylering via nedregulering af DNMTs. Dette er den første rapport til vores viden, der giver en forklaring på den øgede metastatisk potentiale set i iskæmiske celler;

dvs. Hoteller, som iskæmi kunne køre DNA hypometylering og stigende udtryk af cellulære bevægelse gener

Henvisning:. Skowronki K, Andrews J, Rodenhiser DI, Coomber BL (2014) Genom-Wide analyse i Human Kolorektal Cancer Cells afslører Iskæmi-medieret ekspression af motilitet Gener via DNA hypometylering. PLoS ONE 9 (7): e103243. doi: 10,1371 /journal.pone.0103243

Redaktør: Hassan Brim, Howard University, USA

Modtaget: Februar 14, 2014 Accepteret: 30 Juni 2014; Udgivet: 31 juli 2014

Copyright: © 2014 Skowroński et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af en Research Grant # 020.094 til BLC og DR fra den canadiske Cancer Society Research Institute (https://www.cancer.ca/research/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Solide tumorer undergår en fundamental proces kendt som angiogenese (rekruttering af neo-kar) for at opretholde et passende niveau af ilt og næringsstoffer til det ekspanderende masse [1]. Tumor blodkar er meget unormal og på grund af hastigheden af ​​tumorvækst, som overstiger hastigheden af ​​angiogenese, vil områder af en tumor udvikle reduceret blodgennemstrømning, eller iskæmi [2]. Ud over andre ændringer, vil iskæmiske regioner har områder med hypoxi og hypoglykæmi, og mens virkningen af ​​hypoglykæmi på tumorigenese ikke er godt undersøgt, er den rolle, iltsvind i kræft progression veldokumenteret og omfatter øget genetisk ustabilitet, og stimulerende celle invasion og angiogenese, hvilket bidrager til metastase [3].

Cellular bevægelse /migration er et afgørende skridt i metastase, som er årsag til de fleste kræftrelaterede dødelighed [4]. En række molekylære ændringer kan forårsage en celle til at være bevægelige og rejse ind i det lymfatiske eller kar-system, i sidste ende fører til anholdelse på et nyt site i [5] krop. Celler i en iskæmisk miljø har en højere metastatisk potentiale gennem opregulering af gener såsom

VEGF

at stimulere angiogenese, og

urokinaseplasminogenaktivator

(

uPA

), som aktiverer plasmin at nedbryde ECM’en [5]. Gennem stabilisering af en underenhed af hypoxi-responsive transskriptionsfaktor, HIF1α, hypoxi driver ekspression af disse to gener, og mange andre, fremme metastase. Celler kan også gøres mere motile via epigenetisk omprogrammering. Flere relevante gener såsom

uPA

[6] og

S100A4

[7] har ændret epigenetisk mønster i kræftceller, så cellemorfologi skal modificeres til en mere metastatisk-gunstig tilstand. Hvad forbliver ukendt, er, hvis epigenetiske modifikationer og iskæmi er forbundet med at fremme tumormetastase.

DNA-methylering er en vigtig epigenetisk mekanisme, som regulerer genekspression [8]. Methyleret DNA er forbundet med transkriptionel inaktivering, eftersom methylgrupperne på cytosinrester ændre konfigurationen af ​​DNA og forhindrer derfor transkriptionsfaktorer i at binde [9], samt udløse ansættelse af repressorer og chromatin modificerende enzymer, der yderligere tie ekspression gennem chromatinkondensering [10], [11]. Adskillige DNA methyltransferaser (DNMT) katalyserer omdannelsen af ​​cytosin til 5-methylcytosin [12], med de mest almindeligt studerede DNMTs bliver DNMT1 (en vedligeholdelse methyltransferase) og DNMT3a og DNMT3b (

de novo

methyltransferaser) [13] .

I kræft, er to almindelige forstyrrelser DNA methylering mønstre observeret: promotor-specifikke hypermethylering og global hypometylering [14]. De fleste undersøgelser har fokuseret på DNA hypermethylering og den indvirkning, lyddæmpende tumorsuppressorgener har på tumor initiering, progression, og prognose. DNA hypometylering derimod er blevet overskygget af den omfattende opmærksomhed på DNA hypermethylering i cancerterapi, selvom hypomethylering var den første epigenetisk forstyrrelse bemærket i cancer [15], [16]. Trods det oprindelige manglende forståelse med hensyn til betydningen af ​​DNA hypometylering i kræft, er det nu kendt, at repetitive sekvenser bliver demethyleret og føre til genomisk kaos [17], [18]. Som med DNA hypermethylering, kan hypometylering være stedsspecifikke og derved bidrage til øget udtryk [16]. Udover sådanne genspecifikke virkninger, genomisk ustabilitet, tab af prægning [19] og unormal X-kromosom aktivering også bidrage til tumorigenese [20].

