PLoS ONE: gonadotropin-releasing hormon-agonister sensibilisere og Resensitize, prostatacancerceller til Docetaxel i en p53-afhængig Manner

abstrakt

gonadotropin-frigivende hormon (GnRH) receptorer udtrykkes i prostatacancer, specifikt i den mest aggressive fase af tumor (kastrationsresistent prostatacancer, CRPC), hvor standardbehandling, docetaxel kemoterapi, kan kun forbedre den mediane overlevelse af få måneder. Vi har tidligere vist, at GnRH-agonister udøver en antitumorvirkning i CRPC celler; dog en sammenhæng mellem GnRH-receptorer og apoptotiske maskinerne er at blive defineret. Formålet med denne undersøgelse var at vurdere, om der i CRPC celler, kan GnRH-agonister påvirke ekspressionen /aktiviteten af ​​apoptose-relaterede proteiner og kan sensibilisere eller resensitize, cancerceller for kemoterapeutika. Vi viste i p53-positive DU145 celler, GnRH-agonister: a) at øge ekspressionen af ​​proapoptotiske protein Bax; denne effekt er medieret af phosphorylering (aktivering) af p53, udløst af p38 MAPK; b) potensere den antiproliferative /proapoptotiske aktivitet af docetaxel; c) resensitize docetaxel-resistente celler til antitumoraktiviteten af ​​det cytotoksiske lægemiddel. Disse data viser, at GnRH-agonister sensibilisere og, endnu vigtigere, resensitize DU145 CRPC celler til kemoterapi i en p53-afhængig måde. For at bekræfte den afgørende rolle, p53 i aktiviteten af ​​GnRH-agonister, blev udført eksperimenter i p53-nul PC3 celler. Vi fandt, at GnRH-agonister ikke at øge Bax ekspression og ikke potensere den cytotoksiske aktivitet af docetaxel. Disse resultater kan give et rationale for nye kombination behandlingsstrategier, især for docetaxel-resistente CRPC patienter udtrykker et funktionelt p53 protein

Henvisning:. Moretti RM, Marelli MM, Taylor DM, Martini PGV, Marzagalli M, Limonta P (2014) gonadotropin-releasing hormon-agonister bevidstgøre og Resensitize, prostata cancer celler til Docetaxel i en p53-afhængig måde. PLoS ONE 9 (4): e93713. doi: 10,1371 /journal.pone.0093713

Redaktør: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italien

Modtaget: Oktober 14, 2013; Accepteret: 5 marts 2014; Udgivet: April 10, 2014

Copyright: © 2014 Moretti et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af Università degli Studi di Milano, PUR-programmet (tilskud n. 12-1-95 og 12-1-104). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den mest almindeligt diagnosticeret kræft for mænd og den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald blandt mænd i de vestlige lande [1]. Fleste prostatakræft er afhængig af tilstedeværelsen af ​​androgener for vækst og overlevelse, og androgen ablation terapi, rettet til at blokere androgen sekretion /aktivitet, er den mest effektive indledende behandling [2], [3]. Denne terapi omfatter kirurgisk eller kemisk kastration, opnås ved: administration af gonadotropin-frigivende hormon (GnRH) -analoger; blokering af bindingen af ​​androgener til deres receptor ved antiandrogener; inhibering af steroidogene enzymer. Desværre, på trods af en fremragende første svar, i ca. 2 til 3 år, de fleste prostatakræft vil udvikle sig til kastrationsresistent prostatacancer (CRPC) fase med øget proliferation og malignitet [4], [5]. For CRPC patienter, taxan kemoterapi udgør behandling af valg [6], [7]. Docetaxel virker ved at binde til tubulin for at fremme polymerisation og forhindrer mikrotubulusdepolymerisation i fravær af guanosintriphosphat. Det har også vist sig at inducere tumorcelledød ved at påvirke ekspression /aktivitet af flere cancerspecifikke mål, herunder nedregulering af den antiapoptotisk protein Bcl-2 og opregulering af pro-apoptotisk protein Bax [8], [9]. Men på trods af den indledende demonstration af en bedre overlevelse med docetaxel kemoterapi, blev forbedringen fundet, kun at være en progressionsfri overlevelse for nogle måneder [6], [10]. Behandling af patienter med CRPC der skrider frem efter docetaxel-baseret kemoterapi forbliver således en væsentlig klinisk udfordring. Identifikationen af ​​nye strategier med henblik på at overvinde docetaxel modstand vil sandsynligvis forbedre de terapeutiske muligheder for disse patienter.

