PLoS ONE: Undersøgelse af radiosensitivitet Gene signaturer i Cancer Cell Lines

Abstrakt

Intrinsic radiosensitivitet er en vigtig faktor bag strålebehandling svar, men der er ingen metode til sin rutinemæssige vurdering i humane tumorer. Gene signaturer øjeblikket afledes og nogle blev tidligere genereret af ekspressionsprofil NCI-60 cellelinien panel. Det blev antaget, at fokusere på mere homogene tumortyper ville være en bedre tilgang. To cellelinie kohorter blev anvendt afledt af cervix [n = 16] og hoved og hals [n = 11] cancere. Radiosensitivitet blev målt som overlevende fraktion efter bestråling med 2 Gy (SF2) ved klonogene assay. Differential genekspression mellem radiosensitive og radioresistente cellelinjer (SF2 / median) blev undersøgt ved hjælp af Affymetrix GeneChip Exon 1.0ST (livmoderhalsen) eller U133A Plus2 (hoved og hals) arrays. Der var forskelle inden cellelinje kohorter vedrørende væv af oprindelse reflekteres af ekspression af den lagdelte epitel markør P63. Af 138 gener identificeret som værende forbundet med SF2, kun 2 (1,4%) var kongruent mellem livmoderhalsen og hoved og hals karcinom cellelinjer (MGST1 og TFPI), og disse ikke partitionere de offentliggjorte NCI-60 cellelinjer baseret på SF2. Der var variabel succes med at anvende tre offentliggjorte radiosensitivitet underskrifter til vores kohorter. Et gen signatur, er oprindeligt uddannet på NCI-60 cellelinjer, gjorde delvist adskilte følsomme og resistente cellelinjer i alle tre cellelinje datasæt. Resultaterne bekræfter ikke vores hypotese, men antyder, at en fælles transkriptionel signatur kan afspejle radiosensitivitet af tumorer af heterogene oprindelse

Henvisning:. Hall JS, Iype R, Senra J, Taylor J, Armenoult L, Oguejiofor K, et al. (2014) Undersøgelse af radiosensitivitet Gene signaturer i kræftceller. PLoS ONE 9 (1): e86329. doi: 10,1371 /journal.pone.0086329

Redaktør: Olivier Gires, Ludwig-Maximilians University, Tyskland

Modtaget: Juli 29, 2013; Accepteret: 9. december 2013; Udgivet: 22 Jan 2014

Copyright: © 2014 Hall et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Cancer Research UK (C1094 /A9437, C1467 /A7286, og C147 /A6058), Medical Research Council UK (GO801525), og ECMC (C1467 /A7286) støttede denne forskning. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Mark J O’Connor er ansat af AstraZeneca. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. Andre forfattere erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter at erklære.

Introduktion

Intrinsic radiosensitivitet er en vigtig faktor bag strålebehandling respons [1]. Radiosensitivitet kan måles som den del af cellerne overlever en enkelt 2 Gy dosis af stråling (SF2) med høje værdier indikerer radioresistance. Mens andre metoder er tilgængelige til måling af cellulær radiosensitivitet i cellelinjer, er SF2 betragtes som den gyldne standard, og er understøttet af en stærk klinisk evidens.

In vitro

målinger af SF2 korrelerer med

in vivo

radioresponse i musemodeller [2]. Måling af SF2 i primære humane tumorer var en uafhængig prognostisk faktor i patienter med carcinom i cervix [3] og hoved og hals [4] efter potentiel kurativ strålebehandling. Trods de beviser for dens betydning, nogen fremgangsmåde er tilgængelig for en rutinemæssig vurdering hos patienter, på grund af de upraktiske forhold til måling tumor radiosensitivitet. Evnen til at måle en tumor radiosensitivitet ville være et stort fremskridt og tillade individualiseret behandling for at reducere dosis og /eller udelade kemoterapi hos patienter med følsomme tumorer eller omvendt at intensivere behandling mod tumorer. Behandling individualisering bør øge overlevelse og reducere morbiditet. Skøn tyder på en biologisk individualiseret tilgang til behandling baseret på radiosensitivitet test kunne øge overlevelsesprocenten af ​​ . 10% [5]

