PLoS ONE: Konstitutiv Phosphorylering af Aurora-A på Ser51 inducerer sin Stabilisering og deraf Overekspression i Cancer

Abstrakt

Baggrund

serin /threonin kinase Aurora-A (Aur-A) er en proto-oncoprotein overudtrykt i en bred vifte af menneskelige kræftformer. Overekspression af Aur-A menes at være forårsaget af genamplifikation eller mRNA-overekspression. Men afslørede seneste tegn på, at forskellene mellem forstærkning af

Aur-A

og overekspression satser af Aur-A mRNA blev observeret i brystkræft, mavekræft, hepatocellulært carcinom, og kræft i æggestokkene. Vi fandt, at aggressive hoved og hals kræft udstillet overekspression og stabilisering af Aur-A protein uden genamplifikation eller mRNA overekspression. Her testede vi den hypotese, at aberration af proteinet ødelæggelse systemet inducerer akkumulation og dermed overekspression af Aur-A i kræft.

vigtigste resultater

Aur-Et protein blev ubiquitinylated af APC

CDH1 og følgelig nedbrudt, når cellerne afsluttet mitose, og blev observeret phosphorylering af Aur-A på Ser51 under mitose. Phosphorylering af Aur-A på Ser51 hæmmede dens APC

CDH1-medieret ubiquitylering og deraf følgende nedbrydning. Interessant nok blev konstitutive fosforylering på Ser51 observeret i hoved- og halscancer celler med protein overekspression og stabilisering. Faktisk fosforylering på Ser51 blev observeret i hoved og hals kræft væv med Aur-Et protein overekspression. Desuden er en Aur-A Ser51 phospho-mimetiske mutant viste stabilisering af protein under cellecyklusprogression og forbedret evne til celle transformation.

Konklusioner /Betydning

I store træk denne undersøgelse identificerer en ny form for AUR-A overekspression i kræft gennem phosphorylering-afhængig inhibering af dets proteolyse foruden genamplifikation og mRNA-overekspression. Vi foreslår, at hæmning af Aur-A fosforylering kan repræsentere en ny måde at mindske Aur-A-niveauer i kræftbehandling

Henvisning:. Kitajima S, Kudo Y, Ogawa I, Tatsuka M, Kawai H, Pagano M et al. (2007) konstituerende Phosphorylering af Aurora-A på Ser51 inducerer sin Stabilisering og deraf Overekspression i Cancer. PLoS ONE 2 (9): e944. doi: 10,1371 /journal.pone.0000944

Academic Redaktør: Nils Cordes, Dresden Teknologiske Universitet, Tyskland

Modtaget: Juni 16, 2007; Accepteret: September 5, 2007; Udgivet: 26 September, 2007

Copyright: © 2007 Kitajima et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forskningen blev støttet af tilskud-in-støtte fra Ministeriet for uddannelse, videnskab og kultur of Japan (YK og TT); tilskud fra Uehara Mindefond (YK) og tilskud fra National Institutes of Health (R37-CA76584, R01-GM57587 og R21-CA125173) (MP)

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser eksisterer.

Introduktion

En række periodiske kinasereaktioner af cyclinafhængige kinaser (CDK) fremme udviklingen af ​​cellecyklus [1]. Mitotiske begivenheder med voldsomme og hurtige morfologiske ændringer er ligeledes stramt reguleret af andre kinaser, herunder Aurora-A, -B og -C [2]. Serin /threonin kinase Aurora-A (Aur-A) er afgørende for mitotisk post, centrosom overlapning, spindeldannelse, kromosom adskillelse og cytokinese [3]. Menneskelig

Aur-A /STK15

er placeret på kromosom 20q13.2, som er almindeligt forstærkes i forskellige kræftformer, herunder bryst-, tyktarms-, blære, æggestokke, bugspytkirtel og hoved og hals kræft [4] – [9] og niveauerne af Aur-A mRNA og protein er også steget i de tumorer [10] – [14]. Således overekspression af Aur-A kinaseaktivitet har været tænkt at fremme carcinogenese ved at forstyrre den mekanisme, der sikrer opretholdelse af det normale centrosom eller kromosom nummer, måske på grund af svækkelse af centrosom eller centromer funktion, cytokinese eller spindel checkpoint regulering [2], [15], [16].