GnRH blev først identificeret som hypothalamus centrale regulator af de reproduktive funktioner. Ved at binde til specifikke receptorer (GnRH-R) på hypofysen gonadotropes GnRH aktiverer hypofyse-gonade-aksen. GnRH-agonister, når det gives kontinuerligt og i høje doser, desensitize hypofyse GnRH-R, således at undertrykke gonadal steroid sekretion; på grundlag af deres aktivitet er disse forbindelser repræsenterer den mest udbredte og med succes anvendt medicinsk behandling for androgen-responsiv prostatacancer [2], [11].

Det er nu veletableret, at GnRH-receptorer er udtrykt i prostata cancerceller, specielt i CRPC celler og væv [12] – [15]

Disse receptorer (såvel som GnRH-receptorer i bryst- og gynækologiske cancerceller og væv) først er blevet karakteriseret med hensyn til bindingsaffinitet.. Imidlertid er rapporteret kontrasterende resultater: en klasse af lav-affinitet bindingssteder [12], [13], [16] – [18]; to typer af receptorer (en med høj affinitet og et med lav affinitet) [19] – [21]; en enkelt klasse af høj affinitet GnRH bindingssteder [22] – [25]. Især rapporterede vi tilstedeværelsen af ​​lav affinitet GnRH-receptorer i prostata kræftceller [12], [13]. Årsagen til denne forskel er stadig et spørgsmål om forhandling; dog kan det være på grund af de forskellige eksperimentelle betingelser fastsat (forskellige cancercellelinier og ligander, evaluering af bindingsaffiniteten i cancerceller /væv, der udtrykker de bindingssteder

vs

. celler manipuleret til at overudtrykke receptorerne, celle -specifikke posttranslationelle modifikationer af receptoren,

osv.

). Salg

Disse indledende kontrasterende observationer stimuleret karakterisering af kræft GnRH-receptorer på molekylært niveau. Specifikt rapporterede vi, at både mRNA, der koder for den humane hypofyse GnRH receptor og det tilsvarende protein er udtrykt i prostatacancerceller, enten androgen-afhængige eller kastrationsresistent [26]. Desuden har nukleotidsekvensen af ​​cDNA’et, der koder for tumor-receptorer blevet vist at svare til, som tidligere rapporteret for hypofyse-receptorer [27], [28].

Vi viste desuden, at GnRH-agonister, gennem aktivering af lokalt udtrykte GnRH-receptorer, udøver en stærk antiproliferativ virkning på prostata kræftceller, både

in vitro

in vivo

[12], [29], [30]; denne antitumorvirkning er specifik, da den er helt ophævet efter silencing af GnRH-receptoren ved hjælp af en specifik siRNA [31].

Udover reduceret celleproliferation, apoptose er blevet foreslået at være involveret i antitumor aktivitet af GnRH analoger. Men de data, hidtil tilgængelige på dette område er stadig kontroversielt [30], [32] – [35]

Her bekræfter vi vores tidligere observation, at GnRH-agonister ikke i sig selv, inducere apoptose i. CRPC celler. Men i p53-udtrykkende DU145 prostatacancerceller, de øger ekspressionen af ​​proapoptotiske protein Bax, gennem phosphorylering ved Ser-15 (

dvs.

., Aktivering) af p53, den største regulator af den indre apoptotiske vej ; aktivering af denne p53-Bax apoptotiske signalering udløses af p38 MAPK phosphorylering. Vi viser også, at GnRH-agonister sensibiliserer DU145 celler til den antimitotiske aktivitet af docetaxel. Vigtigere, GnRH-agonister resensitize docetaxel-resistente DU145 celler til døden-inducerende aktivitet af det kemoterapeutiske middel. Disse data indikerer, at i p53-positive prostatacancerceller, målretning lokalt udtrykte GnRH-receptorer ved hjælp af GnRH-agonister sensibiliserer og resensitizes cancerceller for kemoterapi, i en p53-afhængig måde. Den afgørende rolle, som p53 spillet yderligere demonstreret ved den iagttagelse, at GnRH-agonister ikke påvirker Bax udtryk og undlader at forstærke apoptotiske aktivitet af docetaxel i p53-nul-PC3 prostata kræftceller. Tilsammen disse resultater udgør rationalet for strategier for docetaxel-resistente CRPC patienter kombinationsbehandling, der udtrykker et funktionelt p53 protein.

