PLoS ONE: Hyppige Mutationer i EGFR, KRAS og TP53 gener i human lungekræft tumorer opdaget af Ion Torrent DNA Sequencing

Abstrakt

Lungekræft er den mest almindelige malignitet og den hyppigste årsag til kræftdødsfald i hele verden. Mens rygning er langt den hyppigste årsag til lungekræft, andre miljømæssige og genetiske faktorer påvirke udviklingen og progressionen af ​​cancer. Siden er blevet observeret unikke mutationer mønstre i individuelle kræft prøver, identifikation og karakterisering af den særprægede lungekræft molekylære profil er afgørende for at udvikle mere effektive, skræddersyede behandlingsformer. Indtil for nylig, at personlig DNA-sekventering identificere genetiske mutationer i kræft var upraktisk og dyrt. De seneste teknologiske fremskridt i næste generation DNA-sekventering, såsom halvleder-baserede Ion Torrent sekventering platform, har gjort DNA-sekventering omkostninger og tid effektivt med mere pålidelige resultater. Brug af Ion Torrent Ampliseq Cancer Panel, vi sekventeret 737 loci fra 45 cancer-relaterede gener til at identificere genetiske mutationer i 76 humane lungecancer prøver. Den sekvensanalyse afslørede missense mutationer i KRAS, EGFR og TP53 gener i prøverne med forskellige histologiske typer brystkræft. Således er denne undersøgelse viser nødvendigheden af ​​sekventering individuelle menneskelige kræftformer for at udvikle personlige lægemidler eller kombinationsbehandlinger til effektivt at målrette individuelle, bryst kræft-specifikke mutationer

Henvisning:. Cai X, Sheng J, Tang C, Nandakumar V, Ye H, Ji H, et al. (2014) Hyppige Mutationer i EGFR, KRAS og TP53 gener i human lungekræft tumorer opdaget af Ion Torrent DNA-sekventering. PLoS ONE 9 (4): e95228. doi: 10,1371 /journal.pone.0095228

Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina

Modtaget: Juli 25, 2013; Accepteret: 25 marts 2014; Udgivet 23. april, 2014

Copyright: © 2014 Cai et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China, Wu Jieping Foundation og National Institute of Health (R01 CA90427 R01 AI084811 til SY Chen). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Chuanning Tang, Hua Ye, Feng Lou, Dandan Zhang, Hong Sun, Haichao Dong , Guangchun Zhang, Zhiyuan Liu, Zhishou Dong, Baishuai Guo, Han Yan, ChaoWei Yan, Lum Wang, Ziyi Su, og Yangyang Li er medarbejdere i San Valley Biotechnology, Inc. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS One politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Lungekræft er den mest almindelige malignitet i hele verden, og også den hyppigste årsag til kræft dødsfald. I 2008 blev en anslået 1,61 millioner nye tilfælde rapporteret på verdensplan, der tegner sig for 12,7% af alle nye kræfttilfælde [1]. Derudover blev ca. 1.380.000 dødsfald (18,2% af de samlede kræftdødsfald) rapporteret i hele verden [2]. I Kina, lungekræft har den højeste forekomst af alle nye kræfttilfælde hos både mænd og kvinder (21,7% i 2008) med mere end en 24,9% dødelighed [2]. Kvinder i Kina rapporterede kun en lidt højere forekomst af lungekræft i brystkræft samme år; imidlertid dødeligheden af ​​lungekræft er mere end 3 gange højere end for brystcancer (20,2% versus 6,1%, henholdsvis) [2]. Lungekræft ofte udviser uspecifikke symptomer, og diagnosen ofte sker på et fremskredent stadium eller efter metastaser har allerede [3] fandt sted. Mens indsatsen fortsat forbedre tidlig diagnosticering og behandling af lungekræft, den svimlende forekomst, dårlig prognose, og en betydelig dødelighed hersker.