det er velkendt, at de fleste cellecyklus regulatorer nedbrydes af den ubiquitin-proteasom systemet (UPS) [1], [17]. AUR-A er også nedbrydes via ubiquitinligase APC (det anafase-fremmende kompleks) og dets co-aktivator CDH1 er involveret [18], [19]. Foreslåede krav til Aur-A ubiquitylering er anerkendelse af den C-terminale Destruction boks (D-box) ved CDH1 [20], og en ekstra A-kasse /DAD motiv i

Xenopus

Aur-A [21], [22]. Desuden er det blevet foreslået, at Ser53 (svarende til Ser51 i humant Aur-A) af A-kassen er phosphoryleret under mitose og at phosphorylering på Ser53 (eller 51 i human) er afgørende for mitotiske stabilisering af

Xenopus

[23] og human Aur-A [24]. Selvom den mitotiske modifikation, der påvirker Aur-A stabilisering blev opdaget, forbliver de fysiologiske dynamik og dens regulering ufuldstændigt forstået.

Tidligere undersøgelser har vist, at niveauet af Aur-Et protein i tumorer ikke altid korrelerer med forstærkning af

Aur-A

gen [25], [26]. Vi fandt også, at hoved og hals kræft cellelinjer uden genamplifikation udtrykte Aur-Et protein på højere niveauer i forhold til dem med genamplifikation. Derudover har en nylig undersøgelse ved anvendelse af en transgen model og afledte celler viste, at transgen Aur-Et protein er beskyttet af UPS-medieret nedbrydning under mitose [27]. Disse kumulative fund førte os til hypotesen, at aberration af proteinet ødelæggelse systemet inducerer akkumulation og dermed overekspression af Aur-A i kræft. Her viser vi, at forhøjede niveauer af Aur-A observeret i hoved og halscancer cellelinjer skyldes konstitutiv fosforylering af Ser51 som forhindrer APC

CDH1-medieret ubiquitylering og sekventiel nedbrydning af Aur-A.

Resultater

Overekspression af Aur-a i hoved og halscancer korrelerer med et fald i dens nedbrydning

Overekspression af Aur-a er vist i en bred vifte af menneskelige kræftformer. Ved immunhistokemi, hoved og hals kræft celler udtrykte Aur-A på højere niveauer, sammenlignet med normale orale epitelceller (figur 1A). Vigtigere er det, Aur-A overekspression korreleret med dårlig overlevelse af patienter med hoved- og halscancer (supplerende tabel, tabel S1). Som Aur-A er kortlagt til kromosom 20q13.2, som er en region, der almindeligvis amplificeret i epitelmalignanser er overekspression af Aur-A menes at være forårsaget af genamplifikation og /eller overekspression af mRNA. Vi fandt imidlertid, at høj ekspression af Aur-A protein ikke alene var forårsaget af genamplifikation og mRNA-ekspression i hoved og halscancer cellelinjer (figur 1b). Især Aur-A proteinekspression i HSC2 og HSC3 celler var højere end i HSC4 celler, der indeholder både gen-amplifikation og forhøjede mRNA-niveauer. Behandling med proteasominhibitor, ZLLL, induceret Aur-A protein akkumulering i HSC4 og Ca9-22 celler, men ikke i de cellelinier, der viser høj ekspression af Aur-A (HSC2, HSC3 og Ho-1-U-1) (figur 1C). Desuden halveringstiden af ​​Aur-A protein var længere i HSC2 og HSC3 celler end i HSC4 celler korrelerer med overudtrykt Aur-A protein (figur 1D). Disse fund førte os til den hypotese, at der ud over genamplifikation eller mRNA-overekspression, kan Aur-A overekspression i hoved- og halscancer celler forårsaget af nedsat proteinnedbrydning

A:. Immunhistokemisk ekspression af Aur-A er vist i normal mundslimhinden og hoved- og halscancer. B: Sammenligning af genamplifikation, mRNA ekspression og protein-ekspression i 6 hoved og hals kræft cellelinjer. Genamplifikation og mRNA-ekspression blev tidligere behandlet (9). Proteinekspression blev undersøgt ved Western blot-analyse. CUL1 udtryk blev anvendt som en loading kontrol. C: Ophobning af Aur-A protein ved proteasominhibitor, ZLLL. Cancerceller blev behandlet med eller uden 25 pM ZLLL i 6 timer. Ekspression af Aur-A blev undersøgt ved Western blot analyse. CUL1 udtryk blev anvendt som en loading kontrol. D: Halveringstiden af ​​Aur-A i kræftceller. Cancerceller blev behandlet med CHX for angivne tid. Ekspression af Aur-A blev undersøgt ved Western blot analyse. Tid nuller blev normaliseret i lige Aur-A i stedet for samme mængde protein uddragene direkte sammenligne de to halveringstider. CUL1 udtryk blev brugt som en belastning kontrol.