Materialer og metoder

Cell Cultures

Den menneskelige kastrationsresistent DU145 (p53-positiv) og PC3 (p53-null) prostatacancercellelinjer blev erhvervet fra American Tissue Culture Collection. Både PC3 og DU145 celler repræsenterer den mest hensigtsmæssige og almindeligt brugt model af CRPC i litteraturen [36] – [40]. Celler blev rutinemæssigt dyrket i Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) medium suppleret med 5% kalvefosterserum (FBS), glutamin (1 mmol /l) og antibiotika (100 IU /ml penicillin G natrium og 100 ug /ml streptomycinsulfat), i fugtig atmosfære af 5% CO

2/95,% luft ved 37 ° C.

Materialer og antistoffer

GnRH-agonist Goserelinacetat [D-Ser (tBu )

6Aza-Gly

10-GnRH, Zoladex, GnRH-A] blev venligst stillet til rådighed af AstraZenecas Pharmaceuticals. GnRH antagonisten antid (Ant) og docetaxel (Doc) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich.

I alle forsøgene, GnRH-agonisten er blevet anvendt i en dosis på 10

-6 mol /l, på grundlag af tidligere undersøgelser, fra forfatternes laboratorium samt fra andre, havde til formål at undersøge de molekylære aspekter af antitumoraktiviteten af ​​GnRH-analoger i CRPC celler [29], [41] – [46]. Det samme område af doser blev også anvendt til at undersøge antitumoraktiviteten af ​​GnRH-agonister i flere eksperimentelle modeller af cancerceller overeksprimerer GnRH receptor [16], [47] – [49].

Pifithrin-a, den specifik inhibitor af p53 transkriptionel aktivitet, og SB203580, den specifikke p38 MAPK inhibitor, blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology og fra Sigma-Aldrich, henholdsvis

Antistoffer anvendt til Western blotting eksperimenter:. kanin-anti-human Bax (1 :500; # 2772), kanin anti-human p38 MAPK (1:1,000 ;. # 9212) og kanin anti-human p-p38 MAPK (1:1,000; # 9211) fra Cell Signaling Technology; muse monoklonalt anti-humant Bcl-2 (1:250; # Sc-7382), monoklonalt muse-anti-humant p53 (1:1,000; # Sc-53394), kanin-anti-human p-p53 (Ser-15; 1: 1000; # Sc-101.762) og gede anti-human actin 1-19 (1:1,000;. # Sc-1616) fra Santa Cruz Biotechnology

microarray analyse

DU145 prostatacancerceller var podet (5 x 10

5 celler /skål) i 10 cm vævskulturskåle; efter 48 timer blev celler behandlet med GnRH-A (10

-6 mol /l) i 24 timer og totalt RNA blev fremstillet med anvendelse af RNeasy mini kit (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. Efter kvalitetskontrol ved hjælp af en Bioanalyzer (Agilent 2100), blev RNA’er mærkes i henhold til Affymetrix protokol ved hjælp af One Cycle Mærkning Kit (Affymetrix). 15 ug resulterende cRNA’er blev hybridiseret på hele genomet microarray U133 plus 2.0. Efter hybridisering på Affymetrix HG-U133 Plus 2,0 chips blev genekspression værdier estimeret for hver probe sæt hjælp pakker i BioConductor suite [50]. Gener blev normaliseret og analyseres med det Robust Multichip Analysis (RMA) metode inden for det affy pakke [51] og GCRMA pakke [52]. Forskellene i log udtryk niveauer for både RMA og GCRMA normaliserede data blev evalueret af to-halet t-test, som implementeret i limma pakke [53]. Gener med

P

-værdier 0,05 og den absolutte udtryk fold ændre større end 1,5 blev betragtet som signifikant forskelligt udtryk (DE) mellem behandlede og ubehandlede celler. Et gen liste blev genereret ved at tage overlapningen DE gener genereret af limma fra både RMA og GCRMA normaliserings- metoder.

