PLoS ONE: Dynamisk vs Static ABCG2 Inhibitors at bevidstgøre Drug Resistant Cancer Cells

Abstrakt

Menneskelig ABCG2, medlem af ATP-bindende kassette transporter superfamilien, spiller en central rolle i multiresistens og beskytter cancerstamceller . ABCG2-knockout havde ingen tilsyneladende skadelig virkning på udviklingen, biokemi, og livet af mus. , ABCG2 er således en interessant og lovende mål for udvikling af kemo-sensibiliserende midler til bedre behandling af lægemiddelresistente kræftformer og til at fjerne kræft stamceller. Tidligere rapporterede vi en roman to tilstand virkende ABCG2 hæmmer, PZ-39, der inducerer ABCG2 nedbrydning ud over at hæmme dets aktivitet. I dette manuskript, rapporterer vi vores seneste fremskridt inden identificere to forskellige grupper af ABCG2 hæmmere med én hæmme kun ABCG2 funktion (statisk), og den anden inducerer ABCG2 nedbrydning i lysosomer ud over at hæmme dens funktion (dynamisk). Således kan-hæmmerinduceret ABCG2 nedbrydning være mere udbredt, end vi tidligere forventet og yderligere undersøgelser af de dynamiske inhibitorer, der inducerer ABCG2 nedbrydning kan give en mere effektiv måde at sensibiliserende ABCG2-medieret MDR i kræft kemoterapi.

Henvisning : Peng H, Qi J, Dong Z, Zhang JT (2010) Dynamisk

vs

Statisk ABCG2 Inhibitors at bevidstgøre Drug Resistant kræftceller. PLoS ONE 5 (12): e15276. doi: 10,1371 /journal.pone.0015276

Redaktør: Wenqing Xu, University of Washington, USA

Modtaget: 21 september, 2010; Accepteret: November 3, 2010; Udgivet: December 7, 2010

Copyright: © 2010 Peng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af National Institutes of Health giver CA113384 og CA120221 (JTZ) og ved en Showalter Foundation tilskud (ZD). Jing Qi er en modtager af det amerikanske forsvarsministerium Breast Cancer Research Program Postdoc Fellowship. Hui Peng understøttes i øjeblikket, delvis ved NNSF af Kinas tilskud nr 30873083. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.

Konkurrerende interesser : forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

ABCG2 er medlem af ATP-bindende kassette (ABC) transportør superfamilien og overekspression af ABCG2 har vist sig at forårsage. multilægemiddelresistens (MDR) i model cancercellelinier og at korrelere med dårlig prognose i både voksne og leukæmi hos børn og brystkræftpatienter (for gennemgang se [1], [2], [3]). Modsætning til de fleste andre medlemmer af ABC transportør superfamilien såsom P-glycoprotein (MDR1 /ABCB1), ABCG2 betragtes som en halv transportør bestående af et nukleotid-bindende domæne (NBD) ved aminoterminus og et membranspændende domæne (MSD) ved carboxylterminalen. Det har således været anset for at eksistere og fungere som en homo-dimer. viste dog, nylige beviser på, at ABCG2 kan eksistere og fungere som en højere orden af ​​oligomer bestående af 8-12 identiske underenheder [4], [5] og oligomerisering arealer formentlig placeret i MSD [6].

i processen med det formål at sensibilisere MDR medieret af ABCG2, en række ABCG2 inhibitorer er for nylig blevet opdaget [7], [8], [9], [10], [11], [12] ud over den tidligere identificerede dem som Fumitremorgin C (FTC) (for en gennemgang se [2]). En af disse ABCG2 inhibitorer, PZ-39, var meget effektiv og karakteristisk fra andre, såsom FTC med evnen til at forårsage lysosom-afhængig nedbrydning af ABCG2 protein [7].

For yderligere at bestemme om inhibitor-induceret ABCG2 nedbrydning er unik for PZ-39, vi testede andre ABCG2 hæmmere genereres under vores indledende screening, som førte til identifikation af PZ-39. Vi fandt to typer ABCG2 inhibitorer med én inhiberende ABCG2 aktivitet kun (statisk), og den anden inhiberende ABCG2 aktivitet samt inducere ABCG2 nedbrydning via lysosomer (dynamisk). Disse resultater tyder på, at inhibitor-induceret ABCG2 nedbrydning i lysosomer kan være mere udbredt end det tidligere har været forventet, og yderligere undersøge de dynamiske inhibitorer, der inducerer ABCG2 nedbrydning i lysosomer kan give en mere effektiv måde at sensibiliserende ABCG2-medieret MDR i kræft kemoterapi.