Phosphorylering af Aur-A på Ser51 hæmmer APC

CDH1-medieret nedbrydning

Aur-Et protein udtryk toppe under mitose i pattedyr celler (supplerende figur, fig. S1 A og B). ZLLL behandling induceret Aur-A-akkumulering i celler i G1-fasen, men ikke i celler i mitose (supplerende figur, fig. S1c). Faktisk proteinniveauet af Aur-A fald i sen mitose som en konsekvens af ubiquitylering medieret af APC og dens co-aktivator CDH1 [20]. Brug af co-transfektionsforsøg, fandt vi, at Aur-A proteinet blev nedbrudt via CDH1, men ikke CDC20 (figur 2A), som tidligere rapporteret [18], [19], [23], [24], [28]. I modsætning hertil Aur-B, en Aur-A paralog, blev ikke nedbrudt ved enten transfektion af CDH1 eller CDC20 (figur 2A). Dernæst undersøgte vi detaljeret mekanisme APC

CDH1-medieret Aur-A nedbrydning. Aur-A har fire formodede D-Box og en KEN box motiver, der potentielt kunne blive anerkendt af APC

CDH1 ubiquitin ligase kompleks. I

Xenopus

, den N-terminale A-box og C-terminus D-kasse med Aur-A er essentielle for dens nedbrydning [23]. Skematisk domænestruktur af human Aur-A vildtype og to deletionsmutanter (AN og ΔC) er vist i figur 2B. Positionen af ​​to nedbrydningsprodukter motiver, A-kasse og D-box, er også angivet. Vildtype Aur-A blev nedbrudt ved co-transfektion af CDH1, mens både AN og ΔC Aur-mutanter ikke var nedbrudt (figur 2C). Den C-terminale D-box mutant og A-kasse mutant blev heller ikke nedbrudt, hvilket indikerer, at i lighed med

Xenopus,

de A-kasse og D-box motiver er afgørende for nedbrydning af humane Aur-A protein (figur 2D)

A:. FLAG-mærket Aur-A og Xpress-mærkede Aur-B blev co-transficeret med eller uden HA-mærket CDC20 eller CDH1 i 293T-celle. B: Skematisk domæne struktur Aur-A vildtype (wt) og to deletionsmutanter (AN og ΔC) er vist. Positionen af ​​to nedbrydningsprodukter motiver, A-kasse og D-box, er angivet. C: Aur-A-AN eller -ΔC mutant blev co-transficeret med CDH1 i 293T-celle. D: A-kasse muteret (

46RVL

48 – AVA) eller D-box mutant (

371RPML

374 – APMA) Aur-A blev cotransficeret med eller uden CDH1 . E: Ser51 blev erstattet af alanin (S51A) eller asparaginsyre (S51D). Hver wt, S51A og S51D mutant Aur-A blev co-transficeret med eller uden CDH1 eller CDC20. F: Følsomhed af ubiquitylering af Aur-A wt og S51 mutanter blev analyseret

in vitro

. APC immunfældet med anti-CDC27 antistof fra HeLa cellelysater blev underkastet den

in vitro

ubiquitylering assay som beskrevet i Materialer og metoder. Reaktionen blev afsluttet ved 60 minutter. IVT-Aur-A (pil) blev anvendt som substrat. “Aur-A

Ub” angiver ubiquitylated Aur-A.

Det er blevet rapporteret, at Ser53, Thr295 og Ser349 af Aur-A phosphoryleres i

Xenopus

mitotiske ekstrakter [21]. Interessant phosphoryleret Ser53 i

Xenopus

Aur-A blokerer nedbrydningen af ​​UPS [23]. Vi genererede en fosforylering defekt Aur-En mutant (Ser51 erstattet af Ala, S51A) og en phospho-efterligner mutant (Ser51 erstattet af Asp, S51D). Hver mutant blev transficeret i celler med eller uden CDH1 eller CDC20. Vild type og S51A mutant blev næsten helt nedbrudt, når cotransficeret med CDH1, mens S51D mutanten blev nedbrudt på mindre grad (Figur 2E). Vild type, S51A og S51D mutanter ikke nedbrudt via APC

CDC20 (Figur 2E). Ifølge det fundet

in vivo

, den S51D mutanten var mindre ubiquitylated

in vitro

af APC

CDH1 (figur 2F). Samlet indikerer disse resultater, at phosphorylering på Ser51 inhiberer D-box-afhængige nedbrydning af Aur-A forekommer i G1 celler via APC

CDH1.