Hoffmann og Schultz [16] hypotese, at DNA hypometylering accelererer tilpasning af cancerceller til den dynamiske mikromiljø gennem selektion for bestemte genfunktioner, såsom motilitet. Beviser for denne teori ligger i urokinaseplasminogenaktivator

(uPA

) gen. En serinprotease er involveret i nedbrydning af den ekstracellulære matrix,

uPA

har vist sig at have en hypomethylated promotorregion, hvilket fører til overekspression i både bryst- og prostatakræft og er direkte forbundet med øget invasive og metastatiske potentiale [ ,,,0],6].

melanom-associeret antigen

(

MAGE

) er en anden i gruppen af ​​gener viser sig at være demethyleres og opreguleret i mange kræftformer som melanom, colorectal, gastrisk, og ikke-småcellet lungecancer [ ,,,0],21], [22], [23], [24], [25]. Samlet kan flere mekanismer er ansvarlig for dysregulering af DNA-methylering i cancer. Overekspression af DNMTs er blevet rapporteret i mange forskellige kræftformer [26] og forklarer afvigende hypermethylering, men mindre fokus er gået ind forstå DNA hypometylering, selvom DNA hypometylering spiller en lige så vigtig rolle i at modificere kræft epigenome.

Vores tidligere arbejde beskrevet en hidtil ukendt forbindelse mellem iskæmi og DNA-methylering, med reduceret methyl cytosin set i celler fra iskæmiske områder af tumorer [27]. Vi fandt også, at i HCT116 humane kolorektale cancerceller, DNMT1, DNMT3a, og DNMT3b udtryk og aktiviteter blev reduceret med

in vitro

hypoxi og hypoglykæmi [28]. Disse ændringer i ekspression og aktivitet var samtidig med hypometylering af

p16

INK4a

promoter region i hypoglykæmiske betingelser [28]. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi ekspressionen og methylering ændringer i HCT116 celler på et genom-plan ved anvendelse af en cross-platform tilgang til at identificere gener reguleres af iskæmiske tilstande. I betragtning af vores tidligere resultater, kombineret med det fælles observation af forøget metastatisk potentiale i iskæmiske tumorer, vi hypotese, at øget cellulær motilitet af humane kolorektal cancer celler i iskæmiske tilstande skyldes opregulering af motilitet-associerede gener, og at disse ændringer i udtryk er drevet af iskæmi-medieret DNA hypometylering.

Resultater

Minimal kopi nummer variation

kopi antal gener i HCT116 celler blev vurderet med Affymetrix SNP 6.0 array til at bestemme hvis, og i hvilket omfang, havde cellerne vi brugte drev /muteret i kultur sammenlignet med den oprindelige karyotype af denne cellelinie. Sammenlignet med en pooled normal menneskelig karyotype fra projektet databasen International HapMap [29], manglede cellerne omfattende kromosomafvigelser (Figur 1). Vi observerer regioner på 8q, 10Q, 16q, og 17q, der viste regionale kromosomale gevinster (angivet med rødt), som tidligere rapporteret af andre [30]. Meget få fuldstændig tab af eksemplarer blev set (blå), bortset fra Y-kromosomet, som er blevet rapporteret at være fraværende i 50-100% af HCT116 celler [31]. Således, i sammenligning med andre cancercellelinjer, HCT116 have en forholdsvis normal og stabil karyotype med minimal kromosomal ustabilitet [30].

Numbers (og X /Y) svarer til kromosomer, og MT betegner mitokondrie-DNA. Resultater blev sammenlignet med et datasæt fra Affymetrix indeholdende 270 blandet population prøver fra den internationale HapMap Project [29]. Regioner i grå indikerer ingen ændring i kopiantal, rød indikerer et kopital forstærkning og blå et kopital tab. Dette array blev udført i to eksemplarer.