Der er derfor interesse i at udlede et gen signatur, der afspejler radiosensitivitet. Adskillige metoder er blevet udforsket: identificere gener fremkaldt følgende bestråling i cellelinier [6]; identificere forskellen udtryk mellem induceret radioresistente og forældrenes radiosensitive kræft cellelinjer [7] og profilering af

in vitro

respons livmoderhals tumorer bestråling [8]. De fleste offentliggjorte undersøgelser var små og ikke er blevet uafhængigt valideret. De mest omfattende undersøgelser benyttede NCI-60 panel af cellelinier [9]. En undersøgelse identificeret 22 gener, der tilsammen diskriminerede mellem lave og høje SF2 værdier i 63 cellelinjer, baseret på en tærskel på 0,2 (dvs. cellelinjer med mindre end 20% kolonioverlevelse følgende 2 Gy defineret som radiosensitive) [10]. En anden række undersøgelser udviklede en prædiktiv klassifikatør af radiosensitivitet baseret på SF2 forbundet genekspressionsprofiler i NCI-60 linjer [11], [12], [13], [14]. Den endpoint af disse undersøgelser var en regressionsmodel af 10-hub gener, som havde prognostisk betydning, når de anvendes til tre kliniske datasæt (rektal, spiserøret og hoved hals kræft) [13] og var også prædiktiv for gavn af strålebehandling i brystkræft [15]. Derudover en meta-analyse af offentliggjorte data fra fire microarray platforme for NIC-60 celler identificeret en 31-gen radiosensitivitet signatur [16].

NCI-60 panel er det mest omfattende karakteriseret sæt af kræft cellelinjer og en offentlig ressource, der ofte anvendes som et screeningsværktøj til opdagelse narkotika [9]. Panelet indeholder cellelinier fra flere væv af oprindelse, men få radiobiologically relevante tumortyper, såsom cervix (n = 0) eller hoved og hals (n = 0), dvs. cancere, hvor strålebehandling er en vigtig del af behandlingen. Det er velkendt, at tumorer afledt fra forskellige væv varierer i radiosensitivities; med hæmatologiske maligniteter er følsomme, og glioblastom og melanomer mest radioresistente [17]. Undersøgelser viser, at basal genekspression niveauer korrelerer stærkt med væv af oprindelse, især mellem hæmatologiske og solide tumorer [10]. Som sådan betydelig variation og støj er til stede i NCI-60 ‘basale’ genekspression data, potentielt hæmme identifikationen af ​​gener associeret med SF2. Transkriptionsfaktoren P63 er en markør for planocellulært oprindelse og regulerer mange gener associeret med epidermoid /planocellulært skæbne. Tab af P63 er forbundet med opreguleringen af ​​gener associeret med en mere mesenchymal /vandrende celleskæbne [18].

Det blev antaget, at udlede en radiosensitivitet underskrift med en mere homogen gruppe af cellelinier ville være en bedre tilgang. Vi opnåede 16 cervical carcinoma cellelinier, en tumortype, hvor strålebehandling er vigtig, men som ikke er repræsenteret i NCI-60 panel. Cellerne blev karakteriseret i stramt kontrollerede basale betingelser; målte parametre omfattede SF2, protein ekspression ved omvendt-fase-protein array (ZeptoMARK) og genekspression ved Affymetrix Exon 1.0ST array. Vi har forsøgt at identificere gener, der blev differentielt udtrykte mellem høje og lave SF2 cellelinier i en enkelt homogen tumortype. Vi havde adgang til en anden uafhængig radiobiologically-relevant hoved og hals pladecellekræft (HNSCC) cellelinje kohorte (n = 11) for at validere vores resultater og dem, der stammer fra de offentligt tilgængelige NCI-60 data.