Resultater

To typer af ABCG2 hæmmere

Tidligere vi rapporterede, at den rationelle screening af repræsentanter for forskellige typer af sammensatte bibliotek fra Specs (www.specs.net) førte til identifikation af en to-mode virkende ABCG2 inhibitor PZ-39 [7]. Under den indledende screening, flere andre ABCG2 hæmmere, som er strukturelt forskellige fra PZ-39 og dets derivater (Fig. 1), blev også identificeret og deres aktivitet til at hæmme ABCG2-medieret lægemiddel efflux er blevet bekræftet ved hjælp af HEK293 celler med overekspression for ektopisk ABCG2 (HEK293 /ABCG2) (fig. 2A). For at bestemme om disse inhibitorer også besidder den to-mode virkende egenskab, vi først testet effekten af ​​disse inhibitorer på ABCG2 ekspression under anvendelse af Western blot-analyse. Som vist i fig. 2B, tre af de fire nye inhibitorer (PZ-8, 34, og 38) sammen med PZ-39 inhiberer ABCG2 ekspression mens PZ-16 ikke gør. Sammen med vores tidligere fund, at FTC hæmmer kun ABCG2 aktivitet [7], vi konkludere, at der er sandsynlige to typer ABCG2 hæmmere med en hæmmer kun ABCG2 aktivitet, mens den anden hæmmende både aktiviteten og ekspressionen af ​​ABCG2.

de kemiske strukturer er vist for PZ 8-, (12E)-N’-((5-(3,4-dihydro-4-oxo-3-phenylquinazolin-2-ylthio)furan-2-yl)methylene)-2-(4-ethylphenoxy)acetohydrazide; PZ-16, 2- (4- (4-nitrophenoxy) phenyl) -2-oxoethyl2- (2- (4- chlor benzamido) acetamido) acetat; PZ-34, (E) -2- (4-ethoxyphenyl) -N ‘- (1- (4- (furan-2-carboxamido) phenyl) ethyliden) quinolin-4-carbohydrazid; PZ-38, (N-(2,5-dimethoxyphenyl)-2-({4-[4-(dimethylamino)benzylidene]-5-oxo-1-phenyl-4,5-dihydro-1H-imidazol-2-yl}sulfanyl)acetamide); og PZ-39 (N- (4-chlorphenyl) -2 – [(6 – {[4,6-di (4- morpholinyl) -1,3,5- triazin-2-yl] amino} -1,3 benzothiazol-2-yl) sulfanyl] acetamid).

A, mitoxantron akkumulering. HEK293 /ABCG2 celler blev inkuberet med mitoxantron i 30 minutter i nærværelse af DMSO (tynd linie) eller 10 uM PZ forbindelser (tyk linie) efterfulgt af FACS-analyse af mitoxantron niveau. B, ABCG2 ekspression. HEK293 /ABCG2 celler blev inkuberet med 3,3 uM PZ forbindelser eller DMSO-kontrol i forskellige tidsrum efterfulgt af indsamling af celler og Western blot-analyse af ABCG2 probet med monoklonalt antistof BXP-21.

Undertrykkelse af ABCG2 ekspression ved de kendte og eksisterende ABCG2 hæmmere

ovenstående resultater tyder på, at-hæmmerinduceret undertrykkelse af ABCG2 udtryk kan være mere udbredt end forventet. For yderligere at teste denne mulighed, vi undersøgte effekten af ​​to andre offentliggjorte ABCG2 hæmmere (NSC-168.201 og NSC-120.668) [12] på ABCG2 udtryk ved hjælp af Western blot-analyse. Som vist i fig. 3A, både NSC-168.201 og NSC-120.668 effektivt undertrykke ABCG2 udtryk. Imidlertid kontrol ABCG2 inhibitoren FTC ikke selv om alle tre inhibitorer effektivt at øge mitoxantron akkumulering i HEK293 /ABCG2 cellelinjer (fig. 3B). Vi konkluderer således, at den hæmmer-induceret undertrykkelse af ABCG2 udtryk kan være mere udbredt end det er blevet forventet, og der er muligvis to grupper af ABCG2 hæmmere.