Hypoglykæmi påvirkninger flere gener end hypoxi

Expression analyse blev udført til kvantitativt vurdere genekspression ændringer i HCT116 celler under iskæmiske tilstande. Ekspressionsniveauerne arrays indikerede, at efter eksponering for hypoxi i 48 timer, HCT116 celler havde 310 og 1081 gener op- og ned-reguleret, henholdsvis. Når celler blev udsat for hypoglykæmi, 1052 og 2433 gener var op- og nedreguleres, (tabel 1). Analyse af promotor-methylering ved anvendelse af Affymetrix 1.0R flisebelægning arrayet viste, at hypoxia resulterede i 1386 hypomethylated gener og 1655 hypermethyleret gener. Væksten i hypoglykæmiske tilstande resulterede i 1940 hypomethylated gener og 1980 hypermethyleret gener (Tabel 1). Således blev begge udtryk og promoter methylering mønstre mest kraftigt påvirket af hypoglykæmi, som målt ved det samlede antal markant ændrede gener.

Cross-platform analyse

Dernæst vi vurderede det funktionelle betydningen af ​​disse komplekse genekspression og epigenetiske (DNA methylering) profiler. Brug af Partek Software Suite, var unikke gener, der blev hypomethylated og opreguleres (samt hypermethyleret og nedreguleret) overlejret for at identificere ændringer i genekspression forbundet med ændringer i promotor methylering. Der var 58 unikke gener hypermethyleret og nedreguleres af hypoxiske betingelser, og 161 gener ved hypoglykæmi (data ikke vist). Vi fokuserede på de gener, der blev hypomethylated og steg i udtryk, da vores tidligere arbejde viste DNMTs blev undertrykt i iskæmi. Vi observerede, 18 og 96 unikke gener blev hypomethylated og opreguleres ved hypoxi og hypoglykæmi, henholdsvis (figur 2). Delvise lister over disse gener kan ses i tabel 2 og 3, med den komplette liste i tabel I i Information S1.

Antal af gener, der var både markant hypomethylated og opreguleret af hypoxi (A) og hypoglykæmi ( B) er angivet i de overlappede områder. Vejviser

Ingenuity Pathway Analyse af hypomethylated og opregulerede gener

Ingenuity Pathway Analysis (IPA) blev anvendt til at analysere og klassificere de hypomethylated og opreguleres gener i funktionelle veje, for bedre at forstå den biologiske relevans af de gener fra vores datasæt. Softwaren afgør om en biologisk funktion er beriget i et datasæt ved at undersøge hele gen liste for funktionelle anmærkninger fundet i opfindsomhed vidensgrundlag, og udføre en Fishers eksakte test sammenligner forholdet mellem gener med en given anmærkning i datasættet mod forholdet mellem gener, der har det samme anmærkning i hele befolkningen (

dvs

alle generne på HG U133 Plus 2.0 matrix). Hvis det første forhold er betydeligt højere end den anden, så er listen siges at være beriget for gener med at annotation

Med hypoxi eksponering, de tre cellulære funktioner fra vores liste over hypomethylated /opregulerede gener var.: celle-til-cellesignalering, cellulær bevægelse og bindevæv udvikling (figur 3). Hypoglykæmi beriget for ændringer i celledød, cellecyklus, og regulering af genekspression (figur 4). Selvom det ikke inden for de øverste par funktionelle kategorier, cellulære bevægelse var også en beriget funktion i den hypoglykæmiske gruppe. Netværk analyse blev også udført for at tilvejebringe en grafisk repræsentation af kendte biologiske sammenhænge af hypomethylated og opreguleres gener. Netværkene genereres ved at bestemme fokus molekyle, og derefter undersøge gen lister for de mest forbindelser til fokus molekyle, baseret på litteraturen i Ingenuity database. De øverste netværk (der har flest forbindelser) for både iltsvind og hypoglykæmi involveret gener, som har roller i cellulære bevægelse. I hypoxiske betingelser,

PLAUR, LDLR

, og

LAMB3

(figur 5A) var alle i ét netværk og har alle vist sig at være involveret i cellulær bevægelse. Den øverste netværk i hypoglykæmiske tilstande inkluderet cellulære bevægelse gener

ETS1, KLF4, IL6ST, NEDD4L

, og

NTM

(figur 5B). Det er vigtigt at bemærke, at nogle gener i vores liste kan have biologiske funktioner /annoteringer, opfindsomhed databasen ikke genkendes. Som et eksempel,

AFAP1L1

ikke var i Ingenuity liste af gener, der er involveret i cellulær bevægelse, men der er bevis for dette molekyle rolle i migration og invasion [32]. Baseret på IPA analyse af funktionelle veje og netværk, kategorien “cellulær bevægelse” optrådte interessant og relevant, og vi videreført generne forbundet med disse funktioner til matrix validering.