Materialer og metoder Salg

cellelinier

Fjorten kommercielt tilgængelige cervical carcinoma cellelinier blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC) eller den japanske Collection of Research Bioressourcer (JCRB). To andre cellelinjer (778 og 808) blev afledt i hus [19]. Alle livmoderhalsen cellelinjer blev dyrket i identiske betingelser: 4,5 g /l glucose DMEM plus Glutamax (Life Technologies, Paisley, UK), suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS) (Lot: A04305-0160, PAA Laboratories (Yeovil, UK )) og opbevares i en fugtig inkubator. Elleve hoved og hals cellelinier blev dyrket som beskrevet i tabel S1. Alle cellelinjer undergik STR-godkendelse og var mycoplasma gratis.

klonogene assays

Metoden er beskrevet andetsteds [20]. Kort beskrevet blev eksponentielt voksende celler trypsiniseret og bestrålet med 0-10 Gy ved stuetemperatur under anvendelse af en X-ray enhed i en dosis-rate på 1,37 Gy /min. Efter plating og 2-3 uger vækst, blev de dannede kolonier farves med krystalviolet og dem med 50 celler scoret. Hvert forsøg involverede mindst tre, men normalt seks tekniske replikater samt forsøg blev gentaget to (n = 4) eller tre (n = 21) gange. De viste data er gennemsnittet af de biologiske gentagelser.

HPV Genotypning

HPV genotypebestemmelse af disse cervikale karcinom cellelinjer er tidligere beskrevet [21]. For hoved- og hals-carcinom-cellelinier QRT-PCR for E2, E6 og E7 for HPV16 og HPV18 blev udført som beskrevet tidligere [22].

MTT assay

Fordoblingstid blev estimeret for hver celle line ved hjælp af CellTiter 96 Aqueous Ikke-radioaktivt celleproliferationsassay (Promega, Madison, WI, USA) i henhold til producentens ‘overnight’ protokol. En standard 7-dages vækstkurve blev udført i plader med 96 brønde. Kolorimetriske aflæsninger blev foretaget ved 570 nm og sammenlignet ved eksponentiel regression til en standardkurve for kendte celletæthed. Et gennemsnit af tre uafhængige gentagelser ved forskellige densiteter blev anvendt til at beregne middelværdien fordoblingstid.

RNA Extraction

Celler blev vasket i PBS og lynfrosset i flydende nitrogen. RNA blev ekstraheret og DNase behandlet ved anvendelse af Qiagen RNeasy Kit (Qiagen, UK), i henhold til producentens anvisninger. RNA integritet (RIN) og kvantificering blev målt under anvendelse af et Bioanalyser (Agilent Technologies Ltd, Santa Clara, CA, USA). 260/230 og 260/280 nøgletal blev vurderet ved hjælp af en NanoDrop 1000 spektrofotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA).

Western Blotting

protein status P63 af livmoderhalsen karcinom cellelinjer blev beskrevet tidligere [21]. Under anvendelse af de samme metoder Western blotting blev udført på hoved og hals cellelinjer, under anvendelse af følgende antistoffer: P63 muse monoklonale (BC4A4) (Abcam, Cambridge, UK) og muse monoklonale anti-β-Actin (klon AC-15) (Sigma . -Aldrich, Dorset, UK)

ZeptoMARK omvendt fase proteinarrays

Eksponentielt voksende celler blev vasket med PBS, lyseret i 75 pi CLB1 lysisbuffer (Zeptosens: a Division of Bayer ( Schweiz) AG, Schweiz), skrabet over i mikrofugerør, hvirvlet og inkuberet ved stuetemperatur i 30 minutter. Prøverne blev centrifugeret ved 15.000 rpm ved stuetemperatur, supernatanter indsamlet og koncentrationer bestemt ved Bradford-assay. Proceduren for spotting er blevet beskrevet før [23]. Kort fortalt blev livmoderhalscarcinom proteinlysater standardiseret til 2 mg /ml, hvoraf fire koncentrationer (0,20, 0,15, 0,10 og 0,05 mg /ml) blev set i to eksemplarer på en ZeptoMARK hydrofob chip (Zeptosens). Hver cellelinje blev uafhængigt dyrket og høstet to gange; følgelig to biologiske replikater blev plettet på arrayet. Chips blev blokeret med CeLyA puffer (Zeptosens), før inkubation med primære antistoffer i 22 timer ved 20 ° C. Fireogtyve antistoffer (Zeptosens) blev udvalgt på grundlag af deres rolle i cancer eller terapi modstand [24]. Efter inkubation overskydende primært antistof blev fjernet, og en fluorescens-mærket artsspecifikke antistof hybridiseret i 2,5 timer ved 20 ° C. Efter vask blev arrays læst på en ZeptoREADER (λ

ex /λ

em = 635/670 nm). Den resulterende relative fluorescensintensitet (RFI) blev beregnet fra en standardkurve konstrueret ud fra de fire koncentrationer (in duplo). Dette er en kvantitativ protein måling. Viste værdier er gennemsnittet af to biologiske gentagelser (dvs. 4 standardkurver).

