PLoS ONE: Forhøjet Ekspression af serin-arginin Protein kinase en Gene i kræft i æggestokkene og dens rolle i Cisplatin Cytotoksicitet I Vitro

Abstrakt

Alternativt splejsede varianter af flere onkogener og tumor undertrykkere har vist sig at være vigtig for deres tumorigenicitet. I den foreliggende undersøgelse har vi testet, om serin-arginin proteinkinase 1 (SRPK1), en vigtig regulator af splejsningsfaktorer, er involveret i ovariecancer progression og spiller en rolle i kemo-følsomhed. Ved Western blot-analyser blev SRPK1 protein fundet at være overudtrykt i 4 ud af 6 æggestokkene cancercellelinjer sammenlignet med en udødeliggjort ovarie overflade epitelcellelinie; og i 55% af æggestokkene tumorprøver i sammenligning med ikke-neoplastiske ovariale vævsprøver. Reduktion af SRPK1 udtryk ved hjælp små interfererende RNA (siRNA), der koder for lille hårnål RNA i æggestokkene cancerceller førte til (i) reduceret celledeling sats, langsommere cellecyklus progression og kompromitteret forankringsuafhængig vækst og migration evne

in vitro

, (ii) lavere niveau af phosphorylering af multiple serin-arginin proteiner og P44 /42MAPK og AKT-proteiner, og (iii) øget følsomhed over for cisplatin. Sammen disse resultater tyder på, at forhøjet SRPK1 udtryk kan spille en rolle i æggestokkene tumorigenese og SRPK1 kan være et potentielt mål for kræft i æggestokkene terapi

Henvisning:. Odunsi K, Mhawech-Fauceglia P, Andrews C, Beck A, Amuwo O, Lele S, et al. (2012) Forhøjede Ekspression af serin-arginin Protein kinase en Gene i kræft i æggestokkene og dens rolle i Cisplatin Cytotoksicitet

In Vitro

. PLoS ONE 7 (12): e51030. doi: 10,1371 /journal.pone.0051030

Redaktør: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, USA

Modtaget: September 4, 2012; Accepteret: 23. oktober 2012; Udgivet: December 7, 2012 |

Copyright: © 2012 Odunsi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health Tilskud CA 107.303 (RH) Gynækologisk Cancer Foundation (RH), DK60632 (JDB), og CA16056 (RPCI Core Grant); Cancer Research Institute /Ludwig Institute for Cancer Research Cancer Vaccine Collaborative Grant (KO); og Hilton-Ludwig Cancer Metastase Udstedelse af Ludwig Institute for Cancer Research (KO). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

det er blevet anslået, at 35-59% af humane gener alternativt splejses, hvilket i høj grad bidrager til kompleksiteten af ​​humane cellulære funktioner [1], [2]. Det er derfor ikke overraskende, at aktiviteterne i nogle onkogener og tumorsuppressorgener moduleres ved alternativ splejsning [3], [4]. For eksempel, uregelmæssig alternativ splejsning af visse tumorsuppressorer, såsom brystcancer 1 og 2 (BRCA1 /2) [5], Wilms tumor 1 (WT1) [6], og adenomatøs polypose coli (APC) [3], resulterer i mutationer, der tegner sig for nedarvet og sporadisk modtagelighed for kræft. Desuden er der fundet visse splejsningsfaktorer at være overudtrykt i tumorer og har været impliceret som kræftpsykologisk proteiner [7], [8].

SRPK1 (serin-arginin proteinkinase 1) tilhører SR kinase familien af ​​proteiner og regulerer SR familien af ​​splejsningsfaktorer. De SR splejsningsfaktorer er nogle af de hjælpestoffer proteiner, der kræves til præ-mRNA-splejsning i pattedyrceller. SR proteiner er kendetegnet ved et eller to RNA anerkendelse motiver ved N-terminalen og et SR-rige domæne ved C-terminalen [9], [10], [11]. SR-domænet antages at fremme protein-protein interaktioner under samling [12]. SR proteiner reguleres af reversibel phosphorylering medieret af SRPK1. Mens phosphorylerede SR proteiner er nødvendige for at indlede spliceosome samling i den tidligste fase, dephosphorylering er afgørende for splejsning at finde sted i spliceosome [13], [14]. Beviser har vist, at både hypo- og hyper-phosphorylering af SR proteiner er til skade for splejsning [14], [15]. Er niveauet af SRPK1 er derfor afgørende for at opretholde den rette balance mellem phosphorylerede og dephosphorylerede SR proteiner. Overekspression af SRPK1 protein er blevet dokumenteret i akut typen voksen T-celleleukæmi [16], kronisk myeloid leukæmi [17] pancreas, bryst, og tyktarmskræft [18], [19], [20]. Interessant er SRPK1 udtrykt i voksne mandlige kimceller, men generelt ikke i de fleste andre normale voksne væv, hvilket antyder en cancer /testis-lignende fordeling [16], [21]. Sammen disse undersøgelser tyder på, at SRPK1 vil kunne spille en vigtig rolle i udviklingen af ​​kræft.