Aurora-B (Aur-B), en paralog af Aur-A, adskiller sig på lokalisering og timingen af ​​aktivering under cellecyklus fra Aur-A, på trods af sekvens identitet -60% mellem dem. Sammenligning af den skematiske struktur mellem Aur-A og -B er vist i figur 3A. I lighed med Aur-A, Aur-B har en formodet KEN boks, fire D-box og en A-kasse motiver. Som vist i figur 2A, men Aur-B blev ikke nedbrydes af co-ekspression af enten CDH1 eller CDC20. Tilpasningen svarende til A-box motiv af Aur-A og -B er vist i figur 3B. Ser51 i Aur-A svarer til Glu32 i Aur-B. Vi troede, at Aur-B ikke kan nedbrydes via APC

CDH1 grund af Glu32 efterligne phosphorylering. For at understøtte denne hypotese blev aminosyrerne i AUR-B A-box muteret (KEP – PSN, ASN, PSA, KSP, KAP og PEN) og derefter transficeres i celler med eller uden CDH1 (figur 3C). Den skematiske af stederne muterede og resultaterne af de co-transfektion eksperimenter er vist i figur 3D. Interessant nok blev PSN, ASN, PSA, KSP og KAP mutanter nedbrudt, mens PEN-mutant ikke blev nedbrudt via APC

CDH1. Således Aur-B ser ud til at være beskyttet mod APC

CDH1-medieret nedbrydning på grund af Glu32 som efterligner virkningen af ​​phosphorylering. Alle sammen, disse resultater antyder, at phosphorylering af Aur-A på Ser51 spiller en vigtig rolle for regulering af dens stabilitet

A:. Sammenligning af skematiske struktur mellem Aur-A og -B vises. AUR-B har flere nedbrydnings- motiver på samme måde som AUR-A. B: Den tilsvarende aminosyresekvens af A-box mellem Aur-A og -B er vist. C: Aur-B med muterede aminosyrer i A-kasse (

31KEP

33 – PSN, ASN, PSA, KSP, KAP og PEN) var cotransficeret med eller uden CDH1. D:. Resumé af muterede steder og deres resultater er vist

Dernæst undersøgte vi, hvis fosforylering på Ser51 var involveret i reguleringen af ​​Aur-A udtryk under cellecyklusprogression. Vi rejste et phospho-specifikt antistof mod et syntetisk peptid, der spænder over den phosphorylerede Ser51 rest af Aur-A. Dette antistof genkendes specifikt vildtype og S51D mutant, men ikke S51A mutant (figur 4A), hvilket viser, at S51D substitution effektivt efterligne den negative ladning af phosphat i position 51. Phosphorylering på Ser51 i endogen Aur-A blev detekteret i HeLa-celler behandlet med nocodazol (hvilket øger procentdelen af ​​celler i mitose), men ikke i dem uden nocodazol (figur 4B). Halvfems minutter efter løsladelse fra mitose, Aur-A phosphoryleret på Ser51 forsvandt med faldende protein niveau af Aur-A og phosphorylerede Aur-A på T288 (figur 4C). Interessant phosphorylering på Ser51 blev ikke fundet i celler transfekteret med en kinase inaktiv mutant (K /R; K162R) (figur 4D). I fig. 4E, øget Ser51 phosphoryleret Aur-A blev observeret vægt efter noc /OA behandling, hvorimod FLAG-Aur-A K /R mutant blev ikke observeret med eller uden noc /OA behandling. Vi bruges okadasyre som phosphatase inhibitor. Vi brugte også nocodazol til synkronisering af cellerne i mitose når Ser51 phosphoryleres. Disse resultater indikerede, at kinaseaktiviteten af ​​Aur-A er afgørende for phosphorylering af Ser51. Konstateringen af, at Ser51 phosphorylerede Aur-A blev forøget med NOC /OA behandling er stærkt støttet af den nylige fund at phosphorylering på Ser51 blev dephosphorytated af PP2A. Men den detaljerede mekanisme for fosforylering på Ser51 behov yderligere eksperimenter