Exon tabelhybridisering

100 ng RNA blev amplificeret ved anvendelse NuGen WT-Ovation FFPE v2 kit (NuGen Technologies, San Carlos , CA, USA). WT-Ovation Exon Module V1.0 blev anvendt til dannelse ST-cDNA og 4 ug blev hybridiseret til human Exon 1.0 ST arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA). Yderligere oplysninger og rådata (CEL filer) er tilgængelige på https://bioinformatics.picr.man.ac.uk/vice (eller GEO:. GSE39066 (del af super serie GSE39067) Rådata for HNSCC cellelinjer er tilgængelige på GEO :.. GSE51370

Exon Array Dataanalyse

mikroarraydata blev normaliseret ved hjælp RMA [25] R /BioConductor pakke

annmap

og annmap databasen [26] blev anvendt at fjerne ikke-exoniske og multi-targeting probesets Array blev målt som procentdelen af ​​probesets markeret som “nuværende” med en konservativ cut-off (% Detection over baggrunden [% DABG]

P

. 0,01 ), og kun de probesets markeret “til stede” i mindst tre prøver blev bibeholdt. Denne filtrering reduceret antallet af probesets betragtes fra 1.411.399 til 353.981 exoniske probesets, hvoraf 243,301 bestået DABG filtrering. Gene niveau resuméer blev beregnet ved at tage medianen signal filtrerede probesets der kortlagt til unikke gen symboler. Når sammenfattet dette resulterede i 31.345 gener overvejes. Uovervåget hierarkisk klyngedannelse blev udført på de 1000 mest variantgener (sorteret på variationskoefficient) for at vise adskillelsen af ​​prøver baseret på de mest variable gener i dataene, og samtidig minimere beregningsmæssige krav. Signature Generation: Et gen signatur blev bestemt til at være mængden af ​​gener eller probesets der blev væsentligt forskelligt udtrykte mellem to grupper af cellelinier ifølge enten LIMMA eller Rank Product Analysis. Cut-off for signifikans var en falsk opdagelse korrigeret p-værdi på 0,01. Pakker: R: 3.0.2, Annmap: v1.2.1 hjælp menneskelig database bygge 66, LIMMA: 3.17.26, RankProd: 2.32.0, Pheatmap:. 0.7.7

Validation Kohorter, Array Kortlægning og Data Analyse

Hoved og hals cellelinje Affymetrix U133A Plus2 array-data var RMA normaliseret ved hjælp af

affy

pakke i R. Affymetrix kontrol probesets ( ‘AFFX’ kommenteret) blev fjernet. For variansanalyse, _X_, _a_ og _s_ kommenterede probesets blev også fjernet. NCI-60 – Affymetrix Plus2 cel filer blev hentet fra CellMiner (https://discover.nci.nih.gov/cellminer/) og RMA normaliseret som før. Efter normalisering, replikere arrays for hver cellelinje blev udregnet. Til sammenligning med de gen-level opsummeret exon array-data blev Plus2 probesets kortlagt til gen-symboler ved hjælp af

annmap

.

radiosensitivitet Signatur Mapping

Alle underskrifter blev anvendt til gen -level sammenfatninger af livmoderhalsen data ved hjælp af gen-symbol kortlægning. Ved anvendelse af underskrifter til HNSCC og NCI-60 Affymetrix Plus 2 datasæt, blev følgende protokoller anvendt:

Probeset ID’er for Eschrich

et al

[13] ti hub gener blev taget fra tabel 3 fra gruppens første papir [13]. NCI-60 test, der er cellelinjer blev taget fra tabel 4 fra gruppens andet papir [12]. Tolv cellelinjer blev opført, men der var ingen tilsvarende Plus2 array til brystet cellelinje MDN.

De top fire ranking gener fra Torres-Roca

et al

[14] (

RPIA , RBBP4, RGS19, ZNF208

) blev kortlagt til Affymetrix Plus2 probesets med

annmap

. De tilsvarende udtryk data for probesets blev udtrukket og plottet på en lineær skala (anti-log).