Western blot-analyse

Ved slutningen af ​​eksperimenterne blev cellerne vasket med PBS og lyseret i RIPA-puffer (0,05 mol /l Tris.HCl pH 7,7, 0,15 mol /l NaCl, 0,8% SDS, 10 mmol /l EDTA, 100 pmol /L NaVO4, 50 mmol /l NaF, 0,3 mmol /l PMSF , 5 mmol /l iodeddikesyre) indeholdende leupeptin (50 pg /ml), aprotinin (5 pl /ml) og pepstatin (50 ug /ml). Proteinkoncentration blev bestemt under anvendelse af BCA-metoden. Proteinekstrakter (30 ug) blev resuspenderet i prøvepuffer (0,5 mol /l Tris.HCl pH 6,8, 20% glycerol, 10% SDS, 0,2% 2β-mercaptoethanol, 0,05% blåt bromphenol) og opvarmet ved 95 ° C i 5 minutter . Efter elektroforetisk separation ved SDS-PAGE blev proteiner overført til nitrocellulosemembraner. Membraner blev blokeret i 3% fedtfri tørmælk før inkubering ved stuetemperatur i 2 timer med de specifikke primære antistoffer ved de passende fortyndinger. Påvisning blev udført under anvendelse af et peberrodsperoxidasekonjugeret-konjugeret sekundært antistof og forøget kemiluminescens reagenser (Supersignal kemiluminescensdetektion System). I hvert Western blot-eksperiment actin-ekspression blev vurderet som en loading kontrol. For hvert protein-analyse blev udført tre forskellige eksperimenter; den densitometrisk analyse rapporteret i tallene blev udført på de opnåede resultater fra de tre forskellige eksperimenter.

Cell Proliferation og Cell levedygtighed Studies

DU145 og PC3 celler blev podet (1 × 10

4 celler pr skål) i 6 cm-skåle. Efter 2 dage blev celler behandlet med GnRH-A (10

-6 mol /l) i 24 timer, enten alene eller i nærværelse af GnRH-antagonisten antid (Ant, 10

-6 mol /L) efterfulgt af docetaxel (10 nmol /l) i 48-72 timer. Celler behandlet med hver af de to lægemidler alene eller uden behandling fungerede som kontroller. Ved afslutningen af ​​behandlingerne blev celler høstet og talt ved hæmocytometer. For levedygtighed undersøgelser blev DU145 og PC3-celler behandlet som beskrevet og cellelevedygtighed blev målt ved trypan-blå-udelukkelse assay. Antallet af døde celler blev målt ved at tælle trypanblåt-farvning af celler.

Caspase-3 enzymaktivitetsassay

Caspase-3-lignende aktivitet blev vurderet ved anvendelse af CaspACE kolorimetrisk assay kit (Promega). DU145-celler blev podet (2 × 10

5 celler /skål) i 10 cm skåle. Efter 2 dage blev celler forbehandlet med GnRH-A (10

-6 mol /l) i 24 timer og derefter behandlet med docetaxel (10 nmol /l) i 72 timer. Ved afslutningen af ​​behandlingerne blev celler (både adhærente og hus) lyseret i lysisbuffer indeholdt i kittet, efterfulgt af centrifugering (15.000 x

g

i 10 minutter ved 4 ° C). Caspase-3-lignende aktivitet blev vurderet ved at følge den proteolytiske spaltning af kolorimetriske substrat Ac-DEVD-pNA. Prøver blev aflæst ved 405 nm i et spektrofotometer under anvendelse af en 100 pi Quarz kuvette. Den pan-caspaseinhibitor z-VAD-FMK blev brugt til at bekræfte assay specificitet.

Colony Formation Assay

For udviklingen af ​​docetaxel-resistente celler (DU145-R), DU145 celler podet i 10-cm skåle blev serielt behandlet med docetaxel (10 nmol /l, en gang om ugen), indtil de udviklet evnen til at vokse og dele sig i nærvær af lægemidlet (8 uger). For at undersøge om GnRH-agonister kan resensitize DU145-R-celler til aktiviteten af ​​docetaxel blev en standard klongenicitetsassayet udføres. DU145-R-celler blev podet ved 1000 celler /brønd i seks-brønds plader og fik lov at binde i 24 timer. Celler blev derefter behandlet med GnRH-A (10

-6 mol /l) i 24 timer efterfulgt af docetaxel (10 nmol /l) i 72 timer. Ved afslutningen af ​​behandlingen blev cellerne skyllet og frisk medium blev tilsat. Celler blev dyrket i 14 dage i 5% FBS indeholdende medium og derefter fikseret og farvet med krystalviolet. Billeder af farvede kolonier blev fanget af et Nikon photocamera.