A:. Karakterisering af phosopho-specifikt antistof mod Ser51 af Aur-A. Ekspression af Ser51 phosphoryleret Aur-A protein undersøges ved immunopræcipitation (IP) med en phosopho-specifikt antistof mod Ser51 af Aur-A efterfulgt af immunoblottoing (IB) -analyse med et monoklonalt antistof mod Aur-A i wt og S51 mutanter af Aur- en transficeret 293T-celler. B: Phosphorylering af Ser51 i HeLa-celler med eller uden Noc behandling. C: Phosphorylering på Ser51 i HeLa-celler. HeLa-celler blev frigivet fra Noc-induceret prometafasen arrestation og opsamlet på de angivne tidspunkter. Prøver blev analyseret ved SDS-PAGE efterfulgt af Western blotting med phospho-S51 Aur-A, Aur-A, phospho-T288 Aur-A, phospho-histon H3 (Ser10) og CUL1 antistoffer (øvre panel). Graf viser ekspressionsniveauet af Aur-A, phospho-S51 Aur-A, phospho-T288 Aur-A og phospho-histon H3 (Ser10) (nederste panel). D: Ekspression af Ser51 phosphoryleret Aur-A protein undersøges ved Western blot-analyse i S51D og K /R (kinase inaktiv) mutanter transficerede 293T-celler. Phosphorylering på Thr288 blev undersøgt for at vise, at K /R påvirket som en dominerende negativ. E: Ekspression af Ser51 phosphoryleret Aur-Et protein undersøges af western blot analyse i wt og K /R mutant transficeret 293T-celler med nocodazol (NOC) og okadainsyre (OA)

Aur-A. overekspression i hoved- og halscancer celler er forårsaget af konstitutiv phosphorylering på Ser51

i betragtning af ovenstående resultater, vi hypotese, at Aur-A overekspression i hoved- og halscancer celler kan være forårsaget af en stabilisering af Aur-A protein gennem en konstitutiv phosphorylering på Ser51. Derfor undersøgte vi status for fosforylering på Ser51 i hoved og hals kræft cellelinjer. Phosphorylering på Ser51 blev detekteret i HSC2, HSC3 og Ho-1-U-1-celler (figur 5A). Interessant, disse celler udtrykte Aur-Et protein på højere niveauer. Dog viste HSC2 og HSC3 celler ingen genamplifikation eller mRNA overekspression. HSC4 celler, som udviser både genamplifikation og høje niveauer af mRNA, men proteinniveauer lavere end stede i HSC2 og HSC3, viste ingen phosphorylering på Ser51. Derfor vises status for Ser51 status at påvirke protein-ekspressionsniveauer. Interessant phosphorylering på Ser51 blev også påvist i HSC2, HSC3 og Ho-1-U-1-celler, når cellerne synkroniseret ved G1-fasen, hvilket antyder, at Ser51 var konstitutivt phosphoryleret i cancerceller (figur 5B). Desuden har vi undersøgt status for fosforylering på Ser51 i hoved- og halscancer sager. Faktisk var fosforylering på Ser51 påvist i 4 af 9 kræfttilfælde hoved og hals (figur 5C). Alle tilfælde med fosforylering på Ser51 viste stærkt udtryk for Aur-A protein

A:. Phosphorylering på Ser 51 i hoved- og halscancer celler. Ekspression af Ser51 phosphoryleret Aur-A protein undersøges ved immunopræcipitation (IP) med en phosopho-specifikt antistof mod Ser51 af Aur-A efterfulgt af immunoblottoing (IB) -analyse med et monoklonalt antistof mod Aur-A i hoved- og halscancer celler. Genamplifikation og mRNA-ekspression blev tidligere undersøgt [9]. B: Konstitutiv fosforylering på Ser 51 i hoved- og halscancer celler. Indiceret cancer cellelinjer blev frigivet fra NOC-induceret prometafasen anholdelse og opsamles i 4 timer. Cellerne var næsten helt forladt mitose. Ekspression af Ser51 phosphoryleret Aur-A protein undersøges ved immunopræcipitation (IP) med en phosopho-specifikt antistof mod Ser51 af Aur-A efterfulgt af immunoblottoing (IB) -analyse med et monoklonalt antistof mod Aur-A. CUL1 blev anvendt som en loading kontrol og phospho-histon H3 (Ser10) blev anvendt som en markør for mitose. C: Ekspression af Ser51 phosphoryleret Aur-A protein undersøges ved immunopræcipitation (IP) med en phosopho-specifikt antistof mod Ser51 af Aur-A efterfulgt af immunoblottoing (IB) -analyse med et monoklonalt antistof mod Aur-A i celler i normalt oralmucosal væv og 9 hoved- og halscancer væv. ß-Actin expession blev anvendt som en belastning kontrol.