Gene symboler for Amundson

et al

gen signatur blev taget fra den anden tabel i oprindelige artikel [10]. Et gen kunne ikke kortlægges (Unigene ID Hs.494347), da der ikke var nogen tilsvarende gen symbol i tabellen. De resterende 21 gen symboler blev kortlagt til Plus2 probesets med

annmap

. Multi-kortlægning probesets blev fjernet.

Tewari

et al

signatur blev taget fra den anden tabel i den oprindelige artikel [8]. Fyrre-ni af de 60 probesets med et unikt gen symbol blev udvundet og kortlagt til Plus2 probesets bruger annmap. Multi-kortlægning probesets blev fjernet.

uden opsyn analyser (clustering, PCA) af genekspression data, underskrift analyse og differential ekspressionsanalyse (

LIMMA

[27],

RankProd

) blev udført ved hjælp af R. tærsklen for differentieret udtryk ved hjælp Rank Product Analysis (

RankProd

) var en Procent Falsk positiv (PFP) sats. 0,01

Graphing og Statistik

Resultaterne viser middelværdien af ​​biologiske gentagelser og præcision målinger er standardfejlen af ​​middelværdien medmindre andet er angivet. R værdier angiver Pearsons produkt øjeblik koefficient. Boxplots blev genereret i GraphPad Prism (v6.0): box-knurhår parametre: vandret bjælke angiver median udtryk, kassen viser interkvartile område; whiskers repræsenterer intervallet. Til visualisering af stråling overlevelseskurver en lineær andengradsligning var monteret i R, med radiobiologiske parametre udledt fra DRFIT [28]. R-pakken

LIMMA

, blev anvendt til at beregne differentierede udtryk værdier for protein profilering af data. Hvor passende,

p

-værdier er Benjamini og Hochberg falsk-discovery sats (FDR) korrigeret [29]. Principal komponent analyse (PCA) reducerer flerdimensionale data (dvs. tusindvis af gener) ind i data-point i 2-D rum. Jo tættere to data-punkter (prøver) den mere ligner prøverne. PC1 (x-aksen) tegner sig for størstedelen af ​​variansen i et eksperiment, PC2 (y-aksen) tegner sig for den komponent, der repræsenterer den næsthøjeste varians.

Resultater

Cervixcancer cellelinier har en række Radiosensitivities

tabel 1 opsummerer de cervikale karcinom cellelinjer. To cellelinjer ikke danne kolonier og SF2 værdier for de resterende 14 linier varierede fra 0,25 til 0,75 (Figur 1). SF2 værdier for seks af cellelinier blev udgivet af en anden gruppe [30], og rækkefølgen var identisk i begge undersøgelser. I de 14 cellelinjer, var der ingen korrelation af SF2 med plating effektivitet (R

2 = 0,005,

s

= 0,82), fordoblingstid (R

2 0,0001,

s

= 0,99) eller RNA ekspression af TP63, en markør for squamous celledifferentiering (

s

= 0,90).

a) Stråling overlevelseskurver viser overlevende andel (log10) (y aksen) efter bestråling med 2, 4, 6, 8 og 10 Gy i 14 cervical cancer cellelinjer. Datapunkter er middelværdien og standardfejlen for 2-3 uafhængige forsøg (3-6 replikater pr eksperiment). Data-punkter er udstyret med den lineære andengradsligning og farvet af nedenfor (blå) eller over (rød) medianen SF2.

Molekylær Karakterisering af Tilsyneladende Homogene Cervixcancer cellelinier Viser betydelige forskel