Opfindsomhed Pathways Analyse database blev brugt til at tildele gener til biologiske funktioner og bestemme funktioner, der blev beriget, baseret på statistisk signifikans.

Opfindsomhed Pathways Analyse database blev brugt til at tildele gener til biologiske funktioner og bestemme funktioner, der blev beriget, baseret på statistisk signifikans.

De øverste netværk (de fleste forbindelser til det centrale molekyle) for hypomethylated og opreguleres gener er vist for både hypoxi (A) og hypoglykæmi (B). Intensiteten af ​​det røde farvestof af molekylerne afspejler ekspressionsniveauet som fundet i ekspression array (mørkere betegner større stigning i ekspression sammenlignet med kontrolbetingelser).

Migration-associerede gener er beriget med hypoxi og hypoglykæmi

cross-platform analyse af gener hypomethylated og opreguleres ved hypoxi og hypoglykæmi afslørede en række gener, der er involveret i cellulær bevægelse:

LDLR, LAMB3, ALDOA, PLAUR, SCAI,

NEDD4L

i hypoxiske gruppe (figur 3), og

ITGB1, ETS1, IL6ST, nationale tilsynsmyndigheder, TJP1, SMAD3, TMOD3, LATS2, KLF4, ADI1, NCOA3, PTEN, CSNK2A2, TRIO, CSNK2A1, BRD4, RTN4, SEMA3C, NEDD4L

,

Cyr61, TFPI,

HEY1 i den hypoglykæmiske gruppe (figur 4). Foruden disse gener, vi observerede to andre, der hypomethylated og opreguleres sandsynligvis også involveret i cellulær bevægelse.

ANKRD37

AFAP1L1

i “hypoxisk gruppe« har vist sig at være involveret i migration og invasion af kræftceller (tabel 2). Mange af de “cellulær bevægelse” gener i vores analyse er involveret i mediering cellulær vedhæftning, enten til andre celler eller ECM, eller i ECM-nedbrydning, for alle processer, der kræves for en celle bevæge sig inden væv og til at indtaste blodkar.

Bekræftelse af forøget ekspression af cellulære bevægelse gener

Vi brugte QRT-PCR at kvantificere ekspressionen af ​​udvalgte gener fra både hypoxi og hypoglykæmi grupper. Vi vælger at fokusere på gener involveret i cellulær bevægelse identificeret i cross-platform analyse som opreguleres og hypomethylated. For hypoxi gruppen, vi undersøgte

PLAUR

,

AFAP1L1

, og

LAMB3

. Både PLAUR og LAMB3 signifikant opreguleret i hypoxi, sammenlignet med kontrol betingelser (figur 6A). Fold-ændringer i ekspressionen af ​​disse to gener som bestemt ved QRT-PCR var sammenlignelig med den fold-ændring set i udtrykket array (tabel 2). Gener vurderet til udtryk ændringer ved QRT-PCR i hypoglykæmiske tilstande inkluderet

EphA2

,

NTM

,

NEDD4L

, og

Cyr61

. Alle fire af disse gener blev opreguleret i udtrykket array analyse og hypomethylated i promotoren flisebelægning array, undtagen EphA2 ikke blev hypomethylated ifølge promotoren array. Signifikant opregulering af EphA2, NEDD4L og Cyr61 i hypoglykæmi blev bekræftet ved QRT-PCR (figur 6B).

cDNA niveauer fra HCT116 celler dyrket i hypoxi (A) og hypoglykæmi (B) blev målt for generne af interesse og normaliseret til p-actin, og at kontrollere. N = 5 for intet oxygen og N = 3 for ingen glucose. * Viser signifikant forskel i forhold til kontrol;

s

≤0.05.

iskæmisk betingelser forbedre HCT116 motilitet

Invasion analyser blev udført for at bestemme virkningerne af iskæmi på celle motilitet. Efter 48 timer i iskæmiske tilstande, var det klart, at celler udsat for hypoxi og hypoglykæmi havde signifikant øget mobilitet og invasive kapacitet som bestemt ved cellers evne til at nedbryde og migrere gennem Matrigel (figur 7). Denne funktionelle assay støttede vores fund, at forhøjede udtryk for mobilitet-associerede gener via promoter hypometylering i iskæmiske tilstande oversætter til fænotypiske forandringer i HCT116 celler.