Vi [22] og andre [23] har tidligere fundet, at inaktivering af

SKY1

, gær homolog af splejsning faktor SRPK1, øger modstanden af ​​gærceller til cisplatin (cDDP). Men om SRPK1 ekspression spiller en rolle, når følsomhed eller resistens af humane tumorer for kemoterapi fortsat uklart af følgende grunde. For det første har lavere SRPK1 ekspression blevet vist at korrelere med resistens for ovarie [23], testikel [20] og HT29 [24] tumorcellelinier til platinholdige behandlingsregimer. For det andet er det for nylig blevet vist, at afbrydelse af SRPK1 udtryk ved siRNA øger apoptose forårsaget af cDDP i pancreas, kolon og brystkræft cellelinier [18], [19].

I den foreliggende undersøgelse søgte vi at undersøge hvorvidt SRPK1 ekspression er forbundet med ovariecancer progression, hvorvidt ekspressionsmønsteret for SRPK1 korrelerer med kliniske respons på behandling involverer cDDP og hvorvidt inhibering af SRPK1 ændrer følsomhed ovariecancerceller til cDDP. Først fandt vi, at forhøjet SRPK1 proteinniveau var til stede i ca. 55% af æggestokkene tumorprøver i sammenligning med ikke-neoplastiske ovariale vævsprøver. For det andet, siRNA-medieret hæmning af SRPK1 førte til reduceret OVCa celleproliferation sats,

in vitro

cellemigrering, tumorigent potentiale og langsommere progression af cellecyklus. Disse fænotyper var forbundet med SRPK1-medierede ændringer af MAPK /AKT signalveje, da niveauerne af phosphoryleret (aktiveret) MAPK /AKT-protein blev reduceret i SRPK1 knockdown celler. Endelig i modsætning til gærsystemet, vi gjort den overraskende iagttagelse, at inhibering af SRPK1 forøget følsomhed over for cDDP behandling, hvilket antyder, at SRPK1 kan være et mål for behandling af ovariecancer.

Materialer og Metoder

Etik Statement

undersøgelsen med menneskelige forsøgspersoner blev gennemført under en protokol godkendt af RPCI Institutional Review Board (CIC0215). Alle vævsprøver blev indsamlet fra patienter, som forudsat skriftligt informeret samtykke.

Patienter og æggestokkene Tumor Prøver

Flash frosne vævsprøver (n = 47) blev opnået fra patienter, der gennemgår debulking operation for epitelial ovariekræft ved Roswell Park Cancer Institute (RPCI), Buffalo, NY mellem 1995 og 2006. Normale æggestokkene prøver (n = 9) blev opnået fra patienter, der gennemgår hysterektomier for godartede lidelser som leiomyom. Clinicopathologic oplysninger for hele kohorten, herunder respons på kemoterapi, opretholdes i en database ved Institut for Gynækologisk onkologi.

Cell Culture

Ovariecancer cellelinjer SKOV3 og OVCAR3 blev opnået fra den amerikanske Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). A2780 og A2008-celler og deres cDDP-resistente modstykker A2780 /CP [25] og A2008 /C13 [26] celler blev opnået fra Dr. Steven Howell (University of California, San Diego). Disse celler blev holdt i RPMI1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). En ikke-transformeret ovarie overflade epitelcellelinie (IOSE-385, i det følgende betegnet som IOSE) blev udødeliggjort med den tidlige SV40-gener [27] og opnået fra Dr. Nelly Auersperg (University of British Columbia, Canada). IOSE celler blev opretholdt i M199 /MCDB 105 medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) suppleret med 5% FBS og gentamycin (Invitrogen, Carlsbad, CA).