Den førende årsag til lungekræft er rygning, og øget eksponering er direkte korreleret med en øget risiko for at udvikle lungekræft [4]. 85-90% af lungekræft dødsfald forbundet med rygning, og nuværende rygere er 15 gange større sandsynlighed for at dø af lungekræft end aldrig-rygere [5]. Der er to store former for lungekræft: ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) og småcellet lungecancer (SCLC). NSCLC, som tegner sig for omkring 85% af alle lungekræfttilfælde, kan yderligere opdeles i tre store histologiske undertyper: pladecellekræft (SCC), adenocarcinom, og store celle lungekræft. Mens rygning kan henføres til alle former for lungekræft, er det mest almindeligt forbundet med SCLC og SCC. Aldrig-rygere, på den anden side, er mest almindeligt diagnosticeret med adenocarcinom [3], [5]. Interessant kun 10-24% af rygere udvikler lungekræft, om betydningen af ​​andre miljømæssige og individuelle genetiske faktorer [6], [7]. Bortset fra tobaksrøg, andre ætiologiske agenter og risikofaktorer er blevet identificeret, herunder besættelse, udsættelse for passiv rygning, asbest, radon, og luftforurening, i tillæg til genetiske faktorer [8] – [10]. Omkring 10-15% af lungekræfttilfælde opstår hos patienter, der rapporterer aldrig har røget, og disse kræftformer gør det spontant med en ophobning af genetiske og epigenetiske ændringer [5].

På trods af de igangværende bestræbelser på at forbedre screening og behandling af lunge cancere, prognosen for patienter med de fleste former for lungekræft fortsat ringe [3]. Fordi de genetiske og miljømæssige faktorer, der forårsager lungekræft variere meget, hver tumor har potentiale til at udvise en unik genmutation profil. Som sådan, akkumulering tyder på, at individualiserede, skræddersyede terapier er afgørende for en effektiv behandling mod lungekræft. Dette kan opnås ved profilering et individs cancer genom for at dissekere de onkogene mekanismer, der regulerer progression af canceren. For nylig, en ny teknologi baseret på halvleder sekventering kaldet Ion Torrent sekventering [11] er at tackle mange af de spørgsmål, der er forbundet med andre sekventering metoder, nemlig omkostninger, tid, og den samlede praktiske individualiseret genom sekventering. I denne undersøgelse har vi anvendt Ion Torrent sekventering til at analysere 76 kliniske lungekræft prøver at identificere de genetiske mutationer i 737 loci af 45 kendte cancerrelaterede gener.

Resultater Salg

Mutation analyse af humant lungekræft tumorer med Ion Ampliseq Cancer Panel

i alt 76 lungekræft prøver (tabel 1) blev analyseret ved hjælp af Ion Torrent Ampliseq Cancer Panel til at identificere mutationer i 737 loci på 45 onkogener og tumorsuppressorgener i humane lungekræft . Disse Lungekræft prøver var alle fra kinesiske patienter spænder fra 28-80 år repræsenteret af 40 mænd med en gennemsnitsalder på 62 år og 36 kvinder med en gennemsnitsalder på 59 år.

sekventeret data blev behandlet og mutationer identificeres ved hjælp af Ion Torrent Suite Software v3.0 med en plug-in “variant der ringer”. For at eliminere fejl basen calling blev tre filtrering trin anvendes til at frembringe pålidelige variant kaldelse som beskrevet i Materialer og Metoder. Den Sequence læse fordeling på tværs 189 amplikoner genereret fra 76 FFPE prøver blev normaliseret til 300.000 læser per prøve (fig. 1). Ved hjælp af en streng standard variant kald, vi identificerede mutationer i følgende gener som angivet i tabel 1:. BRAF, EGFR, ERBB2, KRAS, PIK3CA, PTEN, Smad4, og TP53