Cell billeder taget ved 10 × forstørrelse fra undersiden af ​​Matrigelcoatede transbrøndene (EN). Lette refraktive celler (sorte) viser, at disse celler migreret gennem transwell membran. Gennemsnitligt antal HCT116 celler, som invaderede Matrigel coatede transbrøndene efter 48 timers udsættelse for intet oxygen (NO) og ingen glucose (NG), efterfulgt af 24 timer i transbrøndene (B). * Angiver signifikant forskel fra kontrol;

s

. 0,01

Diskussion

I denne undersøgelse, vi udnyttet en cross-platform tilgang identificere genom-dækkende ændringer i promotor methylering og genekspression at opdage, hvordan akut iskæmi påvirkninger methylering-medieret genekspression i humane kolorektale cancerceller. Vi identificerede og kontrolleret, at gener involveret i styrkelsen cellulær bevægelse reguleres under iskæmiske tilstande, repræsenteret ved hypoxi og hypoglykæmi

in vitro

.

Akut iskæmi ofte forekommer i solide tumorer på grund af den dynamiske tumorvaskulatur og den hurtige ekspansion af tumorer over angiogenese [2]. Vi har tidligere fastslået, at akut iskæmi fører til nedregulering af både cellulære methylcytosin indhold og DNMT udtryk og aktivitet [27], [28]. For at forfølge dette fund og identificere, hvilke gener der er hypomethylated og opreguleres af iskæmi på globalt plan, vi brugte platforme, der deler den fælles Affymetrix teknologiske grundlag for at lette krydsreference af datasæt. Vi brugte derfor en enkelt software bioinformatik pakke (Partek Genomisk Suite) til at importere, analysere og sammenholde rådata fra de forskellige microarray platforme [33]. Fra vores genom-dækkende, cross-platform undersøgelse fandt vi iskæmiske tilstande markant opreguleres gener involveret i celle motilitet og invasion, og disse gener havde demethyleret promotorområder identificeret af arrays. Derfor vores cross-platform analyser peger på et sæt af gener, der vises lydhøre over for miljøet hypoxi og hypoglykæmi via ændret CpG methylering.

Tidligere undersøgelser har vist, at nogle HIF1-medierede gener (

f.eks CA9, EPO

) kræve, at CpG i hypoxi respons element (HRE), der skal demethyleres, for HIF1 at binde, og udtryk at forekomme [34] – [36]. S100A4, et medlem af S100 familie af Ca

2 + -bindende proteiner, kendt for at være involveret i cancer celle motilitet ved dets evne til at aktivere ikke-muskel myosin, og har vist sig at være relateret til gastrisk cancer progression [ ,,,0],34]. S100A4 blev opreguleret af hypoxi i kræft i æggestokkene, med reduceret methylering af HRE i

S100A4

‘s promotorområder og øget binding af HIF1 [7]. Disse undersøgelser giver dokumentation mod konceptet, at hypometylering kræves hypoxiske betingelser for genekspression at forekomme.

En relevant gen markant opreguleres og hypomethylated af hypoxi fra vores cross-platform analyse er plasminogen aktivator urokinase receptor eller PLAUR , receptoren for urokinase plasminogenaktivator (uPA). uPA er en serinprotease, som katalyserer omdannelsen af ​​plasminogen til plasmin, som derefter nedbryder ECM [35]. PLAUR er involveret i cellulær bevægelse og metastase [36] og ekspression øges i den kritiske overgang fra alvorlig dysplastiske adenom til invasive karcinom i kolorektal cancer [35]. Derudover er PLAUR opreguleret i hypoxi [37] gennem HIF1 aktivitet [38], og er ansvarlig for hypoxi-medieret invasivitet i HCT116-celler [39]. Samt, er liganden uPA reguleret af transskription faktor ETS1, og bindingsstederne for ETS1 i

uPA

promotor skal også demethyleres for transskription at forekomme [40].

laminin beta 3 (LAMB3), en underenhed af laminin-5 (laminin-332), er en kælder membranprotein menes at mediere cellevedhæftning, migration, og organisering af celler under fosterudviklingen. LAMB3 ekspression er højere i malign esophageal pladecellecarcinom end i normalt væv, og ekspression korrelerer med dybden af ​​invasion og overlevelse [41]. LAMB3 er også blevet rapporteret at være hypomethylated og opreguleret i gastrisk cancer [42]. Vi bekræftede, at LAMB3 blev opreguleret i hypoxiske forhold i CRC. Interessant, en undersøgelse undersøgte colonadenocarcinom biopsier, og så laminin-5 positiv farvning var forbundet med spirende cancerceller placeret ved spidsen af ​​invaderende malignt epitel, og at laminin-5 colocalized med PLAUR [43].