Konstitutiv fosforylering på Ser51 forbedret celletransformation

For yderligere at vurdere tumorigenese induceret af overekspression af Aur-Et protein på grund af phosphorylering på Ser51 udførte vi stabiliteten af ​​S51D mutant og celletransformation i sammenligning med vildtypen. Mens ekspressionen af ​​vildtype proteinet og S51D mutanten er næsten identisk i mitotiske celler blev S51D mutanten ikke nedbrudt, når celler forlades mitose (figur 6A). Desuden halveringstiderne af S51D mutanten var længere end dem af vildtype, S51A og K /R-mutanter (figur 6B). Således blev S51D mutant stabilt udtrykt under cellecyklusprogression. Derefter undersøgte vi effekten af ​​celletransformation hjælp BALB /

c

3T3 A31-1-1 celler (Figur 6C). Vi co-transficeret

Aur-A

og G12V-

HRAS Hotel (T24-

ras

), og bemærkede, at

Aur-A

forstærkede frekvens af G12V-

HRAS

-induceret transformation. Interessant, blev et meget større antal foci findes ved hjælp af S51D mutanten, hvilket tyder på, at konstitutiv phosphorylering på Ser51 har forbedret onkogene potentialer

A:. Ændring af vægt og S51D Aur-A udtryk efter nocodazol udgivelse i HeLa-celler. HeLa-celler blev transient transficeret med wt og S51D Aur-A. Efter 48 timers transfektion blev cellerne synkroniseret ved NOC anholdelse og mitotiske ryste-off, frigives i frisk medium, høstet ved de angivne tidspunkter. Prøver blev analyseret ved SDS-PAGE efterfulgt af Western blotting med FLAG, cyclin-A, p27, phospho-histon H3 (Ser10) og CUL1 antistoffer. B: Half-life af wt og mutanter (S51A, S51D og KR) af Aur-A transficerede 293T-celler (venstre panel). Cellerne blev behandlet med CHX for angivne tid. Right panel viser Aur-A /CUL1 forhold målt ved densitometri. C: Effekt af S51D mutant Aur-A udtryk på celletransformation i BALB /

c

3T3 A31-1-1 celler. FLAG-mærket wt, blev S51A og S51D mutanter Aur-A transficeret med eller uden H-Ras (G12V). Ekspression af vildtype, S51A og S51D mutanter Aurora-A og H-Ras bekræftes ved Western blot-analyse (venstre panel). Efter 2 ugers dyrkning blev skålene fikseret med ethanol og farvet med Giemsa-opløsning (midterste panel). Kvantificering af antallet af transformerede foci som bestemt ved anvendelse af standard kriterier (højre panel). Fejl søjler repræsenterer den sd

Diskussion

Aur-A kinase er forbundet med centrosom fra tidspunktet for centrosom dobbeltarbejde igennem til mitotisk exit, og er også forbundet med regioner af mikrotubuli proksimale til centrosomer i mitose [2]. I somatiske celler, både protein- niveauer og kinaseaktiviteten af ​​Aur-A peak under mitose, og derefter falder (supplerende figur, fig S1) [4], [29]. Det er blevet afsløret, at Aur-A ubiquitylated af APC

CDH1 ved afgangen fra mitose [18], [19], [23], [24], [28]. APC

CDH1 ubiquitinligase kompleks genkender proteiner indeholdende enten D-Box eller KEN-box motiver [30] – [32]. Faktisk Aur-A har fire D-Box og en KEN-kassemotiver. Her har vi bekræftet, at den C-terminale D-box og N-terminal A-boks (

47RxLxPSN

52) var afgørende for nedbrydningen af ​​humant Aur-A, i lighed med tidligere rapporter [20] – [ ,,,0],22]. Desuden

Xenopus

Ser53 i A-kassen phosphoryleres under mitose og at fosforyleret Ser53 (eller 51 i human) er afgørende for mitotiske specifikke stabilisering [23], [24]. Vi fandt også, at Ser51 fosforylering hæmmede APC

CDH1-medieret nedbrydning. Som vist i figur 3A, Aur-B har også fire D-Box, en KEN-kassemotiver og lignende a-box-sekvenser til Aur-A. Selv om det for nylig er blevet rapporteret, at protein niveau af Aur-B også styres af APC