A. Fordeling af gennemsnitlig dækning af hvert amplikon. Data er vist som middelværdi ± SD. B. Antal amplikoner med en given læse dybde, sorteret i siloer på 100 læser. (Blå søjler nuværende antal mål amplikoner inden læse dybde, rød linje præsenterer% af target amplikoner = læse dybde)

Prøverne blev klassificeret baseret på deres oprindelse som lunge adenocarcinom, lunge stor celle. carcinom, lunge pladecellecarcinom og lunge neuroendokrine karcinom. De forskellige stadier kræftformer har udviklet sig til, blev scoret baseret på ‘American fælles udvalg om kræft /tumor størrelse, lymfeknuder ramt, Metastaser (AJCC /TNM) “system (Ia, Ib, IIa, IIb, IIIa, IIIb) og som metastaserende og ikke-metastasering lungecancere. Også kræftformer blev sorteret fra storrygere, lys-rygere og ikke-rygere til at kontrollere sammenhængen af ​​rygning med ophobning af disse mutationer. Den detaljerede liste over missense punktmutationer, indsættelser og sletninger profileret på 737 loci af 76 lungekræft prøver er angivet i tabel S1.

Ud af mutationerne identificeret i vores prøvesæt, BRAF (2,6%), EGFR (42,1%), ERBB2 (1,3%), KRAS (5,3%), PIK3CA (2,6%), PTEN (1,3%), Smad4 (1,3%), og TP53 (22,4%) afholdt de højeste satser for mutationer (tabel 2 ). De mutationsfrekvenser ved deres forskellige differentieringsfaktorer niveauer (tabel 3), på forskellige AJCC mellemstation (tabel 4), af de metastatiske og ikke-metastatiske lungecancere (tabel 5) og fra patienter med forskellige rygevaner (tabel 6) er opført i tabeller. Detaljeret sekventering analyse i exons og funktionelle domæner af disse gener blev derfor udført.

Vejviser

missense mutation fordeling i exons og funktionelle domæner af EGFR

Ud af 76 sekventerede lungekræft prøver, 36,1% af EGFR-mutationer var missense langs exon 19, 50,0% var missense langs exon 21, 5,6% ad exon 20 og 8,3% langs exon 18 (fig. 2A). Disse mutationer var i og omkring tyrosinkinasedomæne af EGFR (fig. 2B-3C). Aktiverende mutationer i tyrosinkinasedomænet af

EGFR

gen stimulerer proteintyrosinkinase, hvilket fører til aktivering af signalveje, der er forbundet med cellevækst og overlevelse. Mutationer i det ekstracellulære domæne af EGFR er ofte forbundet med amplifikation af gener i andre cancere [12]. 57,7% af EGFR-associeret lungekræft var adenokarcinomer (tabel 2) og 86,7% af EGFR-mutationer forbundet med ‘høj differentiering’ kræftformer (tabel 3). I vores stikprøve sæt 50% af EGFR-associeret lungekræft metastaseret til lokale regioner, 27,3% til lymphs og 46,2% af kræfttilfælde metastaseret til fjerne organer i vores prøvesæt (tabel 5).

A. Frekvensen af ​​fundne mutationer i forskellige exons. B. Mutation distribution i exons. C. Mutation distribution i funktionelle domæner.

A. Frekvensen af ​​fundne mutationer i forskellige exons. B. Mutation distribution i exons. C. Mutation distribution i funktionelle domæner.

missense mutation fordeling i exons og funktionelle domæner af KRAS

Ud af 76 sekventeret lungekræft prøver, 100% af KRAS-mutationer var missense sammen exon 2 (fig. 3A). The 34G T mutationer resulterer i en aminosyresubstitution i position 12 i KRAS, fra en glycin (G) til en cystein (C) eller en valin (V). The 64C en mutation resulterer i en aminosyresubstitution i position 22 fra en glutamin (Q) til en lysin (K) i KRAS. Alle disse aminosyresubstitutioner opstod langs GTP-bindende domæne af KRAS (fig. 3A-C). KRAS binder til GTP i den aktive tilstand og besidder en iboende enzymatisk aktivitet, som spalter den terminale phosphat af nukleotidet, konvertere den til BNP. Ved omdannelse af GTP til GDP, er KRAS slukket [13]. Resultatet af disse mutationer er konstitutiv aktivering af