P63 udtryk (protein og mRNA) blev målt ved at skelne mellem skællede (P63 +) og ikke-skællede (p63-) histologiske typer af livmoderhalsen kræft [21]. Efter transskriptionsprofilering, ukontrollerede gruppering af de mest variant 1.000 gener (sorteret efter variationskoefficient) adskilt linjerne i tre klynger (figur 2A) med klynge 1 (C33A og HCSC1) bliver outliers. De andre 14 cellelinjer partitioneret som p63- og P63 + klynger med undtagelse af SKG1 som havde den laveste TP63 udskrift niveau af P63 positive linjer. HCS2 og 778, som ikke danner kolonier i vores betingelser, ikke klynge sammen antyder ingen fælles transkriptionel udtryk forbundet med evnen til at danne kolonier. Disse resultater antyder, at de store basale transkriptionelle forskelle mellem cellelinierne vedrører P63-ekspression. Interessant, mens HeLa-celler var de eneste adenocarcinom (AC) ifølge herkomst information, flere livmoderhalsen cellelinjer havde lignende globale transkriptionelle profiler. HCSC1 er ‘småcellet karcinom’ afledt dermed vi undersøgt, om gruppering af C33A og HCSC1 skyldtes en delt histologisk oprindelse. Principal komponent analyse (PCA) ved anvendelse af kombineret genekspression fra to gensekvenser underskrifter, uddannet på (i) AC og SCC [21] og (ii) småcellet carcinom [31], viste, at HCSC1 og C33A havde meget ens histologisk genekspression ( Figur 2B). Figur 2C viser, at C33A og HCSC1 havde lave niveauer af SCC gener og højere end gennemsnittet niveauer af småcellet carcinom gener. Det er interessant at bemærke, at AC-genekspression var lav i alle cellelinjer, herunder HeLa, hvilket antyder, at denne signatur, der er afledt i primær tumor materiale kan have begrænset anvendelighed i cellelinier. Disse data tyder på, at C33A er histologisk en småcellet carcinom afledt cellelinje og fremhæver de transkriptionelle forskelle forbundet med histologisk type, der findes i en forholdsvis homogen enkelt væv oprindelsesland kohorte.

A) Unsupervised hierarkisk klyngedannelse af de øverste 1000 gener sorteret efter variationskoefficient (fra Exon array-data). Heatmap farvelægning er ved log

2 udtryk værdi. Rækker repræsenterer gener og kolonner er cellelinier. x-aksen dendrogram (klynger) angiver ligheden mellem cellelinjer og y-aksen dendrogram ligheden af ​​gener. Klynge 1 repræsenterer to prøver med de laveste TP63 værdier (P63 negativ). Cluster 2 viser grupperingen af ​​de andre p63- cellelinjer herunder adenocarcinom HeLa. Klynge 3 grupper P63 + cellelinier, med undtagelse af SKG1, der er klassificeret med P63-negative celler. B) Principal komponent analyse af de 16 cervical cancer cellelinjer baseret på SCC (n = 1062), AC (n = 155) og småcellet carcinom (n = 77) genekspression. X-aksen viser principal komponent 1 (PC1) tegner sig for 15,5% af variansen. PC2 vises på y-aksen udgør 13,7% af variansen i histologi signatur genekspression. Farvning repræsenterer P63 proteinekspression. C) Graf, der viser den gennemsnitlige ekspression (log2) af SCC, AC og småcellet carcinom signatur. y-aksen er den Exon-array afledt median gen niveau ekspression, for hver af tre underskrifter. X-aksen viser cellelinie. Cellelinjer er rangeret baseret på TP63 udtryk.

Protein Profilering af ‘Cancer associerede Genes’ viser Key Pathway Forskelle mellem cellelinier, men ikke mellem høj og lav SF2 Grupper

Et panel af 24 proteiner blev udvalgt fra et katalog over prævaliderede antistoffer af proteiner impliceret i cancer, eller resistens over for behandling [24]. Par DNA skade responset antistoffer var tilgængelige og så valg var begrænset til godt validerede proteiner associeret med cancer, såsom p53, Rb, EGFR etc. Som P63 er væsentlig for den proliferative potentiale af stamceller i stratificeret epitel [32], vi postulerede at P63 + -celler ville udtrykke højere niveauer af epitel markørprotein E-cadherin, sammenlignet med p63- celler, og dette blev bekræftet af Proteinarray (

s

= 0,0001) (figur 3A). Vi sammenlignede også den mRNA-ekspression for E-cadherin (Exon-matrix afledt) med proteinet overflod målt ved array (relativ fluorescensintensitet [RFI] Figur 3B). Der var en stærk korrelation (R = 0,95,

s

0,001) viser, at protein niveauer afspejler transkriptniveauer for E-cadherin. Vi har registreret også høje niveauer af p53-protein i C33A celler sammenlignet med alle andre cellelinier (figur 3C), som følge af en kendt mutation i