Ud over

PLAUR

og

LAMB3

,

S100A10

blev et andet gen opreguleret af både hypoxi og hypoglykæmi baseret på vores array analyse, og har vist sig at være vigtig i kræftcellen invasion og metastase gennem co-lokalisering med uPA /PLAUR systemet [44]. S100A10 overudtrykkes i gastrisk cancer [45] og er afgørende for tumorassocieret makrofag migration til tumorsteder [46]. Vi er den første til at rapportere, at

PLAUR

og

LAMB3

synes at være centrale gen mål i iskæmi-medieret hypometylering, svarende til

S100A4

. PLAUR, LAMB3 og S100A10 kunne arbejde sammen med hinanden for at øge cellulære mobilitet i hypoxiske tumorer. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at fastslå, om disse proteiner er colocalized i hypoxisk væv.

cysteinrige 61 (Cyr61) er et medlem af CCN-familien af ​​vækstfaktorer. Cyr61 er kendt at forbinde celleoverfladen og ECM, og er involveret i celleadhæsion, proliferation og migration [47]. Vi har identificeret

Cyr61

som hypoglykæmi-responsiv gen. Cyr61 ekspression er forøget i en række forskellige cancere, herunder bryst-, melanom, gliom, gastrisk, colon, blære, prostata, og pancreas [47]. Silencing af Cyr61 i osteosarkom og esophageal pladecarcinom celler førte til reduceret migration og celleinvasion [48], [49]. Cyr61 ekspression er blevet vist at korrelere med den aggressive bugspytkirtelkræftceller, hvilket yderligere understreger den rolle, som denne vækstfaktor i metastase [47]. Til dato er der ingen undersøgelser, der viser, at

cyr61

udtryk er reguleret af promotor methylering. Dog er Cyr61 udtryk reguleret af transskription faktor STAT3 [50], og andre har vist, at CpG i STAT3 bindende websted kræver demethylering for STAT3 at binde og give udtryk for sine målgener [51].

To andre gener, der blev opreguleret i vores analyse af hypoglykæmi var

EphA2

NEDD4L

. EphA2 er en transmembran receptor-tyrosinkinase, som overeksprimeres i mange carcinomer, herunder tidlig fase colorectal cancer [52], og dets ekspression er højt korreleret til tumorinvasion og metastase [53]. NEDD4L er en E3 ubiquitin-ligase vist at have forøget ekspression med galdeblæren kræft progression. Ved hjælp af siRNA, lyddæmpning af NEDD4L medførte nedsat Matrigel og kollagen invasion af galdeblæren kræftceller, og dens rolle i invasionen er muligvis på grund af sin tilknytning til MMP [54]. I øjeblikket er der ingen undersøgelser der viser, at promotor demethylering kunne være ansvarlig for opregulering af en af ​​disse to gener.

Melanom-associerede antigener (Mages) er en gruppe af gener, hvis udtryk er bragt til tavshed i de fleste normale somatiske væv, undtagen i testis, men opreguleret i mange cancere [22]. En undersøgelse viste, at promotorregionen af ​​

MAGE-A1

indeholder to ETS bindingssteder som skal demethylerede for transskriptionsfaktoren til at binde og ekspression at forekomme [55]. Demethylering og ekspression blev observeret i flere forskellige cancercellelinier, og behandling med 5-aza-dC forøgede MAGE-A1-ekspression i normale fibroblaster grund af demethylering i promotorregionen. Ekspression af MAGE-A1 og -A4 har vist sig at være korreleret med sygdomsstadium i melanomapatienter [23]. Både demethylering og udtryk for MAGE-A1 og A3 er blevet set i kolorektal cancer [22], og i ikke-småcellet lungekræft patienter hvor udtryk korreleret med dårlig prognose [24]. Vores array-data viste, at to MAGE gener demethyleres af hypoxi (

MAGEA11

) og hypoglykæmi (

MAGEB1

), selvom ingen induktion i ekspression blev observeret. Ikke desto mindre MAGE’er er en gruppe af gener, som understøtter betydningen af ​​demethylerede CpG-rester i transkriptionsfaktorbindingssites, og at demethylering i kræft kan være genspecifikke.