CDH1 [33], [34], i vores undersøgelse, havde Aur-B ekspressionsniveauet ikke ændre sig efter co-transfektion med CDH1 (figur 2A). Interessant Aur-B E32A og E32S mutanter (Glu32 svarer til Ser51 af Aur-A) blev nedbrudt af APC

CDH1 (figur 3C og D), hvilket kraftigt antyder, at Aur-B ikke kan nedbrydes på grund af phosphorylering efterligne på Glu32 . Samlet antyder, at phosphorylering på Ser51 spiller en vigtig rolle for stabiliseringen af ​​Aur-A protein. Interessant, fosforylering på Ser51 blev ikke observeret i kinase inaktiv mutant, hvilket tyder på, at Ser51 fosforylering kan reguleres i det mindste ved Thr288 fosforylering (figur 4D og E). Ser51 fosforylering blev observeret i mitose og forsvandt før faldende protein niveau af Aur-A (figur 4C). Foreslår vi derfor, at Ser51 fosforylering kan styre stabiliteten af ​​Aur-Et protein niveau og de-fosforylering af Ser51 kan være en udløsende faktor for Aur-A nedbrydning. Interessant det for nylig er blevet rapporteret, at proteinphosphatase PP2A og Aur-A co-lokaliseret ved cellepositionen poler under mitose [35]. Vi fandt, at Ser51 phosphorylering af Aur-A blev induceret efter 2 timer af PP2A inhibitor behandling i HeLa-celler (S. Kitajima og Y. Kudo upublicerede data). Disse resultater tyder på, at PP2A kan styre Aur-A nedbrydning ved de-phosphorylerende Ser51. Desuden er det kendt, blev påvist defekter af PP2A phosphatase i visse kræftformer og flere PP2A inhibitorer kan forårsage malign forandring [36]. Disse fund gjort os hypotesen, at forstyrrelse af PP2A kan fremkalde konstitutiv phosphorylering på Ser51 af Aur-A i kræftceller. Derfor undersøgte vi status PP2A og korreleret med Aur-A Ser51 fosforylering status i hoved og hals kræft cellelinjer. Imidlertid blev PP2A udtryk ikke korreleret med Ser51 fosforylering status i cancer cellelinjer (supplerende figur, fig. S2). Desuden undersøgte vi mutationsanalyse af

PPP2R1B

gen, der koder for beta-isoformen af ​​A-underenheden af ​​PP2A.

PPP2R1B

blev identificeret som en formodet menneskelig tumorsuppressorgen og mutation af

PPP2R1B

blev observeret i lunge- og tyktarmskræft [37]. Vi kunne ikke observere nogen mutation af

PPP2R1B

gen i hoved og halscancer cellelinjer (data ikke vist). Desværre kunne vi ikke finde den mulige sammenhæng mellem PP2A og Aur-A Ser51 fosforylering status i kræft. For at demonstrere sammenhængen mellem PP2A og Aur-A Ser51 fosforylering status behov yderligere eksperimenter.

I lighed med Aur-A regulering ved phosphorylering, er CDC6 beskyttet mod APC-deirected nedbrydning i kraft af det phosphorylering [38]. Phosphorylerede steder i CDC6 ved cyklin E-CDK2 ligger direkte op til D-box, og dermed forhindre anerkendelse af CDC6 af APC

CDH1. I tilfælde af Aur-A, Ser51 placeret langt fra D-feltet, men Ser51 ligger i A-kasse, som også er essentiel for ubiquitylering. S51D Aur-En mutant samt wt og S51D mutant Dog kan binde sig til CDH1 (supplerende figur, fig. S3A). Overraskende Aur-A binder til CDH1 og APC komponent, CDC27 ved M fase (supplerende figur, fig. S3B og C). Som

in vitro

ubiquitylering blev hæmmet i S51D mutant (figur 2G), foreslår vi, at Ser51 fosforylering kan forstyrre ubiquitylering proces ved APC

CDH1. Selv rolle APC underenheder i substrat anerkendelse er mere mystisk, ikke kun samspillet mellem substrater og co-aktivatorer, men også dem mellem substrater og APC synes at være D-box afhængige [39], [40]. Mutationelle analyser har vist, at DOC1 er afgørende for evnen til APC til ubiquitylate substrater i en processiv måde [41]. Derfor kan phosphorylering på Ser51 forstyrre anerkendelse af APC underenheder såsom DOC1, men der er en række andre muligheder. For at tydeliggøre den mekanisme for beskyttelse af Aur-A nedbrydning ved fosforylering på Ser51 yderligere undersøgelser vil være påkrævet. Desuden er det interessant at undersøge, om regulering af APC medieret proteolyse ved phosphorylering, som findes i Aur-A og CDC6, er en almindelig hændelse blandt andre substrater.