shRNA og redning-SRPK1 konstruktioner

shSRPK1-1 og shSRPK1-2, der koder shRNA målretning nukleotider 288 til 308 (CAAGAAGATCCTAATGATTA) og 1423-1443 (GGTCAGTCATTCAGTGAACAA) henholdsvis af SRPK1 mRNA, blev købt hos Open Biosystems (Huntsville, AL). Til transfektion, SKOV3 og A2780 /CP-celler blev podet i 6-brønds plader til 80% konfluens og transficeret med 3-4 pg plasmid-DNA under anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). RNA og proteiner fra kontrol eller shSRPK1-transficerede celler blev analyseret 3 dage efter transfektion. Stabile shSRPK1 kloner blev selekteret under anvendelse af 2 ug /ml puromycine i 3 uger. For SRPK1-redning plasmid, en primer, der indeholder 3 silenct mutationer (GCAAGAAGATCCTAATGATTA, understregning nukleotider blev ændret til G, G, C) inden for de shSRPK1-1 målsekvenser blev indført i p-CMV-flag-SRPK1 plasmid (en gave fra Dr. Xiang-Dong Fu, University of California, San Diego) ved hjælp af asymmetrisk PCR [28]. Transfektion blev udført som beskrevet ovenfor og stabile kegler blev udvalgt under anvendelse G418 (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Kemikalier Salg

Cisplatin (cDDP,

cis

-diammine-dichlor platin II) og MTT {3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid} blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Stock cDDP opløsning blev fremstillet i DMSO (330 mM), opbevaret som aliquots ved -20 ° C, og anvendes inden for 2 uger. cDDP blev yderligere fortyndet i medium før tilsætning til cellerne.

Western blot-analyse

Tyve til tredive milligram frosset tumorvæv blev homogeniseret med en morter og støder i vævsprøven buffer (10% SDS , 5% β-mercaptoethanol, 50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 10% glycerol) for protein ekstraktion. Cellelysater blev ekstraheret ved anvendelse af RIPA puffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% deoxycholsyre, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCI, pH 8,0). Proteiner blev adskilt ved 10% SDS-PAGE, overført til PVDF-membran (Milipore, Billerica, MA) og blokeret i TBS indeholdende 0,05% Tween-20 og 5% tørmælk natten over ved 4 ° C. Blots blev inkuberet med primært antistof i 1-2 timer, og derefter med peroxidase-konjugeret sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur. Efter inkubation blev membranerne vasket gentagne gange og proteiner blev visualiseret ved anvendelse af ECL (enhanced Chemiluminescens) kit (Pierce, Rockford, IL). Signalet var digital fotograferet og kvantificeres ved hjælp af densitometri med en Alpha imager (Alpha Innotech, San Leandro, CA). Antistoffer anvendt til at påvise SRPK1 var fra BD Biosciences (San Jose, CA), phosphorylerede SR proteiner var mAB104 [29] isoleret fra hybridomceller (ATCC, Manassas, Virginia), total p44 /42 MAPK og AKT (Akt1 /2/3 , sc-8312) var fra Cell Signaling (Danvers, MA) og Santa Cruz henholdsvis phosphoryleret MAPKp42 /44 (Thr

202 /Tyr

204) og AKT (Ser

473 /Thr

308) var fra Cell Signaling (Danvers, MA), antistof mod Upf1 var en gave fra Dr. Harry Dietz (Johns Hopkins University). Anti-actin var fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Data blev udtrykt som relativ fold udtryk løbet actin.

immunhistokemisk farvning

Sektioner (4 um tyk) fra formalin-fikseret, paraffinindstøbt normal æggestok og tumorvæv blev behandlet til IHC som tidligere beskrevet [30]. Endogen peroxidase blev blokeret med 0,3% hydrogenperoxidase i 30 min. Antigen genfinding blev udført i høj pH-buffer i en damper for SRPK1 antistof (BD Biosciences). For negativ kontrol blev musen-IgG anvendes.