KRAS

signalveje. Når den er tændt, rekrutterer og aktiverer proteiner nødvendige til formering af vækstfaktor og andre receptorer ‘signal, såsom c-Raf og PI3-kinase [13]. 7,7% af KRAS-associerede lungekræft var adenokarcinomer (tabel 2) og 6,1% af KRAS-mutationer forbundet med ‘lav differentiering’ kræft og 7,4% af KRAS-mutationer var “mid differentiering ‘kræftformer (tabel 3). I vores stikprøve sæt 6,3% af KRAS-associeret lungekræft metastaseret til lokale regioner, 9,1% til lymphs og 5,1% af kræfttilfælde metastaseret til fjerne organer i vores prøve sæt (tabel 5).

missense mutation fordeling i exoner og funktionelle domæner af TP53

abnormitet i TP53 genet er en af ​​de mest betydningsfulde begivenheder i lungecancere og spiller en vigtig rolle i tumorigenese af lungeepitelceller. P53 tumorsuppressorgen er placeret på 17p13 kromosom og spænder 20 kb genomisk DNA der omfatter 11 exoner, der koder for en 53KD phosphoprotein [14]. De fleste TP53 mutationer klynge i TP53 DNA-bindende domæne, som omfatter exon 5 til 8 og spænder ca. 180 kodoner eller 540 nucleotider og er ikke begrænset til et par bestemte sekvenser eller kodoner langs dette gen [15]. TP53 afholdt adskillige skadelige mutationer i vores prøve sæt af 76 lungekræft, hovedsagelig langs DNA-bindende domæne kodet fra exon 5 (27,8%), 6 (16,7%), 7 (33,3%), 8 (16,7%), og langs oligomeriseringsdomænet indkodet fra exon 10 (15,6%) (fig. 4A-C). De fleste TP53 missense mutationer fører til syntesen af ​​et stabilt protein, som mangler dets specifikke DNA-bindende og transaktiveringsfunktion og akkumuleres i kernen af ​​cellerne. Sådanne mutante proteiner bliver inaktive og mangler evnen til at transaktivere downstream målgener der regulerer cellecyklus og apoptose [16]. Bortset fra disse mutationer påvirker rolle TP53 som en tumor-suppressor protein, TP53 mutationer udstyre også det mutante protein med ‘gain-of-function “(GOF) aktiviteter, der aktivt kan bidrage til forskellige stadier af tumorprogression, herunder fjerne metastaser og til forøget modstand mod anticancerbehandlinger [17] – [19]. 50,0% af TP53-associerede lungekræft var pladecellecarcinom (tabel 2) og 20,0% af TP53 mutationer forbundet med ‘høj differentiering “kræft og 25,9% af TP53 mutationer var» mid differentiering “cancere (tabel 3). I vores stikprøve sæt 25,0% af TP53-associerede lungekræft metastaseret til lokale regioner, 54,5% til lymphs og 12,8% af kræfttilfælde metastaseret til fjerne organer i vores prøvesæt (tabel 5).

A. Frekvensen af ​​fundne mutationer i forskellige exons. B. Mutation distribution i exons. C. Mutation distribution i funktionelle domæner.