TP53

genet [33] resulterer i proteinstabilisering. Disse data gav os stor tillid til protein profilering data. Unsupervised gruppering af protein data viste ingen relationer med kendte egenskaber (Figur S1). Ranking af cellelinier ved SF2 viste ingen tydelig visuel struktur til dataene (figur 3C). De 14 cellelinier blev opdelt i høje og lave radiosensitivitet grupper ved hjælp af medianen SF2 værdi, som tidligere anvendt med kliniske prøver [3], [4]. Fire proteiner blev differentielt udtrykt (

s

0,05) mellem de to grupper: mTOR, PTEN, IKB alfa, og NFKB, men ingen var signifikant efter falsk opdagelse sats (FDR) rettelse (figur 3D, tabel S2 ). mTOR var borderline signifikant (FDR

s =

0,09), og der var en tendens til en moderat korrelation mellem mTOR og SF2 (R = 0,48,

s

= 0,08, figur 3D). Disse data viser, at mens der var betydelige forskelle mellem cellerne i form af proteinekspression og pathway aktivering blev ingen af ​​de proteiner /pathways robust forbundet med SF2 i denne cellelinie kohorte.

A) Histogram viser ZeptoMARK protein-matrix afledt overflod for de 16 cervical cancer cellelinjer. Y-aksen viser E-cadherin proteinniveau (relativ fluorescensintensitet (RFI) for hver af cellelinierne (x-aksen). Cellelinjer rangeres baseret på TP63 ekspression. Gruppering ind P63 negative og P63 positive cellelinier bekræfter foreningen af E-cadherin med P63. den p-værdi er T-test afledt sammenligne forskellen i E-cadherinekspression mellem P63 positive og negative grupper, fejlsøjler vise standardafvigelse på to biologiske gentagelser. B) x-y scatterplot viser E- cadherin-genekspression (Exon array) på y-aksen mod E-cadherin-protein-ekspression på x-aksen. Stiplet linie repræsenterer perfekt korrelation. Exon array-data-punkter repræsenterer gennemsnittet af multiple exon probesets (n = 19) fra en enkelt exon ekspression array, hvor protein data er middelværdien af ​​to biologiske replikater. C) Heatmap viser gruppering af proteiner med lignende ekspression (y-akse) i ZeptoMARK proteinprofilering data. Cellelinier sorteret efter SF2. Heatmap farve er baseret på række Z-score. D) xy-scatter plot, der viser ekspressionen (y-aksen) af top 5 proteiner fra LIMMA mod SF2 (x-aksen). Tabel sammenfatter resultaterne af Limma differential protein-ekspression analyse mellem høj og lav SF2 grupper og Pearson korrelation af protein-ekspression (RFI) mod SF2. p-værdier betegner disse proteiner med differentiel ekspression (* p 0,05 eller ** p 0,01) mellem SF2 lave og høje grupper efter LIMMA analyse. Men disse ikke har bestået falsk opdagelse korrektion.

Hoved- og halskræft cellelinier Vis ligheder i Global Gene Expression

Tabel 2 opsummerer de 11 HNSCC cellelinjer, som alle blev HPV negativ (fig S2). Selvom rapporteret at være pladecellekarcinom, tre manglede P63-proteinekspression ved Western blot (Fig S3), og havde lave transkriptniveauer detekteret ved mikroarray. Den SF2 interval (0,3-0,8) svarede til den for livmoderhalsen linier (figur 4A), men de HNSCC cellelinier var mere radioresistente forhold til livmoderhalsen (

s

= 0,003). Medianen SF2, der anvendes til at opdele cellelinier var 0,36 for livmoderhalsen og 0,61 for HNSCC cellelinier. Som med livmoderhalsen cellelinjer, var der ingen forskel i SF2 mellem cellelinjer, der udtrykker høj versus lave niveauer af

TP63

(figur 4B) og ukontrollerede hierarkisk klyngedannelse partitioneret de HNSCC cellelinjer i tre grupper, der afspejler

TP63

ekspression (figur 4C). Den mest afsidesliggende klynge havde den laveste

TP63

udtryk, mens de resterende to klynger delte cellelinjer med udtryk / 6,0 (log

2) TP63. Disse data viser, at både cervikale carcinom og HNSCC cellelinjer har lignende radiosensitivities og globale transkriptionelle profiler, med de fleste af forskelle vedrørende transskription faktor P63. Som sådan HNSCC kohorten er en vævstype adskilt fra cervix, men bør være en god komparator for SF2 associerede gener afledt i cervikale cellelinier og

omvendt

.