Reverse-transkription polymerasekædereaktion (RT-PCR) Analyse

Totalt RNA blev ekstraheret fra ti millioner celler ved anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen) ifølge til producentens anvisninger. cDNA blev syntetiseret fra 2 ug totalt RNA i 20 pi reaktionspuffer ved hjælp af M-MuLV revers transkriptase, Ribolock ribonucleaseinhibitor (Fermentas Life Science, Glen Burnie, MD) og tilfældige hexamere primere efter DNasel-fordøjelse. De cDNA produkter blev anvendt til semi-kvantitativ PCR ved anvendelse af Taq DNA-polymerase (Fermentas Life Science, Glen Burnie, MD) Primerne for SRPK1 (SRPK1-R, 5′-TGTTGTCCAGTGGTCCGTTA, og SRPK1-exon10, 5’CAAGAAAAACTTGAAGAGTC) blev udformet ifølge NCBI referencesekvenserne. GAPDH (glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase) blev anvendt som reference målsekvens (primere: 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC og 5’GAAGATGGTGATGGGATTTC). Salg

Klonogen Survival Assay

Celler (3 x 10

2) blev podet i plader med 6 brønde natten over og behandlet med cDDP i 24 timer. Efter fjernelse af lægemidlet blev celler vasket med PBS og igen fodret med stoffri medium og inkuberet i 10-14 dage. Kolonier blev farvet med 0,1% krystalviolet og talt. Procent celleoverlevelse udtrykkes i forhold til ubehandlet kontrol. Salg

MTT assay

Celler (5 x 10

3) blev podet i plader med 96 brønde i tre eksemplarer natten over og behandlet med cDDP i 72 time, MTT blev tilsat i 4 timer, og formazan farvestof blev opløst med DMSO og aflæst ved 540 nm i en FL6000 mikropladelæser (BIO-TEK Instruments, Winooski, VT). Procent celleoverlevelse udtrykkes i forhold til ubehandlet kontrol.

forankringsuafhængig vækst Assay Salg

Celler (5 x 10

3) blev podet i tre eksemplarer på 6-brønds plader indeholdende et toplag 0,3% blød agar og en 0,5% agar base. Fireogtyve time senere, blev det gennemsnitlige antal celler podet pr område bestemt ved at tælle celler i 5 forskellige områder under lysmikroskop. Dannede kolonier ( 0,1 mm i diameter) efter 3 ugers vækst i blød agar blev talt; 10 forskellige felter blev kvantificeret per brønd og det gennemsnitlige antal kolonier pr felt blev beregnet. AIG (vækst forankringsuafhængig) indeks blev udtrykt i forhold til antallet af celler podet.

sårheling (bunden) Assay

Celler blev podet i 60-mm plader til sammenflydning og cellen monolag blev skrabet i tre lige linjer med en 200-pi pipettespids til at skabe “ridser”. Debris blev fjernet med PBS og derefter kulturen blev fodret igen med frisk medium. Photohgraphs af sårområdet blev taget ved 0 og 28 timer efter ridser at beregne cellemigrering sats. Tyve tilfældige målinger blev taget for hvert tidspunkt. De relative migrerende afstande af de viklede områder blev målt på billederne.

Cell Cycle Analysis

Celler blev synkroniseret ved G2 /M-fasen ved behandling med nocodazol (600 ng /ml) i 12 timer , vasket to gange med PBS og derefter i medium uden lægemiddel. Celler blev også synkroniseret ved G0 /G1 ved anbringelse i serum-frit medium i 48 timer. De hvilende celler blev stimuleret til at genindtræde i cellecyklusen ved tilsætning af 10% FBS. På hvert anført tidspunkt blev cellerne opsamlet og vasket med kold PBS (phosphatpufret saltvand og fikseret i 70% ethanol i mere end 15 min). Celler blev derefter behandlet med RNase (50 ug /ml) i 1,0% natriumcitrat ved 37 ° C i 30 minutter og derefter farvet med propidium iod (50 ug /ml) i 15 min. DNA-indholdet blev målt med en fluorescens-aktiveret celle-analysator (FACScan flowcytometer, Becton Dickson, San Jose, CA). Procentdelen af ​​celler i hver fase af cellecyklussen blev bestemt ved hjælp af WinList og ModFit programmer (Verity Software House, Topsham, ME).

Statistisk analyse

blev udført Statistisk analyse ved hjælp af GraphPad Prism V4.03 Software og R V2.7.0 Statistisk Computing Environment. En

s

-værdi mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Studerendes

t

-test blev brugt til de fleste sammenligninger af SRPK1 RNA og protein-ekspression vs klinisk-patologiske parametre. Metoderne til Kaplan og Meier og Cox blev anvendt til at estimere median overlevelsestid og hazard ratio.