A, ABCG2 udtryk. HEK293 /ABCG2 celler blev behandlet med 10 pM af hver af de kendte ABCG2 inhibitorer NSC-168201, NSC-120.668, eller FTC i forskellige tidsrum efterfulgt af Western blot-analyse af ABCG2 ekspression probet med monoklonalt antistof BXP-21. B, mitoxantron akkumulering. HEK293 /ABCG2 celler blev inkuberet med mitoxantron i 30 minutter i nærværelse af DMSO (tynd linie) eller 10 pM NSC-168201, NSC-120.668, eller FTC (tyk linie) efterfulgt af FACS-analyse af intracellulær mitoxantron niveau.

specifik effekt af PZ-34 og PZ-38 på ABCG2-medieret mitoxantron efflux

for yderligere at undersøge, om disse nye inhibitorer undertrykker ABCG2 udtryk ved at inducere ABCG2 nedbrydning i lysosomer, valgte vi at fokusere på PZ -34 og PZ-38 og uropført en detaljeret analyse af deres virkninger på akkumulering af lægemidlet. Som vist i fig. 4A begge til PZ-34 og PZ-38 ved -4 uM øge mitoxantron akkumulering til en lignende grad som den veletablerede ABCG2 inhibitor FTC i HEK293 /ABCG2 celler. Disse forbindelser har imidlertid ingen signifikant virkning på mitoxantron akkumulering i kontrolceller transficeret med vektor (HEK293 /Vec), hvilket indikerer, at virkningen af ​​PZ-34 og PZ-38 på mitoxantron akkumulering sandsynligvis via inhibering ABCG2. Vi derefter testet dosis respons af PZ-34 og PZ-38 til inhibering ABCG2-medieret mitoxantron efflux i HEK293 /ABCG2 celler under anvendelse af flowcytometri. Som vist i fig. 4B, det intracellulære mitoxantron niveau er meget mindre i HEK293 /ABCG2 celler sammenlignet med HEK293 /Vec celler på grund af ABCG2-medieret efflux. Tilsætning af PZ-34 og PZ-38 forøger den intracellulære akkumulering af mitoxantron i en dosisafhængig måde svarende som FTC.

A, mitoxantron akkumulering. HEK293 /Vec eller HEK293 /ABCG2 celler blev inkuberet med mitoxantron i 30 minut i nærvær af DMSO kontrol eller 3 uM PZ-34, PZ-38 eller FTC kontrol. Dataene er middelværdier ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. B, dosisreaktion af PZ-34, PZ-38, og FTC kontrol i genoprettelsen mitoxantron akkumulering i HEK293 /ABCG2 celler. Den tykke linje viser niveauet af mitoxantron akkumulering i HEK293 /VEC celler, der tjener som en maksimal ophobning kontrol. C, effekt på ABCB1 og ABCC1-medieret Adriamycin efflux. HEK293-celler med ABCC1 overekspression (HEK293 /ABCC1) og BC19 celler med ABCB1 overekspression blev inkuberet med adriamycin i fravær (gråt område) eller nærvær (stiplet linje) på 3,8 uM PZ-34 eller PZ-38 efterfulgt af FACS analyse. Den tykke linje angiver det maksimale niveau for akkumulering i celler transficeret med vektor kontrol. D, effekt på ABCB1 og ABCC1 udtryk. HEK293 /ABCC1 og BC19 celler med ABCB1 overekspression blev behandlet med 10 pM PZ-34 eller PZ-38 i 3 dage efterfulgt af Western blot-analyse af ABCB1 anvendelse af monoklonalt antistof C219 og ABCC1 anvendelse af monoklonalt antistof MRPr1. GAPDH blev anvendt som en belastning kontrol.

For at bestemme specificiteten af ​​PZ-34 og PZ-38 testede vi deres effekt på stof efflux medieret af to andre ABC transportører, der er kendt for at forårsage MDR, ABCB1 og ABCC1, der anvender MCF7-celler-transficeret med ABCB1 (BC19) [13] og HEK293 celler-transficeret med ABCC1 (HEK293 /ABCC1) [14], [15]. Vi fandt imidlertid ingen effekt af disse forbindelser på aktiviteten af ​​ABCB1 og ABCC1 i aftagende Adriamycin akkumulering (fig. 4C). Både PZ-34 og PZ-38 også påvirker ikke udtryk for ABCB1 og ABCC1 (fig. 4D). Således kan PZ-34 og PZ-38 være specifikke for ABCG2 og påvirker ikke drug efflux medieret af to andre store ABC transportører.