Statistisk analyse

Når det er hensigtsmæssigt, blev data analyseret af Bonferroni test, efter envejs variansanalyse.

P

værdier. 0,05 blev betragtet som signifikante

Resultater

GnRH agonister Stigning Bax Expression i DU145 Celler

Vi har tidligere rapporteret, at GnRH-agonister udøver en antiproliferativ effekt på DU145 prostatacancerceller. Det er dog stadig uklart, om apoptose også kan være involveret i antitumoraktiviteten af ​​disse forbindelser [30], [32] – [35]. BCL-2-familien af ​​celledød regulatorer (både proapoptotiske og prosurvival) repræsenterer et kritisk kontrolpunkt i indre vej af apoptose. Balancen mellem disse to klasser af proteiner, afgør, hvordan cellen. Den proapoptotiske protein Bax, gennem oligomerisering med Bak, translokerer fra cytoplasmaet til mitokondrier at øge mitokondrisk ydre membranpermeabilisering, udløser cytochrom

c

frigivelse og caspase-3-aktivitet [54]. Her har vi undersøgt, om GnRH-agonister kan påvirke ekspressionen af ​​gener involveret i den apoptotiske vej. DU145-celler blev behandlet med GnRH-A i 24 timer og ændringer i genekspression profil blev vurderet ved hele genomet transkriptomisk analyse. Blandt de gener, hvis ekspression blev ændret af den behandling, vi fokuserede vores opmærksomhed på ekspressionen af ​​

Bax

.

Bax

udtryk var signifikant forhøjet ved 1,67 gange (tabel 1); denne stigning blev bekræftet på proteinniveau ved Western blotting (fig. 1A). Den stimulerende virkning af GnRH-A på Bax-ekspression viste sig at være specifik, da det blev ophævet ved samtidig behandling af cellerne med GnRH antagonist Antide (fig. 1B). På den anden side, har GnRH-agonist ikke påvirke ekspressionen af ​​antiapoptotisk protein Bcl-2 (fig. 1C).

(A) DU145-celler blev behandlet med GnRH-A (10

-6 mol /l) i enten 24 eller 48 timer. Western blotting blev udført på hele celleekstrakter ved anvendelse af et anti-Bax-antistof. Som forventet, GnRH-A behandling forøger Bax-proteinekspression ved 24 timers behandling. (B) DU145 celler blev behandlet med GnRH-A (10

-6 mol /liter) og med GnRH-antagonisten antid (Ant, 10

-6 mol /l), enten alene eller i kombination, i 24 timer. Western blotting blev udført som beskrevet i A). Ant, givet alene, ikke påvirker Bax ekspression, mens GnRH-A, som forventet, øger ekspressionen af ​​Bax. Denne stimulerende virkning af GnRH-A er specifik, da den er ophævet ved samtidig behandling af cellerne med GnRH antagonist. (C) Behandling af DU145 celler med GnRH-A (10

-6 mol /l) i enten 24 eller 48 timer, ikke påvirker Bcl-2-ekspression, som vurderet ved Western blotting. For både Bax og Bcl-2-protein-ekspression analyse er vist en repræsentant for tre forskellige forsøg. Data repræsenterer middelværdier ± SEM. *

P

0,05

versus

C (ubehandlede kontroller); **

P

0,05

versus

GnRH-A-behandlede celler

I DU145 Cells GnRH agonister opregulere Bax Expression gennem p53 signalering. pathway

den centrale rolle af p53 i den indre apoptotiske vej er veletableret [55]. Efter at være blevet aktiveret via phosphorylering ved Ser-15, p53 translokerer ind i kernen til at regulere ekspressionen af ​​proapoptotiske gener, såsom

Bax

[56]. Desuden blev p53 phosphorylering rapporteret at være afhængig af aktiviteten af ​​p38 MAPK [57]. Ved Western blot analyse fandt vi, at i DU145 celler, har GnRH-A behandling (1-48 timer) påvirker ikke udtryk for p53; imidlertid niveauerne af serin-15 phosphoryleret (

dvs.