Resultater

SRPK1 Expression er forhøjet i visse ovariekarcinom cellelinjer og ovarietumorer

Vi har tidligere vist sig, at inaktivering af gæren SR proteinkinasen Sky1p bibringer resistens over for cisplatin [22]. Imidlertid er niveauet af det humane SRPK1 gen været både positivt og negativt korreleret med modstand af tumorceller til behandlingsregimer indeholdende platin [18], [19], [20], [23]. Vi satte os for at se nærmere på forholdet mellem udtrykket niveau SRPK1 genet og cDDP modstand i human ovariecancer (OVCa). Vi anvendte først en semi-kvantitativ RT-PCR (revers-transkriptase polymerasekædereaktion) analyse for SRPK1 RNA-ekspression i 6 OVCa cellelinier med differentiel cDDP følsomhed (figur 1A, bundpanel). Hvoraf nogle var mindst 6 gange mere modstand mod cDDP end en ikke-transformeret ovarie overflade epitelial cellelinje (IOSE), der var immortaliseret med den tidlige SV40-gener [27]. Dataene viser, at der ikke var nogen klar korrelation mellem cDDP resistens fænotype og RNA niveauer af disse gener blandt disse cellelinjer. Imidlertid blev SRPK1 mRNA-niveau forhøjede i 4 ud af 6 cellelinjer, sammenlignet med den for de IOSE celler (figur 1A). Dernæst vurderede SRPK1 proteinekspression i ovennævnte cellelinjer under anvendelse af Western blot-analyse. Det relative niveau af SRPK1 protein blev bestemt ved normalisering med den for husholdning genet actin. Figur 1B viser, at SRPK1 protein også er forhøjet i 4 ud af 6 ovariekarcinom-cellelinier (defineret som 2 gange over gennemsnittet for IOSE prøve), omend med en lidt anden mønster fra den af ​​RNA. Vi har bemærket, at de udødeliggjort IOSE cellerne også udtrykker vist niveau af SRPK1. Dette er ikke overraskende, da andre også har vist, at immortalisering af ovarieepitelceller, sammenlignet med de ikke-immortaliserede normale humane OSE celler, øger ekspressionen af ​​et splejsning faktor, polypyrimidine tarmkanalen protein [8]. Svarende til mRNA-ekspression, fandt vi ingen klar korrelation mellem cDDP resistens fænotype og SRPK1 proteinniveauet blandt disse cellelinjer. Da gen niveauer i langsigtede dyrkede cellelinjer kan ændres, vi næste undersøgt SRPK1 udtryk i arkiverede OVCa tumorprøver fra OVCa patienter, som blev behandlet med platin-regimer efter operationen. For at vurdere særligt udtryk for SRPK1 protein i tumor epitel på celleniveau, vi udførte immunhistokemisk farvning (IHC) på paraffin vævssnit. Figur 2A viser, at SRPK1 farvning var næsten ikke-eksisterende i normal ovarie epitel. I modsætning hertil blev SRPK1 farvning let påvises i ovarietumorer, med farvningsintensitet spænder fra svag til stærk og fremfører overvejende i cytoplasmaet af epitelceller. Det cytoplasmatiske lokalisering af SRPK1 i OVC tumorprøver ligner resultaterne i vævskulturceller [15]. Da ovarietumorer består hovedsagelig af epitelceller, blev niveauet af SRPK1 i protein homogenater fra 47 frosne tumor og 9 ikke neoplastiske vævsprøver undersøgt under anvendelse af Western blot-analyse. Figur 2B viser de immunobloting resultater fra 21 tumor og 9 ikke neoplastiske vævsprøver. Densitometrisk analyse af SRPK1 og actinniveauer blev udført, og det relative ekspressionsniveau for SRPK1 blev normaliseret med niveauet af actin. Vi fandt, at 26 ud af 47 (55%) tilfælde overudtrykkes SRPK1 (defineret som større end to gange i forhold til gennemsnittet af de ni normale prøver).