Effekt af PZ-34 og PZ-38 på ABCG2-medieret multiresistens

for at afgøre, om både PZ-34 og PZ-38 har evnen til at bevidstgøre ABCG2-medieret resistens narkotika, vi udførte analyser af virkningerne af disse forbindelser på overlevelse HEK293 /ABCG2 celler i fravær eller tilstedeværelse af mitoxantron . Som vist i fig. 5A, både PZ-34 og PZ-38 alene har ingen virkning på overlevelsen af ​​HEK293 /ABCG2 celler ved koncentrationer på under 10 pg /ml. Deres IC

50 blev anslået til at være ~12.9 og 20 uM (tabel 1). Således kan både PZ-34 og PZ-38 har meget lidt cytotoksicitet til HEK293 /ABCG2 celler ved koncentrationer mindre end 10 uM, hvilket tyder på, at de ikke kan virke på andre væsentlige molekyler med høj affinitet for cellernes overlevelse.

A, styrken af ​​PZ-34 og PZ-38 vende mitoxantron modstand. HEK293 /ABCG2 celler blev behandlet uden eller med 0,1 pM (IC

10) mitoxantron i fravær eller nærvær af forskellige koncentrationer af PZ-34 eller PZ-38 efterfulgt af SRB-assayet. B, overfølsomhed indeks PZ-34 og PZ-38 i HEK293 /ABCG2 celler. HEK293 /ABCG2 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af mitoxantron i fravær eller nærvær af forskellige koncentrationer af PZ-34 eller PZ-38 efterfulgt af SRB-assayet. C og D, overfølsomhed indeks PZ-34 og PZ-38 i narkotikarelaterede valgt MCF7 /AdVp3000 celler. MCF7 /AdVp3000 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af mitoxantron (C), eller Adriamycin (D) under tilstedeværelse af DMSO (køretøj) eller 500 nM PZ-34 og PZ-38 efterfulgt af MTT-analysen. Sensibilisering indeks blev beregnet under anvendelse IC

50 i anticancerlægemidler i fravær eller nærvær af PZ-34, PZ-38, eller FTC. De viste data er gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg.

Derefter bestemte vi effekten af ​​PZ-34 og PZ-38 på sensibiliserende cellulære respons på 0,1 uM mitoxantron der alene producerer mindre end 10% inhibering af væksten af ​​HEK293 /ABCG2 celler. Som vist i fig. 5A, både PZ-34 og PZ-38 ved en lav koncentration range sensibilisere disse celler til mitoxantron. På omkring 1,2 uM, både PZ-34 og PZ-38 bistå 0,1 uM mitoxantron fuldstændigt at inhibere cellevækst. IC

50 af PZ-34 og PZ-38 i sensibiliserende mitoxantron resistens blev beregnet til at være 71 og 45 nM (tabel 1). Vi testede også PZ-8 og PZ-16 og fandt, at IC

50 af disse forbindelser alene er -20 pM og deres IC

50 i sensibiliserende mitoxantron modstand MCF7 /AdVp3000 celler er -80 og -70 nM , henholdsvis. IC

50 af FTC i sensibiliserende mitoxantron modstand, på den anden side, er meget højere ved 326 nM (tabel 1).

Dernæst undersøgte vi dosisrespons PZ-34 og PZ-38 i sensibiliserende ABCG2-medieret mitoxantron resistens hjælp HEK293 /ABCG2 celler. Som vist i fig. 5B, IC

50 af mitoxantron falder drastisk i nærvær af PZ-34 og PZ-38. Ved 50 nM, PZ-34 og PZ-38 reducere IC

50 af mitoxantron med en sensibilisering indeks på 1,6 og 2,2 (tabel 2). Ved 500 nM, sensibilisering indeks for PZ-34 og PZ-38 er 8,7 og 14,3, (tabel 2). På den anden side, sensibilisering indeks FTC ved 500 nm er kun 3,9 (tabel 2). Disse resultater viser, PZ-34 og PZ-38 er meget potente hidtil ukendte ABCG2 inhibitorer.

For yderligere at undersøge, om PZ-34 og PZ-38 kan vende ABCG2-medieret MDR i et lægemiddelresistent cancercelle line, brugte vi lægemiddel-valgte brystkræft MCF7 /AdVp3000 som over-udtrykker ABCG2 og testet en ekstra anticancer narkotika substrat af ABCG2, adriamycin. Som vist i fig. 5C, både PZ-34 og PZ-38 ved 500 nm drastisk at reducere modstanden i MCF7 /AdVp3000 til både Adriamycin og mitoxantron.