Flere mutationer og mutation hotspots i human lungekræft

Klinisk succes med individualiserede kombinationsbehandling er afhængig af identifikationen af ​​mutationsmønstre kombinationer og mønstre for samarbejde -administration af en enkelt eller en kombination af target midler mod de fundne mutationsmønstre kombinationer. Nogle af de detekterede i vores tumor gruppen gennem sekvensanalyse mutationer var ikke kun tilbagevendende og hyppige men også forekom i kombination med andre mutationer. Lungecancer i vores prøvesæt indeholdt følgende: 64,5% af prøverne havde mindst én eller flere missense-mutationer, 19,7% havde mindst to eller flere missense-mutationer, 3,9% havde mindst tre eller flere missense-mutationer, 1,3% havde mindst fire eller flere missense-mutationer, og 35,5% af prøverne afholdt ingen skadelige mutationer i nogen af ​​de screenede 13.500 loci af den potentielle tumorsuppressor og onkogener (tabel 7).

diskussion

Da lungekræft er den mest udbredte kræft og hyppigste årsag til kræftdødsfald i hele verden, er igangværende bestræbelser sigter på at forbedre forebyggelse, diagnosticering og effektive behandlingsmuligheder for patienter med lungekræft. I øjeblikket er der en række behandlingsmuligheder for patienter med lungecancer, med kirurgi er den mest effektive til behandling af NSCLCs, og kemoterapi med eller uden strålebehandling som standard behandling for SCLCs. Fordi de fleste SCLCs metastaserer tidligt til fjerne organer, kirurgi er ofte ineffektive til at kurere denne kræftform. NSCLCs, på den anden side, er mere tilbøjelige til at forblive lokaliseret under udvikling, og er således mere effektivt behandles med kirurgisk indgreb. Derudover SCLCs er typisk meget mere følsomme over for kemoterapi og /eller strålebehandling end er NSCLCs [20], [21]. En udfordring i korrekt klassificering og behandling af lungekræft er den ekstreme heterogenitet som følge af forskellige genetiske, biologiske og kliniske egenskaber, herunder respons på behandlingen, med over 50 histologiske varianter anerkendt af WHO skrive systemet [22], [23]. På grund af dette, korrekt klassificering af lungekræfttilfælde er nødvendig for at sikre, at patienterne får den bedst mulige forvaltning [24].

På grund af disse forskellige niveauer af heterogenitet, kan generelle behandlinger være mindre effektive. Alternativt målrettet terapi, som indebærer brugen af ​​specielt konstruerede lægemidler til selektivt at målrette molekylære veje korrelerede med den maligne fænotype af lungecancerceller, kan være mere nyttigt [25]. Adskillige gener almindeligt forekommende at være muteret i forskellige lungekræft er blevet rapporteret, herunder ALK /ELM4 fusion, K-

ras

, EGFR, VEGF, og p53, men hele den genetiske profil hver formular stadig ikke været fuldt defineret [3]. Dette indikerer nødvendigheden af ​​sekventering individuelle humane lungecancere for at matche brugen af ​​en enkelt målrettet lægemiddel eller to eller flere målrettede lægemidler i kombination mod individuelle lungecancerrelaterede specifikke mutationer. I denne undersøgelse har vi anvendt Ion Ampliseq Cancer Panel til at sekventere 13.500 loci i 45 cancerrelaterede gener, primært onkogener og tumorsuppressorgener, af 76 humane lungecancer-prøver. Vi identificerede hyppige mutationer i en gruppe af gener, herunder EGFR, KRAS, og TP53 (tabel 2). Selv om de fleste af disse gener allerede var kendt for at være forbundet med lungekræft, de muterede punkter og de tilknyttede mutationer i andre gener var forskellige i vores prøvesæt (tabel 7).