(A) Kvantitativ realtid revers-transkription polymerasekædereaktion (RT-PCR) analyse af SRPK1 RNA-niveauet i 6 OVCa celler og IOSE celler. GAPDH blev brugt til lastning kontrol og normalisering. Halvtreds procent væksthæmning koncentration (IC

50, uM) af cDDP for OVCa cellerne var angivet nederste panel). (B) Western blot-analyse af SRPK1 protein i 6 OVCa celler og IOSE celler. Det nedre bånd i blot probet med anti-SRPK1 antistof er sandsynligvis proteolytisk fragment af SRPK1. Blottene blev re-probet med actin, der blev anvendt som en loading kontrol og til normalisering. Graf repræsenterer relative ekspression bestemt ved densitometrisk måling af båndene og udtrykkes i forhold til actin. Bar-graph vist er gennemsnittet af 4 eksperimenter. Overekspression af SRPK1 i OVCa blev defineret som større end 2 gange i forhold gennemsnittet af de IOSE prøver og er markeret med stjerner.

(A) Immunohistokemisk farvning for SRPK1 proteinekspression i normale og tumor æggestok vævssnit . Cellerne farves positivt for SRPK1 antistof er brune. For negativ kontrol blev det vært-IgG anvendes (ikke vist). E, epitel; S, stroma. (B) Western blot-analyse af SRPK1 protein i 21 ovariale tumorprøver (t), og 9 ikke neoplastiske ovariale vævsprøver (N). Den normale og tumor prøver i laveste panelet blev beskåret fra to forskellige blots med henblik på præsentationen. De nedre bånd i blot probet med anti-SRPK1 antistof er sandsynligvis proteolytiske fragmenter af SRPK1. (C) Box-Whisker plot med SRPK1 /actin fold udtryk stammer fra densitometrisk analyse af bands i Western blot-analyse. Whiskers omfatter alle tumorer (n = 47) eller de normale prøver (n = 9), kasser indeholder 50% af data, og centret linjer i kasserne viser medianer. Middel udtryk blev sammenlignet ved Students

t

-test (p = 0,03).

De fleste af de 47 patienter testet præsenteret med grad 3 tumorer (91%), på scenen IIIC (76%), og med serøs histologi (85%). Den mediane overlevelse for alle patienter var 39,7 måneder {konfidensinterval (CI), 26,5-∞ måneder}, mens median sygdomsfri overlevelse, eksklusive patienter med vedvarende /progressiv sygdom efter indledende behandling, var 17,5 måneder (CI, 14,4-35,9 måneder). Ved hjælp af en Cox regressionsmodel vi ikke observere en klar sammenhæng mellem SRPK1 niveau og overordnede (p = 0,26) eller sygdomsfri overlevelse (p = 0,62) i de æggestokkene kræftpatienter. SRPK1 niveauer blev ikke korreleret til histologi, grad, eller klinisk respons på cDDP-holdige kemoterapi. Imidlertid var den gennemsnitlige relative fold ekspression af SRPK1 protein var signifikant forskellig mellem tumorprøver og normale prøver (figur 2C, uafhængige prøver t-test, p-værdi = 0,03). Således er vores data viser, at forhøjet niveau af SRPK1 proteinekspression er en hyppig begivenhed i ovarieepitelceller maligniteter.

at reducere niveauet af SRPK1 af Short Hårnål RNA Forbedrer cDDP Cytotoksicitet

Det er vist, at afbrydelse af SRPK1 ekspression ved små interfererende RNA øger apoptose forårsaget af cDDP i pancreas, kolon og brystcancercellelinier [18], [19]. For at teste, om knockdown af SRPK1 genet i OVCa celler påvirker deres følsomhed over for cDDP, vi målrettet dette gen ved to positioner i kinasedomænet med to forskellige konstruktioner af korte hårnål RNA (sh-SRPK1-1 og sh-SRPK1-2) i SKOV3 og A2780 /CP-celler, som begge er relativt mere modstandsdygtige over for cDDP end IOSE celler og nogle andre OVCa cellelinier (figur 1a). Som kontroller blev vektoren pSM2-EV også transficeres i begge cellelinier. Transient transfektion (48 timer) af enten konstruere specifikt reducerede SRPK1 mRNA (data ikke vist) og proteinniveau som bekræftet ved Fornyet probing Western blots med antistof mod et ikke-beslægtet protein, Upf1, og actin blev anvendt som en loading kontrol (figur 3A). Den hæmmende effekt af shSRPK1-2 konstruktion er mere markant end den shSRPK1-1. Brug af formazan farve (MTT) assay Figur 3B viser, at en reduktion SRPK1 protein i SKOV3-celler resulterede i forøget følsomhed over for cDDP behandling (parret t-test og * angiver P 0,05). For yderligere at studere kemo-sensibiliserende effekt af at hæmme SRPK1, genereret vi stabile kloner med forskellige shRNA kræfter i SKOV3 celler. Vi opnåede adskillige kloner med reduceret SRPK1 mRNA og protein som vurderet ved RT-PCR og Western blot-analyse, hhv. To af dem er vist i figur 3C, hvor SRPK1 proteinniveau blev reduceret til ca. 60% (pshSRPK1-c4, målrettet ved sh-SRPK1-2) eller 20% (pshSRPK1-c5, målrettet ved sh-SRPK1-1) af kontrollen pSM2-EV-celler. SRPK1 niveauer i disse kloner korrelerer omvendt med deres cDDP følsomhed som bestemt ved kolonidannelse assayet (figur 3D). Disse data indikerer, at SRPK1 spiller en rolle i modulering cDDP cytotoksicitet