PZ-34 og PZ-38 ikke påvirker ABCG2 oligomerisering

Tidligere er det blevet vist, at ABCG2 kan eksistere og fungere som en homo-oligomer [4], [6]. For at undersøge, om PZ-34 og PZ-38 muligvis inhibere ABCG2 oligomerisering, co-immunopræcipitation af to differentielt mærkede ABCG2 blev udført som tidligere beskrevet [4] efter en 6-timers behandling med PZ-34 og PZ-38 ved 3,3 uM. Der blev imidlertid fundet nogen virkning af PZ-34 og PZ-38 på ABCG2 co-immunpræcipitering (se supplerende fig. S1), hvilket antyder, at PZ-34 og PZ-38, svarende til PZ-39 [7], kan ikke påvirke ABCG2 oligomerisering. Men på grund af begrænsningen af ​​co-immunopræcipitation, kan disse inhibitorer påvirke dimerisering som ikke kan afsløres ved co-immunoudfældning grund af eksistensen af ​​mindst 3 forskellige interaktionssteder af den oligomere ABCG2 [4], [6].

Virkning af PZ-34 og PZ-38 på halveringstiden af ​​ABCG2

Som diskuteret ovenfor, både PZ-34 og PZ-38 undertrykte ABCG2 ekspression (fig. 2). For at udelukke den mulighed, at denne undertrykkelse skyldes inhibering af genekspression, udførte vi real time RT-PCR-analyse. Som vist i fig. S2, steady state niveauer af ABCG2 mRNA er de samme mellem kontrol- og sammensatte behandlingsgrupper og dermed eliminerer muligheden for, at disse forbindelser påvirker transskription eller stabilitet ABCG2 mRNA.

For at hvis undertrykt udtryk for bestemme ABCG2 skyldes inhibitor-induceret nedbrydning som vi tidligere observeret med PZ-39 [7], undersøgte vi virkningen af ​​PZ-34 og PZ-38 på halveringstiden af ​​ABCG2 i HEK293 /ABCG2 celler ved at forbehandle celler med cycloheximid, hvilket inhiberer forlængelse under proteinsyntese, efterfulgt af behandling med PZ-34 og PZ-38 i forskellige tidsrum. Som vist i fig. 6A, tabet af ABCG2 i celler behandlet med en kombination af cycloheximid og PZ-34 eller PZ-38 er meget hurtigere end den for kontrollen behandling med DMSO vehikel eller FTC kontrol. Halveringstiden af ​​ABCG2 i nærvær af PZ-34 og PZ-38 anslås til ~8 hrs det er stabilt med en estimeret halveringstid mere end 60 timer i kontrolgruppen behandling med FTC eller DMSO (fig. 6B ). Således PZ-34 og PZ-38 sandsynligvis accelererer nedbrydningen af ​​ABCG2 protein på samme måde som PZ-39 [7].

A, Western blot-analyse. HEK293 /ABCG2 celler blev først behandlet med 5 ug /ml cycloheximid (CHX) efterfulgt af tilsætning af 3 uM PZ-34, PZ-38, FTC, eller DMSO-kontrol i forskellige tidsrum. Cellerne blev derefter høstet til Western blot-analyse af ABCG2 probet med monoklonalt antistof BXP-21. Actin blev anvendt som en loading kontrol. B, halveringstid ABCG2. ABCG2 niveauer på Western-blot som vist i panel A blev bestemt ved anvendelse Scion Image og afbildet mod tiden for behandling. De viste data er gennemsnit ± SD af tre eksperimenter.

PZ-34 og PZ-38 inducerer ABCG2 nedbrydning i lysosomer

Det er tidligere blevet rapporteret, at vildtype og korrekt foldet ABCG2 proteiner nedbrydes i lysosomer henviser de mutante og fejlfoldede proteiner er involveret i ubiquitinmedieret nedbrydning i proteasomet [16]. Desuden fandt vi tidligere at PZ-39 forårsager ABCG2 nedbrydning via lysosom-medieret nedbrydning [7]. For at bestemme om PZ-34 og PZ-38 årsag ABCG2 nedbrydning via lysosom eller proteasom anvendte vi bafilomycin A

1, en inhibitor af proteinnedbrydning i lysosomer, og MG-132, en proteasominhibitor som tidligere beskrevet [7]. Som vist i fig. 7A, forbehandling af celler med bafilomycin A

1 inhiberer PZ-34 og PZ-38-induceret ABCG2 nedbrydning henviser forbehandling med MG-132 ikke. Således sandsynligt PZ-34 og PZ-38 også inducere ABCG2 nedbrydning i lysosomer, samme som PZ-39 [7].