To andre gener involveret i cellulær bevægelse,

AFAP1L1

NTM

, som blev bestemt til at være betydeligt opreguleret i hypoxi og hypoglykæmi ved mikroarrays henholdsvis blev også kvantificeret ved QRT-PCR. Begge disse gener viste ikke forøget udtryk, når kontrolleres af QRT-PCR, muligvis på grund af krydshybridisering af ikke-specifikke sekvenser eller splejsningsvarianter, to almindelige årsager til afvigelser mellem microarray resultater og QRT-PCR [56].

der foreligger tilstrækkelig dokumentation i litteraturen støtter konceptet, at CpG’er inden forskellig transkriptionsfaktorbindingssites (såsom HRE, STAT3 og ETS) skal demethyleres, for transskription at forekomme, og endnu vigtigere, nogle af disse gener er involveret til forøgelse cellemotilitet. I denne undersøgelse har vi bidraget til dette vigtige begreb ved at give beviser gennem cross-platform array analyse for andre cellulære bevægelse gener, som er både hypomethylated og opreguleret af iskæmi. Vi validerede ændringer i ekspressionen af ​​de cellulære bevægelse generne PLAUR, LAMB3, EphA2, NEDD4L, og Cyr61 i iskæmiske tilstande. Det er velkendt, at HIF1α er højere i bryst- og coloncancer metastaser [3]. Denne observation supplerer vores fund, at hypoxi nedsætter methylering, og at et fald i methylering i CpG af hres så kunne lette HIF binding og promotor genekspression. Måske hypoxi-induceret fald i DNMT niveauer er en tidlig begivenhed i primære tumorer. Celler med nedsat DNA methylering er således derefter primet for transskriptionsfaktorbindende til genpromotorer, som vil øge cellulære bevægelse, såsom

PLAUR

. Betydningen af ​​hypoxi i cancer progression er godt demonstreret i cervikale cancerpatienter, hvis tumorer er hypoxisk og har øget forekomst af metastaser i sammenligning med patienter med bedre oxygenerede tumorer [57]. Det er klart, at hypoksi påvirkninger kræft progression, og globale ændringer i DNA-methylering er en fælles begivenhed påvirker kræft progression [58].

IPA analyse af de cross-platform data for gener, der var både hypermethyleret og nedreguleres identificerede gener involveret i cellulære funktioner, såsom cellulær bevægelse og celle-til-cellesignalering og interaktion (tabel II og III i Information S1). Nedregulering af gener involveret i cellulær adhæsion kan begrebsmæssigt bidrage til øget cellulær motilitet og metastase. Med yderligere litteraturgennemgang, er meget få af disse hypermethyleret og nedreguleret gener forbundet med celle-celle-adhæsion. Selvom en interessant idé, er vores data understøtter ikke undertrykkelse af celle-til-celle-adhæsionsmolekyle-ekspression som en sandsynlig mekanisme ansvarlig for den øgede motilitet ses i iskæmi.

DNMT inhibitorer, såsom decitabin er blevet anvendt klinisk med nogle succes i behandling hæmatologiske maligniteter, såsom akut myeloid leukæmi [59]. Imidlertid har effektiviteten af ​​disse inhibitorer ikke er blevet kopieret i faste tumorer [60]. Cancer genomer undergår hypometylering samtidig med hypermethylering [61], hvilket yderligere hypomethylerende med DNMT inhibitorer kun løser den ene halvdel af methylering uorden. Derudover solide tumorer har en unik funktion mangler i hæmatologiske kræftformer: en mikromiljø med iskæmiske områder. Som vi tidligere har vist, er DNMT ekspression og aktivitet reduceret i iskæmiske tilstande [28]. Derfor bruger DNMT hæmmere i tumorer med iskæmiske områder kan være ineffektiv i kræftbehandling, hvis disse områder allerede undergår hypometylering som følge af iskæmi-medieret DNMT undertrykkelse.

Konklusioner

Det er velkendt at iskæmiske tilstande drive kræft metastase, og her foreslår vi en potentiel mekanisme for denne fælles begivenhed: gennem DNA hypometylering lettes ved iskæmi-medieret nedregulering af DNMTs. II. III.