Aur-A er blevet rapporteret til overudtrykkes i en lang række humane cancere, og dets overekspression inducerer aneuploidi, centrosom amplifikation og tumordannende transformation i dyrkede humane og gnaverceller [3] – [5]. Som Aur-A er kortlagt til kromosom 20q13.2, en region, der almindeligvis amplificeret i humane cancere [4] – [6], overekspression af Aur-A menes at være forårsaget af genamplifikation eller transkriptionel aktivering. I nærværende undersøgelse fandt vi, at høj ekspression af Aur-Et protein ikke kun var forårsaget af genamplifikation og mRNA overekspression i hoved og hals kræft cellelinjer. Denne konklusion understøttes af tidligere konstatering af, at forstærkning af

Aur-A

blev fundet i kun 3% af tilfældene, men mere end 60% af tilfældene overudtrykt Aur-A mRNA og protein i hepatocellulære karcinomer [42]. Lignende uoverensstemmelser mellem forstærkning og overekspression satser blev også rapporteret i brystkræft [5], mavekræft [26] og ovariecancer [12]. kan forklares Denne forskel for ved vores resultater, at Ser51 konstitutiv phosphorylering blev observeret i hoved- og halscancer celler med overekspression af Aur-A protein. Faktisk blev Ser51 fosforylering også observeret i hoved og hals kræft væv med Aur-Et protein overekspression. Som Ser51 fosforylering hæmmede APC

CDH1-medieret nedbrydning, vi kraftigt, at konstitutiv phosphorylering på Ser51 kan fremkalde stabilisering protein og deraf følgende ophobning i kræftceller, der udviser overekspression af Aur-A protein (figur 7). Det for nylig er blevet afsløret, at muse embryonale fibroblaster ikke viste den transformerede fænotype, når Aur-A blev overudtrykt [43], og at transgene mus, som overudtrykker Aur-A udviklede ikke maligne tumorer [44]. Desuden blev det tilsvarende protein ikke påvises i ekstrakter, på trods af forhøjede transkripter for Aur-A i multiple organer i de transgene mus, og behandlingen af ​​transgene-afledte embryonale fibroblaster med proteasominhibitorer markant øgede proteinniveauet af transgen Aur-A [27]. Derfor undertrykkelse af proteinnedbrydning kan være vigtigt for Aur-A overekspression og dens onkogene rolle. Celletransformation ved Aur-A overekspression kan kræve undertrykkelse af proteinnedbrydning, ikke yderligere faktorer. Vigtigere, viste en Aur-A S51D mutant en betydelig høj modtagelighed for transformation (figur 6C). Sammenfattende foreslår vi, at beskyttelsen af ​​dens protein nedbrydning ved konstitutiv phosphorylering på Ser51 kan fremkalde Aur-A overekspression i kræft, og at ikke-nedbrydende Aur-A kan have stærke onkogene roller. Derfor kan regulering af Aur-A fosforylering være en roman mål for kræftbehandling.

Under mitose, Aur-A phosphoryleres på Ser51 i normale celler. Ved mitotisk exit, er Aur-A de-phosphoryleres med PP2A og ubiquitylated af APC

CDH1. På den anden side, Aur-A er konstitutivt phosphoryleret på Ser51 i cancerceller. Derfor kan Aur-A ikke ubiquitylated og dermed akkumuleret i kræftceller.

Materialer og metoder

Reagenser og antistoffer

proteasominhibitoren ZLLL (Z-Leu Leu-Leu-CHO) blev opnået fra Peptide Institute inc. (Osaka, Japan). Cycloheximid (CHX), nocodazol (NOC) og okadainsyre (OA) blev opnået fra Sigma. AUR-A phospho-Ser51-specifikt antistof blev genereret ved immunisering af kaniner med det syntetiske peptid P * SNSSQRIPC, svarende til aminosyrerne 50-59 af humant Aur-A-sekvens med en phospho-serin i position 51 (* S). Antistoffet blev oprenset fra serum ved to runder af affinitetskromatografi på en phospho-Ser51-peptid-søjle efterfulgt af en ikke-phosphopeptid-søjle.