., aktiv) blev form af proteinet betydeligt efter 1 og 5 timers behandling (fig. 2A). Når cellerne blev forbehandlet (2 timer) med pifithrin-α (p53-inhibitor) den stimulerende virkning af GnRH-A (24 timer) på Bax-ekspression blev fuldstændigt ophævet (fig. 2B). Vi fandt også, at behandling af cellerne med GnRH-A (5-15 minutter) påvirkede ikke ekspressionsniveauet af p38 MAPK; men det steg signifikant niveauerne af den phosphorylerede form af MAPK, ved 5 og 10 minutters tidsintervaller (fig. 3A). Forbehandling (30 minutter) af cellerne med SB203580 (1 pmol /l), den specifikke p38-inhibitor, reducerede signifikant de stimulerende virkninger af GnRH-a på p53 phosphorylering (1 og 5 timer) (fig. 3B). Således i DU145-celler GnRH-agonister opregulere ekspressionen af ​​proapoptotiske protein Bax via p53 phoshorylation; p38 MAPK er en opstrøms aktivator af denne p53-Bax-signalvejen.

(A) DU145-celler blev behandlet med GnRH-A (10

-6 mol /l) i forskellige tidsintervaller (1-48 timer). Western blot-analyse blev udført på hele celleekstrakter ved hjælp p53 eller p-p53 (Ser-15) antistoffer. Behandling med GnRH-A påvirker ikke udtryk for p53 på eventuelle tidsintervaller overvejes; imidlertid er niveauer af serin-15 phosphorylerede form af proteinet betydeligt efter 1 og 5 timers behandling. (B) DU145 celler blev behandlet med GnRH-A (10

-6 mol /l), enten alene eller efter en forbehandling med pifithrin-α (PIF, 30 pmol /l, i 2 timer), den specifikke p53-inhibitoren. Western blot-analyse blev udført på helcelleekstrakter vha Bax antiobody. De opnåede resultater viser, at pifitrhin-α, når de gives alene, ikke påvirker Bax ekspression. Som forventet, GnRH-A øger ekspressionen af ​​Bax; denne effekt er helt ophævet, når cellerne forbehandlet med pifithrin-α. En repræsentant for tre forskellige eksperimenter, for hver af de udførte analyser, er vist. Data repræsenterer middelværdier ± SEM. *

P

0,05

versus

C (ubehandlede kontroller); **

P

. 0,05

versus

GnRH-A-behandlede celler

(A) DU145 celler blev behandlet med GnRH-A (10

-6 mol /l) i forskellige tidsintervaller (5-15 minutter). Western blot-analyse blev udført på hele celleekstrakter ved hjælp p38 og p-p38-antistoffer. Behandling med GnRH-A ikke påvirker ekspressionen af ​​p38 på ethvert tidsinterval overvejes. På den anden side, GnRH-A øger niveauerne af den phosphorylerede form af p38 (p-p38) ved 5 og 10 minutters behandling. (B) Som forventet, GnRH-A øger ekspressionsniveauerne af p-p53, hvilket bekræfter tidligere resultater; densitometrisk analyse af dataene viser, at denne effekt reduceres væsentligt, hvis cellerne forbehandles med den specifikke p38-inhibitoren SB203580 (SB, 1 mmol /l, i 30 minutter). En repræsentant for tre forskellige eksperimenter, for hver af de udførte analyser, er vist. Data repræsenterer middelværdier ± SEM. *

P

0,05

versus

C (ubehandlede kontroller); **

P

. 0,05

versus

GnRH-A-behandlede celler

GnRH agonister oplysningsvirksomhed over for p53-positive DU145 celler til cytotoksiske aktivitet Docetaxel