A, ABCG2 nedbrydning i lysosomer. HEK293 /ABCG2 celler blev behandlet med 3 uM PZ-34 eller PZ-38 i fravær eller nærvær af 10 nM bafilomycin A

1 (BMA1) eller 2 uM MG-132 i forskellige tidsrum. Cellerne blev derefter høstet til Western blot-analyse af ABCG2 ekspression probet med monoklonalt antistof BXP-21. Actin blev anvendt som en loading kontrol. B, ABCG2 konformationsændringer. HEK293 /ABCG2 og MCF7 /AdVp3000 celler blev behandlet med 10 pM af PZ-34, PZ-38, eller DMSO vehikelkontrol efterfulgt af farvning med monoklonalt antistof 5D3 og FACS-analyse. Pilespids angiver PZ-34 og PZ-38 behandlede grupper.

PZ-34 og PZ-38 binder til ABCG2

Det er blevet rapporteret tidligere, at det monoklonale antistof 5D3 binder til ABCG2 på celleoverfladen lettere efter binding af inhibitorer til ABCG2 muligvis på grund af inhibitor-inducerede konformationelle ændringer i ABCG2 [7], [12], [17]. For at bestemme om PZ-34 og PZ-38 potentielt binder til ABCG2 udførte vi farvning analyser af ABCG2 hjælp 5D3 i nærvær eller fravær af PZ-34 og PZ-38. Som vist i fig. 7B, både PZ-34 og PZ-38 forårsage en stigning i 5D3 farvning i begge MCF7 /AdVp3000 og HEK293 /ABCG2 celler, hvilket indikerer, at både PZ-34 og PZ-38 kan binde til ABCG2 og de bindende fører til den konformationelle ændring af ABCG2.

diskussion

i den foreliggende undersøgelse, viser vi, at der er muligvis to grupper af ABCG2 hæmmere og inhibitoren-induceret ABCG2 nedbrydning i lysosomer kan være mere udbredt end tidligere forventet. Vi viser også, at PZ-34 og PZ-38 er potente ABCG2 inhibitorer. Selvom PZ-34 og PZ-38 er strukturelt forskellig fra den tidligere identificerede ABCG2 hæmmer, PZ-39, de synes at have samme virkningsmekanisme ved at hæmme ABCG2 funktion og ved at fremskynde ABCG2 nedbrydning i lysosomer.

Blandt mange ABCG2 hæmmere tidligere identificeret, få er kendt for at være specifikke for ABCG2 og ingen er blevet undersøgt for at vise, om de kunne accelerere ABCG2 nedbrydning i lysosomer. I denne og vores tidligere undersøgelser [7], fandt vi, at FTC ikke påvirkede ABCG2 udtryk hvorimod både NSC-168.201 og NSC-120.668 gjorde. I de fire nye ABCG2 inhibitorer (PZ-8, 16, 34, og 38) testet i denne undersøgelse, tre undertrykt ABCG2 ekspression, mens den anden ikke gjorde. Samlet set mener vi, at der er to grupper af ABCG2 hæmmere med én hæmmende kun ABCG2 aktivitet og den anden også undertrykke ABCG2 nedbrydning ud over at hæmme ABCG2 funktion. Vi kalder disse inhibitorer som statiske og dynamiske hæmmere henholdsvis.

Det er i øjeblikket ukendt, hvad grundlæggende forskelle mellem disse to grupper af hæmmere forårsager forskellen i deres virkningsmekanisme. Det er dog fristende at spekulere, at de binder til to forskellige steder på ABCG2. Binding til enten site vil forårsage konformationelle ændringer af ABCG2 som fører til inhibering af ABCG2 aktivitet. Men binding til et af de steder vil også lette ABCG2 endocytose og nedbrydning i lysosomer. Ændringen af ​​ABCG2 konformation af PZ-34 og PZ-38 påvist under anvendelse af det monoklonale antistof 5D3 tyder på, at PZ-34 og PZ-38 direkte binde til ABCG2 selvom deres bindingssteder er i øjeblikket ukendte. Da FTC også forårsager konformationsændring, men ikke accelerere ABCG2 nedbrydning, PZ-34 og PZ-38 sandsynligvis ikke binder til det tilsvarende sted som FTC. Tidligere er det blevet vist, at agonist binding fremskyndet endocytose og nedbrydning af β