in vitro

og at målrette nukleotider 288 til 308 SRPK1 mRNA resulterede i en stærkere lyddæmpende effekt.

Æggestokkræftceller var transient ( A) eller stabilt (C) transficeret med enten siRNA-kodende shSRPK1 plasmid eller tom vektor (pSM2-EV). Proteinniveauer af SRPK1, UPF1 og actin blev bestemt ved Western blot analyse. Repræsentative blots fra tre uafhængige eksperimenter er vist. (B) og (D) SRPK1 knockdown forbedrer cisplatin cytotoksicitet. (B) Celler (5 x 10

4) blev genpodedes 24 timer efter transfektion, behandlet med forskellige koncentrationer af cisplatin i 48 timer, og antallet af overlevende celler blev analyseret ved MTT-assayet. Overlevelse (%) udtrykkes i forhold til ikke-behandlede pSM2-EV-celler. (D) Stabile transfektanter (3 x 10

2) blev podet i tre eksemplarer, behandlet med cisplatin i 24 timer og kolonidannelse blev vurderet efter 10-14 dage. Data blev analyseret med envejs-ANOVA og * angiver P 0,05; barer, SD.

Knockdown af SRPK1 Expression Nedsat Cell Proliferation og

in vitro

tumorigent potentiale af SKOV3 Celler

data vist i figur 3D viser også, at celler med reduceret SRPK1 udtryk ved shRNA voksede langsommere end kontrol- pSM2-EV celler. De dannede færre kolonier end den ikke-behandlede kontrolgruppe i fravær af cDDP behandling. For yderligere at teste om reduktion SRPK1 ekspression inhiberer ovariecancer celleproliferation, fordoblingstiden for pSM2-EV og pshSRPK1-C5 celler blev sammenlignet. Celleproliferation blev bestemt i eksponentielt voksende celler ved trypsinisering og trypanblåt udstødelse på 24, 48, 72, og 96 timer efter udpladning. Figur 4A viser, at fordoblingstiden for pshSRPK1-c5 er ca. 1,4 fold af kontrol- pSM2-EV-celler (31 timer vs. 22 timer). Dette blev bekræftet ved MTT-assay (data ikke vist). Derefter undersøgte vi den tumorigene potentiale SRPK1 hjælp af forankringsuafhængig vækst (AIG) assay. SRPK1 Knockdown og kontrolceller blev podet i blød agar og lades vokse i 3 uger. Figur 4B viser, at begge shSRPK1 kloner producerede færre og mindre kolonier i blød agar, hvilket tyder på en reduktion i

in vitro

tumorigenicitet. Cellemotilitet er en af ​​de faktorer, der bidrager til tumorcelleinvasion. For at teste, om cellemigration evne er kompromitteret i SRPK1 knockdown celler, blev en

in vitro

celle migration (sårheling) assay udføres. Figur 4C viser, at den gennemsnitlige migration sats for shSRPK1-C5-celler (5,8 ± 0,81 enhed) var cirka 60% af det for kontrol- pSM2-EV-celler (9,9 ± 1,5 enhed). Sammen indikerer vore data, at SRPK1 bidrager til celleproliferation,

in vitro

cellevandring og tumorigene potentiale SKOV-celler.