Da der er en voksende bevidsthed om ændringerne i lungekræft celler i den seneste tid, har nyere lægemidler, der specifikt er målrettet mod disse ændringer blevet udviklet. Disse målrettede lægemidler enten arbejde synergistisk med kemoterapi narkotika eller af dem selv med meget mindre toksicitet hidrørende fra en selektiv virkning som et alternativ til et mere systemisk modulering af proteiner forbundet med onkogenese. EGFR-hæmmere (Afatinib, Erlotinib og gefitinib) og VEGF-hæmmere (bevacizumab) er der i øjeblikket anvendes til mål terapier for NSCLC patienter med mutationer i VEGF og EGFR [26]. Erlotinib er et stof, som blokerer EGFR fra signalering cellen til at vokse. Det forhindrer udviklingen af ​​lungekræft, specielt i ikke-ryger kvinder, og bruges oftest i avanceret NSCLC behandling, der ikke var lydhøre over for kemoterapi. Det er også bruges som den første behandling hos patienter, hvis kræft har en mutation i

EGFR

gen [27]. Cetuximab er et monoklonalt antistof rettet mod EGFR, som også anvendes i avanceret NSCLC i kombination med standard kemoterapi som en del af første-linie behandling [28]. Ligesom erlotinib, afatinib er et stof, der blokerer væksten signal fra EGFR og anvendt til avancerede NSCLCs der har mutationer i

EGFR

gen [29]. Nogle yngre, ikke-rygere med adenokarcinomer er fundet at have en ALK /EML4 fusion onkogen som i øjeblikket et mål for stoffet Crizotinib [30]. Andre midler, der anvendes til behandling af lungekræft er ikke genspecifikke, og i stedet målrette generelle molekylære veje som folat anitmetabolites (methotrexat og pemetrexed), mitotiske inhibitorer (docetaxel, piclitaxel og vinorelbin), topoisomeraseinhibitorer (etopophos og topotecan) og nukleosid analoger, som interfererer med DNA-syntese (carboplatin, cisplatin, og gemciabine) [31], [32]. Hæmmere af EGFR-rettet tyrosinkinase er etableret for at være en effektiv behandling mulighed for avanceret NSCLC ikke reagerer på kemoterapi. Men EGFR-rettet monoklonale antistoffer i kombination med platinbaseret første-line kemoterapi, cetuximab kombineret med cisplatin /vinorelbin og bevacizumab i kombination med platinbaseret kemoterapi resulterede i bedre overlevelse sammenlignet med kemoterapi alene hos patienter med fremskreden EGFR-positive NSCLC [ ,,,0],33]. Andre målrettede behandlinger, herunder dobbelt og multi-kinase inhibitorer er i tidligere stadier af klinisk udvikling [34].

Med ophobning af viden og erfaring på næste generations teknologier, er det nødvendigt at udvide vores forståelse i følsomhed specifikke mutationer til individualiserede behandlinger. Derfor samle en komplet profil af mutationer i lungekræft for anvendelse af personlig og skræddersyet målrettet terapi er afgørende for at udvikle fremtidens kræftbehandling. Vi mener, at en hurtigere og omkostningseffektiv genotype værktøj såsom Ion Torrent sekventering teknologi vil være meget gavnligt for tildeling af disse specifikke lægemidler i den nærmeste fremtid brug for lungekræft.

Materialer og metoder

Etik erklæring

undersøgelsen er godkendt af human Research Ethics Committee for First Affiliated Sygehus af Dalian Medical University, Kina. For Formalin faste og paraffin indstøbt (FFPE) tumor prøver fra tumorvæv bank ved Patologisk Institut for hospitalet, institutionelle etiske komité frafaldes behovet for samtykke. Alle prøver og medicinske data, der anvendes i denne undersøgelse er blevet uigenkaldeligt anonymiseret.