A) Grafen viser middelværdien SF2 (log10) (y-akse) for hver af de 11 cervical cancer cellelinier (x-akse). Fejlbjælker viser standardfejlen gennemsnit af 2-3 uafhængige forsøg. B) Graf der viser, at der ikke er forskel i TP63 udtrykket mellem SF2 høje og lave grupper. Bar viser medianen udtryk. C) i vognen hierarkisk klyngedannelse af de øverste 1000 gener klassificeret efter variationskoefficient (fra U133 array-data). Heatmap farvelægning er ved log

2 udtryk værdi. Rækker repræsenterer gener og kolonner er cellelinier. x-aksen dendrogram (klynger) angiver ligheden mellem cellelinjer og y-aksen dendrogram ligheden af ​​gener. Klynge 1 repræsenterer to prøver med de laveste TP63 værdier (P63 negativ). Cluster 2 viser grupperingen af ​​den anden p63- cellelinie, sammen med lave TP63 udtrykker linjer. Cluster 3 grupper sammen alle HNSCC linjer med 6,0 (log2 udtryk) TP63 udtryk. D) Diagram at repræsentere den integrerede SF2 analyse af livmoderhalsen og HNSCC cellelinier. Nummer produktanalyse (FDR 0,05) identificeret 96 gener i livmoderhalsen kohorten differentielt udtrykt mellem SF2 lav og høj cellelinier. En identisk analyse i HNSCC cellelinier identificerer 97 probesets (42 gener) differentielt udtrykt mellem SF2 lav og høj cellelinier. PCA i livmoderhalsen gener viser, at de er i stand til at separere de cellelinier ved SF2. PCA af HNSCC gener er ligeledes i stand til at adskille prøverne baseret på SF2. Den Venn-diagram viser, at kun 4/138 gener er fælles mellem de to kohorter og af disse kun 2/138 er “kongruent” og er forbundet med den samme retningsvirkning (høj SF2 /lav SF2 i både HNSCC og livmoderhalsen). PCA viser probeset udtryk for disse to “almindelige” og “kongruente” gener (MGST1 og TFPI) i NCI-60 datasæt. Den NCI-60 øvre PCA viser data-points farvet for median SF2 og lavere PCA farvet for 0,2, tidligere brugt til at opdele radiosensitive og radioresistente cellelinjer i denne kohorte.

Gener differentielt udtrykte mellem høj og lav SF2 grupper er primært celletypespecifikke og kan ikke stratificere de NCI-60 cellelinier

Forskelle mellem cellelinjer partitioneret hjælp median SF2 blev undersøgt ved hjælp af genom-dækkende udtryk profilering. Ingen differentielt udtrykte udskrifter blev fundet af

LIMMA

efter flere test korrektion. Dette var også tilfældet for lineære modeller inkorporerer HPV og P63 udtryk som kovariater, eller i en 3-vejs ANOVA. Mens gener blev identificeret som differentielt blev udtrykt (rå p 0,05), ingen passerede falsk-discovery korrektion. En alternativ metode, Rank Product Analyse, anvendes på livmoderhalsen cellelinier identificeret 96 differentielt udtrykte gener (PFP ​​ 0,01) (Tabel S3). Disse gener adskilt livmoderhalsen prøver på den første principale komponent, der tegner sig for 36% af variationen (figur 4D), men kunne ikke adskille HNSCC cellelinjer baseret på SF2 (figur S4A). En gensidig analyse på HNSCC linjer identificeret et tilsvarende antal probesets (n = 97, kortlægning til 42 unikke gen symboler, PfP 0,01) differentielt udtrykte mellem høj og lav SF2 (tabel S4). Disse gener klarede sig godt i at adskille HNSCC cellelinier (figur 4D), men undlod at adskille livmoderhalsen linjer (Figur s4b).