(A) Cell proliferationsassay. Celler (1 x 10

4) blev udsået in triplo i en 24-brønds plade, trypsiniseret og talt i nærværelse af trypanblåt på de angivne tidspunkter. (B) forankringsuafhængig vækst assay. Celler (5 x 10

3) blev podet i blød agar og koloni blev bestemt 21 dage senere. Repræsentative områder af kolonierne i blødt agar plader er også vist. De viste data er gennemsnittet af tre uafhængige forsøg og blev analyseret med parret t-test; * Viser P 0,05, barer, SD. SKOV3-celler blev podet som en positiv kontrol. (C)

In vitro

sårheling assay. Konfluente celler blev ridset med en 200 ul-tip til at generere lige line-huller. Billeder af hullerne blev taget ved 0 og 28 timer og bredden af ​​mellemrummene (hvid stiplede linier) blev målt under et lysmikroskop for at beregne hastigheden af ​​cellevandring. Repræsentative billeder vises på venstre og relative vandreklitter afstande (sår lukning) vist til højre blev beregnet fra 20 områder fra hver plade. De viste data er fra tre uafhængige forsøg.

Stjernerne

vise signifikante forskelle i forhold til kontrol (

P

0,05).

Knockdown af SRPK1 Expression Reduceret fosforylering af visse SR Proteiner og MAPK /AKT Proteiner

SR proteiner er de direkte mål for SRPK1 [15]. forventes fosforylering mønster af disse SR splejsningsfaktorer at blive påvirket i SRPK1 knockdown celler. For at teste denne forudsigelse, Western blot-analyse under anvendelse af en pan antistof, der genkender en phospho-specifik epitop fælles for flere SR proteiner [29] blev udført. Som forventet reduceret SRPK1 ekspression resulterede i en nedsat mængde phosphorylering af visse SR proteiner i SKOV3-celler (figur 5, midterste panel). Det er interessant at bemærke, at forskellige SR proteiner påvirkes mellem shSRPK1-C4 og shSRPK1-C5 kloner. For eksempel blev niveauet for SRp55 reduceret meget mere i shSRPK1c5 end i shSRPK1-C4-celler. Det modsatte er tilfældet for SRp40 og SRp20. Forskellen knockdown af SRPK1 observeret i disse to kloner (figur 5, top panel) kan forklare forskellene i substratphosphorylering. Niveauet af SRPK1 enzym kan bestemme dens substrat anerkendelse og katalytisk aktivitet. Forskellene i SRPK1 plan mellem shSRPK1-C4 og shSRPK1-C5 kloner afspejles også i celledeling og følsomhed over for cisplatin (se nedenfor) påvirkes af SRPK1 nedregulering.

Western blot analyse blev udført på lysater fremstillet af SKOV3 afledt pSM2-EV-celler og to stabile SRPK1-knockdown kloner. Antistoffer blev brugt til at påvise de phosphorylerede SR proteiner (mAB104), MAPK42 /44 (Thr

202 /Tyr

204), og AKT (Ser

473 /Thr

308) samt total protein niveauer af MAPK42 /44, og AKT.

Det er velkendt, at aktivering, dvs. forhøjet niveau af phosphorylering af MAPK (mitogenaktiveret proteinkinase) og AKT signalveje er involveret i mange maligniteter ( 29, 30), og at disse veje regulerer præ-mRNA-processering [31], [32]. Den fosforylering mønster af de to centrale transducere af spredning signaler, P44 /42-MAPK (Erk1 og ERK2) og AKT blev analyseret i SRPK1 knockdown celler. Figur 5 viser, at pshSRPK1-C4 og pshSRPK1-C5 celler havde reducerede niveauer af phosphoryleret P44 /42-MAPK (p-MAPK) og AKT (p-AKT) proteiner. I modsætning hertil blev den samlede mængde af MAPK og AKT-proteiner, der ikke påvirkes af hæmning af SRPK1 udtryk. De reducerede niveauer af phosphoryleret P44 /42-MAPK og AKT korreleret med langsommere vækst af SRPK1 knockdown celler (figur 4). Disse data antyder, at SRPK1 spiller en rolle i regulering af aktiverede former af MAPK og /eller AKT proteiner.

SRPK1-knockdown Celler Exhibit Langsommere cellecyklusprogression

Data beskrevet ovenfor indikerer, at inhibering