Patientinformation

Tumor prøver anvendt i undersøgelsen blev indsamlet fra First Affiliated Sygehus af Dalian Medical University, Kina. blev analyseret i alt 76 FFPE tumor prøver fra patienter med lungecancer. Den gennemsnitlige alder af de 76 patienter var 61 år (spændvidde: 28-80 år). Af disse 40 patienter var mænd med en gennemsnitsalder på 61 år (spændvidde: 28-80 år), og 36 patienter var kvinder med en gennemsnitsalder på 61 (interval: 36-75 år). Tumor prøver anvendt i undersøgelsen blev indsamlet fra First Affiliated Sygehus af Dalian Medical University, Kina. blev analyseret i alt 76 FFPE tumor prøver fra patienter med lungecancer. Den gennemsnitlige alder af de 76 patienter var 61 år (spændvidde: 28-80 år). Af disse 40 patienter var mænd med en gennemsnitsalder på 61 år (spændvidde: 28-80 år), og 36 patienter var kvinder med en gennemsnitsalder på 61 (interval: 36-75 år). 33 af de 76 patienter (20 mænd, 13 kvinder) blev klassificeret som lav patologiske differentiering; 27 (14 mænd, 13 kvinder) på midten, 15 (6 mænd, 9 kvinder) med høj og 1 kvinder af ukendt differentiering. AJCC cancer staging er som følger: 0 patienter på I eller Ia; 18 (10 mænd, 8 kvinder) på stadium Ib; 3 (2 mænd, 1 kvinde) ved fase IIa; 9 (5 mænd, 4 kvinder) på stadium IIb; 26 (14 mænd, 12 kvinder) på stadium IIIa; 8 (4 mænd, 4 kvinder) på stadium IIIb; 0 patienter på stadium III c; og 12 (5 mænd, 7 kvinder) på trin IV. Ud af de samlede 76 patienter, 16 af de 40 mænd rapporterede ingen historie af rygning, mens ingen af ​​de 36 kvinder rapporteres at være rygere; 6 mænd rapporterede lys rygning; 17 mænd rapporterede tunge rygning, og en mand med en ukendt rygevaner.

DNA forberedelse

DNA blev isoleret fra FFPE prøver efter afparaffinering og udvinding af 3-5 um tyk paraffinsnit i xylen, ved hjælp af QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) ifølge producentens anvisninger.

Ion torrent PGM bibliotek forberedelse og sekventering

En Ion Torrent adapter-ligeret bibliotek blev gjort efter fabrikantens protokol for Ion AmpliSeq Bibliotek Kit 2.0 (Life Technologies) (Part # 4.475.345 Rev. A). Kort fortalt, 50 ng puljede ampliconer blev ende-repareret, og DNA-ligase blev anvendt til at ligere Ion Torrent adaptere P1 og A. Efter oprensning med AMPure perler (Beckman Coulter, Brea, CA, USA), adaptorligerede produkter var nick-translateret og PCR-amplificeret i i alt 5 cyklusser. AMPure perler (Beckman Coulter) blev anvendt til at oprense det resulterende bibliotek, og en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) og Agilent Bioanalyzer DNA High-Sensitivity LabChip (Agilent Technologies) blev anvendt til bestemmelse af koncentrationen og størrelsen af ​​biblioteket.

Sample emulsion PCR, emulsion bryde, og berigelse blev udført under anvendelse af Ion PGM 200 Xpress Template Kit (del # 4.474.280 Rev. B), ifølge producentens instruktioner. Kort beskrevet et input koncentration af en DNA-template copy /Ion Sphere Partikler (ISP) blev tilsat til emulsionen PCR Master mix og emulsionen dannes ved anvendelse af en IKADT-20 mixer (Life Technologies). Dernæst blev internetudbydere udvundet og template-positive internetudbydere blev beriget til brug med Dynabeads MyOne Streptavidin C1 perler (Life Technologies). ISP berigelse blev bekræftet ved hjælp qubit’en 2,0 fluorometer (Life Technologies). 316 chips blev anvendt til sekventering på Ion Torrent PGM i 65 cyklusser, og prøverne blev Barcoded. Ion PGM 200 sekventeringskit blev anvendt til sekventeringsreaktioner, som pr anbefalede protokol (del # 4.474.004 Rev. B). Datasættet er deponeret til NIH Sequence Læs Arkiv, og tiltrædelsen nummer er SRP028756 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?study=SRP028756).