en forstyrrelse i balancen mellem pro- og antiapoptotiske faktorer er et afgørende skridt i beslutningen cellen til at undergå apoptose eller overlevelse. Baseret på den stimulerende virkning af GnRH-agonister på Bax-ekspression, der medieres af p53-aktivering, undersøgte vi, om GnRH-agonister kan inducere apoptose i DU145-celler. Ved FACS-analyse kunne der ikke observeret nogen proapoptotiske virkning af GnRH-A på disse celler (data ikke vist). Disse observationer var ikke uventet, da det tidligere blev rapporteret, at i CRPC celler, GnRH-agonister reducerer celleproliferation uden at inducere apoptose [30], [32], [35]. Grunden, i DU145 celler, GnRH-agonister øge Bax niveauer uden at udløse apoptotiske begivenhed er spændende. Det er imidlertid velkendt, at DU145 celler overudtrykker antiapoptotisk protein Bcl-2, og niveauerne af dette protein ikke påvirkes af GnRH-A behandlingen (se fig. 1C). Således er det muligt, at den øgede ekspression af Bax induceret af GnRH-A i disse celler, ikke er tilstrækkelig til effektivt at forbedre Bax /Bcl-2-forhold til at udløse apoptose. På grundlag af disse overvejelser, vi ræsonnerede, at GnRH-agonister, gennem opregulering af proapoptotiske faktorer, kan bevidstgøre prostatacancerceller til aktiviteten af ​​cytotoksiske lægemidler, der er kendt for at virke ved at øge ekspressionen af ​​proapoptotiske faktorer, mens faldende som af antiapoptotiske proteiner. Vi fokuserede vores opmærksomhed på docetaxel siden: a) den repræsenterer behandling af valg for CRPC [4], [5]; b) det er blevet vist at inducere tumorcelledød gennem opregulering af pro-apoptotisk protein Bax og nedregulering af den antiapoptotisk protein Bcl-2 [8], [9]. Først ved Western blotting, bekræftede vi, at docetaxel (48 timer) signifikant nedsætter ekspressionen af ​​Bcl-2, og samtidig øge det af Bax (fig. 4A). Derefter vurderede vi, om GnRH-agonister kan forstærke antitumoraktiviteten af ​​docetaxel. Vi først fundet, når de gives alene, er GnRH-A (24 timer) ikke påvirke spredningen af ​​DU145 celler. Dette var ikke uventet, da vi tidligere har rapporteret, at i CRPC celler, kan GnRH-agonister udøver en signifikant antiproliferativ virkning, når de behandlinger udføres i længere tidsintervaller (4-7 dage) [29]. Tilsvarende data er blevet rapporteret for andre typer af tumorer [58], [59]. Derefter viste vi, at forbehandling DU145 celler med GnRH-A (24 timer) forbedrer de antiproliferative virkninger af docetaxel (48-72 timer) på alle tidsintervaller (fig. 4B). Desuden kunne vi vise, at sensibiliserende virkning af GnRH-A for docetaxel var specifik, idet den blev fuldstændig ophævet ved samtidig behandling af cellerne med GnRH antagonist Antide (fig. 4C). Under de samme eksperimentelle betingelser blev vurdering af cellelevedygtighed udført af trypanblåt udelukkelse assay. GnRH-A, når det gives alene, påvirkede ikke cellernes levedygtighed (fig. 4D). Som forventet, docetaxel forøgede signifikant antallet af positive trypanblåt farvede celler (døde celler). Denne virkning blev signifikant forstærket ved forbehandling af cellerne med GnRH-A på alle tidsintervaller (fig. 4D). At bekræfte, at forbehandling med GnRH-agonister sensibiliserer CRPC celler til antitumoraktiviteten af ​​docetaxel blev DU145-celler behandlet med GnRH-A (24 timer) og derefter med det cytotoksiske lægemiddel i 72 timer. Caspase-3-aktivitet blev derefter evalueret som en markør for apoptotisk celledød. GnRH-A, givet alene, påvirkede ikke caspase-3 aktivitet; som forventet, docetaxel øget enzymatisk aktivitet. Forbehandling af cellerne med GnRH-A signifikant forstærkede den proapototic virkning af det kemoterapeutiske middel. Effekten er specifik, da den blev modvirket ved samtidig behandling af cellerne med den pan-caspaseinhibitor z-VAD-fmk (Fig. 4E).

(A) Western blot-analyse blev udført for at bekræfte, at cytotoksiske aktivitet af docetaxel (Doc) medieres af en perturbation i forholdet mellem pro-til-antiapoptotisk proteiner. DU145-celler blev behandlet med docetaxel (10 nmol /l) i 48 timer. Som forventet falder docetaxel ekspressionen af ​​antiapoptotisk protein Bcl-2 og samtidig øge Bax ekspression. En repræsentant for tre forskellige eksperimenter er vist. (B) DU145-celler blev forbehandlet med GnRH-A (10

-6 mol /l) i 24 og derefter med docetaxel (10 nmol /l) i forskellige tidsintervaller (48-72 timer). Ved afslutningen af ​​behandlingerne blev celler talt ved hæmocytometer. Forbehandling af cellerne med GnRH-A øger den antiproliferative effekt af docetaxel på alle tidsintervaller overvejes. (C) DU145-celler blev forbehandlet med GnRH-A (10