2-adrenerg receptor i lysosomer [18], understøtter den ovennævnte hypotese. Skønt usandsynligt, er det også muligt, at de dynamiske ABCG2 inhibitorer kan have off-target virkning som aktiverer upstream involverede veje i ABCG2 nedbrydning. Uanset, har brug for disse muligheder for at blive testet i fremtidige dybtgående undersøgelser.

Tidligere er det blevet påvist, at ABCG2 nedbrydning sker hovedsageligt via to forskellige mekanismer. Mens korrekt foldet vildtype ABCG2 primært nedbrydes via lysosomer [16], er mutantproteinerne nedbrydes af proteasom via en kvalitetskontrol mekanisme [16], [19], [20]. Det fremgår, at kvalitetskontrolmekanisme den forekommer ved ER lige efter syntese af ABCG2 og normal nedbrydning af vildtype proteiner kan forekomme ved endocytose af ABCG2 fra plasmamembraner. I øjeblikket er det endnu ikke vides, om den dynamiske hæmmer-induceret nedbrydning af ABCG2 sker ved menneskehandel til lysosomer fra plasma membraner via endocytose og /eller fra ER membraner umiddelbart efter deres syntese.

Selvom det er i øjeblikket ukendt, hvis PZ -34 og PZ-38 er specifikke for ABCG2, vores resultater viser, at de ikke påvirker ABCB1 og ABCC1 funktion og udtryk. Således PZ-34 og PZ-38 er mere specifikke for ABCG2 end nogle af de tidligere identificerede ABCG2 inhibitorer, som det kendte ABCG2 inhibitoren GF 120918, som synes at inhibere ABCB1 og /eller ABCC1 lige godt [2], [21]. Vi fandt også, at både PZ-34 og PZ-38 ikke er cytotoksiske med en koncentration op til 10 ug /ml, hvilket antyder, at disse ABCG2 inhibitorer sandsynligvis ikke binder til og inhiberer andre cellulære proteiner med høj affinitet, der er afgørende for cellulær overlevelse. Der er dog behov for flere undersøgelser for at undersøge specificiteten af ​​PZ-34 og PZ-38 og at afgøre, om de binder til og hæmme andre medlemmer af den menneskelige ABC transporter familie.

Det faktum, at PZ-34 og PZ -38 have nogen cytotoksicitet til HEK293-celler ved koncentrationer på mindre end 10 um og effektivt kan vende MDR antyder, at vinduet i terapeutiske indeks af disse forbindelser er store. En ideel kemo-sensitiverende er, at det ikke bør være toksisk selv. Det er klart, PZ-34 og PZ-38 opfylde dette krav i de i-vitro undersøgelser. Det er dog uvist, om disse forbindelser er giftige og effektive til at vende MDR in vivo, der skal evalueres i fremtidige undersøgelser ved hjælp af dyremodeller.

Materialer og metoder

Materialer

Det monoklonale antistof BXP-21 mod ABCG2, anti-myc og anti-HA antistoffer var fra ID Labs, Cell Signaling og Roche, hhv. Monoklonalt antistof C219 og MRPr1 blev købt fra Kamiya Biomedical Company. Biotin-konjugeret 5D3-antistof og phycoerythrin-streptavidin-konjugater var fra eBiosciences. Alle elektroforese reagenser, proteinkoncentration assay kit, og polyvinylidendifluorid-membraner blev fremskaffet fra Bio-Rad. FTC, Adriamycin, mitoxantron, camptothecin, dithiothreitol, sulforhodamin B (SRB), og Triton X-100 var fra Sigma. Forbindelserne PZ-8, PZ-16, PZ-34, PZ-38 og PZ-39 blev indkøbt fra specs. NSC-168.201 og NSC-120.668 var gaver fra National Cancer Institute. Protein-G PLUS-agarose og SYBR Green PCR Master Mix var fra Santa Cruz Biotechnology og Applied Biosystems, hhv. LipofectAMINE Plus og G418 var fra Invitrogen. Cellekulturmedium IMEM og DMEM var fra BioSource International og Medier Tech hhv. Alle andre kemikalier var af molekylærbiologiske kvaliteter fra Sigma eller Fisher Scientific.