Variant ringer

data fra PGM kørsler blev behandlet indledningsvis ved hjælp af Ion Torrent platform-specifikke rørledning software Torrent Suite til at generere sekvens læser, trim adapter sekvenser, filter og fjerne dårligt signal-profil læser. Indledende variant ringer fra Ion AmpliSeq sekventering data blev genereret ved hjælp af Torrent Suite Software v3.0 med en plug-in “variant der ringer” program. For at eliminere fejlagtige basen calling blev tre filtrering trin anvendt til at generere endelige variant ringer. Det første filter blev fastsat til en gennemsnitlig total dækning dybde 100, hver variant dækning 20, en variant frekvens af hver prøve 5, og P-værdi 0,01. For at eliminere fejl basen calling blev adskillige filtrerings- trin, der anvendes til at generere endelige variant opkald (fig. S1.). Det første filter blev fastsat til en gennemsnitlig dybde af den samlede dækning af 100, en hver variant dækning af 20, en variant frekvens af hver prøve 5 og P-værdi 0,01. Det andet filter blev ansat ved visuelt at undersøge mutationer ved hjælp Integrativ Genomics Viewer (IGV) software (http //www.broadinstitute.org /igv) eller Samtools software SAMtools software (https://samtools.sourceforge.net), samt ved bortfiltrere mulige streng-specifikke fejl, dvs.. en mutation blev kun fundet i enten “+” eller “-” streng, men ikke i begge strenge af DNA. Det tredje filtrering skridt blev sat som varianter inden 727 hotspots, i henhold til producentens anvisninger. Det sidste filter skridt var at fjerne varianter i amplikon AMPL339432 (PIK3CA, exon13, CHR3: 178.938.822-178.938.906), der ikke er unikke matchet i humane genom. Fra vores sekventering kører ved hjælp af Ion Ampliseq Cancer Panel, blev falske sletning af data genereret fra JAK2 genet locus og dermed sekventering data fra dette locus blev udelukket fra yderligere analyse.

Somatiske mutationer

Opdagede mutationer blev sammenlignet med varianter i 1000 genomer Project [35] og 6500 exomes fra National Heart, Lung, og Blood Institute Exome Sequencing Project [36] for at skelne somatiske mutationer og germline mutationer.

bioinformatiske og eksperimentel validering anvendt

Vi brugte COSMIC [37] (version 64), MyCancerGenome database (https://www.mycancergenome.org/) og nogle publikationer til at vurdere genkomst mutationer i lungekræft (tabel S1). Derudover blev nogle detekterede missense mutationer bekræftet ved Sangers sekventering (fig. S2).

Statistisk analyse

Vi udvælger genkomst somatisk missense /i-del mutationer af lungekræft at gøre den statistiske analyse.

Støtte Information

Figur S1.

Filter proces med varianter. Bemærk: (a) Strand-partisk varianter blev elimineret ved hjælp Integrativ Genomics Viewer (IGV) software (http //www.broadinstitute.org /igv); (B) Varianter i AMPL339432 bør fjernes, fordi dette amplikon er ikke enestående tilpasset PIK3CA i humane genom; (C) Alle vores statistiske analyser var baseret på data i blå boks

doi:. 10,1371 /journal.pone.0095228.s001

(DOCX)

Figur S2.

Sanger valideringer af 15 varianter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0095228.s002

(DOC)

tabel S1. Salg Frekvensen af ​​punktmutationer, indsættelse og sletning mutationer i 737 loci af 76 menneskelige lungekræft

Doi:. 10.1371 /journal.pone.0095228.s003

(DOCX)

Tak

Vi vil gerne takke Rong Shi på Wu Jieping Foundation, Dr. Haibo Wang, Zhi Yu, Ying Li og andre medlemmer af San Valley Biotechnology Inc. Beijing for deres bistand i prøve og dataindsamling. Vi vil også gerne takke personalet på Beijing Military Hospital for deres generøse støtte til DNA-sekventering og dataindsamling.