-6 mol /liter) og med GnRH-antagonisten antid (Ant, 10

-6 mol /l), enten alene eller i kombination, i 24 timer og derefter med docetaxel (10 nmol /l) i 60 timer. Ved afslutningen af ​​behandlingerne blev celler talt ved hæmocytometer. Forbehandling af cellerne med GnRH-A øger den antiproliferative virkning af docetaxel; denne effekt er specifik, da den er fuldstændig ophævet ved samtidig behandling af cellerne med Ant. (D) Ved afslutningen af ​​behandlingerne (udført som beskrevet i B), blev cellelevedygtighed målt ved trypan-blå-udelukkelse assay. Antallet af døde celler blev målt ved at tælle trypanblåt-farvning af celler. Data er udtrykt som procent af farvede celler /totale celler. Docetaxel signifikant forøger antallet af døde celler; på alle tidsintervaller, er denne virkning signifikant potenseres ved forbehandling af cellerne med GnRH-A. (E) DU145-celler blev forbehandlet med GnRH-A i 24 timer og derefter behandlet med docetaxel i 72 timer. Ved afslutningen af ​​behandlingen caspase 3-lignende aktivitet blev vurderet ved anvendelse af CaspACE kolorimetrisk assay kit. Forbehandling af cellerne med GnRH-A potenserer markant proapototic effekt af docetaxel i form af caspase-3-aktivitet. Effekten er specifik, idet den modvirkes af den samtidige behandling med den pan-caspaseinhibitor z-VAD-fmk. I B-E bestod hver eksperimentel gruppe på seks replikater og hvert eksperiment blev gentaget tre gange. Data repræsenterer middelværdier ± SEM. *

P

0,05

versus

C (ubehandlede kontroller); **

P

. 0,05

versus

docetaxel-behandlede celler

Disse resultater indikerer, at der i p53-positive DU145 prostatacancerceller GnRH-agonister specifikt bevidstgøre cellerne til den cytotoksiske aktivitet af docetaxel; denne effekt er sandsynligvis en følge af GnRH-A-induceret aktivering af p38 /p53 /Bax apoptose-signalvejen.

GnRH-agonister Resensitize p53-positive DU145 celler til cytotoksiske aktivitet Docetaxel

til opnåelse docetaxel-resistente celler (DU145-R), blev DU145 celler serielt behandlet med docetaxel (en gang om ugen i 8 uger), indtil de udviklet evnen til at vokse i nærvær af lægemidlet. I disse celler blev modstanden mod cytotoksisk forbindelse forbundet med en signifikant reduktion af Bax-niveauer, uden ændring i niveauet af ekspression af Bcl-2 (fig. 5A), hvilket bekræfter tidligere observationer rapportering lille konsensus mellem taxan-modstand og overekspression af Bcl-2 [60]. På den anden side, vore data viser klart, at DU145 celler kan kontrast og overvinde antitumoraktiviteten af ​​kemoterapeutiske lægemidler ved at øge forholdet mellem anti- og proapoptotiske proteiner. Ved klonogene assay derefter undersøgt, vi, om GnRH-agonister kan resensitize docetaxel-resistente prostatacancerceller til proapoptotiske aktivitet af det kemoterapeutiske lægemiddel. Behandling af DU145-R-celler med GnRH-A (24 timer) alene påvirkede ikke cellernes evne til at danne kolonier (fig. 5B). Som forventet, DU145-R-celler dannede kolonier i tilstedeværelsen af ​​docetaxel (72 timer), hvilket bekræfter deres erhvervelse af resistens over for lægemidlet. Imidlertid kombinationsbehandling (GnRH-A i 24 timer efterfulgt af docetaxel i 72 timer) fuldstændigt ophævede kolonidannelse evne DU145-R-celler (fig. 5B). Disse resultater viser, at GnRH-agonister kan resensitize docetaxel-resistente prostatacancerceller til antitumoraktiviteten af ​​det kemoterapeutiske lægemiddel. Salg

DU145 prostatacancerceller blev gjort resistente over for docetaxel (Doc) efter behandling med det kemoterapeutiske lægemiddel (10 nmol /l) en gang om ugen i 8 serier. (A) Western blot-analyse af Bcl-2 og Bax i docetaxel-resistente (DU145-R) celler.