Celledyrkning, behandlinger og lysat præparater

Menneskelig brystkræft MCF7 og dens afledte linjer BC19 (en gave fra Julie Horton ved National Institute of Environmental Health Sciences) og MCF7 /AdVp3000 (en gave fra Susan Bates ved National Cancer Institute), HEK293 /ABCC1 [14], HEK293 /vektor [14], HEK293 /ABCG2 [4] blev dyrket som tidligere beskrevet [ ,,,0],4], [13], [14], [22]. Til analyse af ABCG2 nedbrydning blev HEK293 /ABCG2 cellerne først behandlet med 10 nM bafilomycin A

1 eller 2 uM MG132 i 24 timer efterfulgt af behandling med 3 uM PZ-34 eller PZ-38 i forskellige tidsrum og indsamling af cellelysater . Til bestemmelse af ABCG2 halveringstid blev HEK293 /ABCG2 celler behandlet med 5 ug /ml cycloheximid, 3 pM PZ-34 eller PZ-38 for forskellige gange efterfulgt af samling af celler. Lysat præparat blev udført som beskrevet tidligere [22].

Western blot, immunoudfældning, og FACS-analyser

Western blot, immunoudfældning, og FACS-analyser på akkumulering blev udført nøjagtigt som vi tidligere beskrevet [ ,,,0],4], [6]. For at bestemme den konformationelle ændring af ABCG2 efter behandling med ABCG2 inhibitorer, blev HEK293 /ABCG2 celler inkuberet med 10 pM PZ-34 eller PZ-38 ved 37 ° C i 30 minutter før inkubering med biotin-konjugeret 5D3-antistof (1:100 fortynding) i 2 timer. Cellerne blev derefter vasket 3 gange og inkuberet med phycoerythrin-streptavidin i 30 minutter efterfulgt af vask og analyse under anvendelse af FACS.

Cytotoksicitetsassay

Cytotoksicitet blev bestemt under anvendelse SRB og MTT-assays som beskrevet tidligere [ ,,,0],6], [22], [23]. Virkningen af ​​ABCG2 inhibitorer på lægemiddelresistens blev bestemt ved at eksponere cellerne for en række koncentrationer af anticancer-lægemidler i fravær eller nærvær af forskellige koncentrationer af ABCG2 inhibitorer. Styrken og overfølsomhed indeks ABCG2 hæmmere blev beregnet som følger:

Real time RT-PCR

RNA ekstraktion og real-time RT-PCR blev udført som vi beskrev tidligere [22]. Sekvenserne af ABCG2 primere er 5′-GGCTTTCTACCTGCACGAAAACCAGTTGAG-3 ‘(fremad) og 5′-ATGGCGTTGAGACCAG-3′ (revers). Sekvenserne af GAPDH primere er 5’-AAGGACTCATGACCACAGTCCAT-3 ‘(fremad) og 5′-CCATCACGCCACAGTTTCC-3’ (revers). Den relative ABCG2 RNA-niveauet (2

ACt) behandlet med inhibitorer blev udtrykt som procent af kontrol (i nærværelse af 0,1% DMSO) hvor ACt (tærskel cyklus) = (CT

ABCG2-CT

GAPDH ).

Støtte Information

Figur S1.

Virkning af PZ-34 og PZ-38 på ABCG2 dimerisering /oligomerisering. HEK293-celler co-transficeret med Myc- og HA-mærkede ABCG2 blev eksponeret for 3,3 uM PZ-34, PZ-38, eller DMSO-kontrol i 6 timer og cellelysater blev underkastet immunpræcipitation med anti-Myc eller anti-HA-monoklonale antistof efterfulgt ved western blot analyse undersøgt ved hjælp af anti-HA og anti-myc-antistoffer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0015276.s001

(JPG)

Figur S2.

Virkning af PZ-34 og PZ-38 på ABCG2 mRNA-niveau. HEK293 /ABCG2 celler blev behandlet med DMSO-vehikel, PZ-34, eller PZ-38 i forskellige tidsrum og høstet til RNA-fremstilling og real-time RT-PCR-analyse. De viste data er gennemsnit ± SD fra tre uafhængige forsøg

doi:. 10,1371 /journal.pone.0015276.s002

(JPG)

Tak

Vi takker Developmental Therapeutics Program ved NCI NSC forbindelser anvendt i dette studie.