PLoS ONE: Stromal Expression af MIR-21 forudser Biokemisk Svigt i Prostata Cancer Patienter med Gleason Score 6

Abstrakt

Sigt

microRNA (miRNA) er involveret i forskellige neoplastiske sygdomme, herunder prostata kræft (pc’er). Formålet med denne undersøgelse var at undersøge miRNA profil i pc-væv, for at vurdere deres tilknytning til clinicopathologic data, og at vurdere potentialet af miRNA som diagnostiske og prognostiske markører.

Materialer og metoder

fra en kohorte af 535 patienter indsendt til radikal prostatektomi (RP), en stikprøve på 30 patienter (14 patienter med hurtig biokemisk svigt (BF) og 16 patienter uden BF) med Gleason score 7 blev analyseret. I alt 1435 miRNA blev kvantificeret ved microarray hybridisering, og udvalgte miRNA med den højeste Standardafvigelse (n = 50) blev godkendt af real-time kvantitativ PCR (QRT-PCR).

In situ

hybridisering (ISH) blev anvendt til at evaluere ekspressionen af ​​miR-21.

Resultater

MIR-21 var den eneste miR der var signifikant opreguleret i BF-gruppen (p = 0,045) mIR-21 var opreguleret hos patienter med BF sammenlignet med ikke-BF (p = 0,05). I univariate analyser, høj stromale udtryk for miR-21 havde prædiktiv effekt på biokemisk fiasko overlevelse (BFFs) og klinisk svigt overlevelse (CFFS) (p = 0,006 og p = 0,04, henholdsvis). I den multivariate analyse blev høj stromale udtryk for miR-21-ekspression sig at være en uafhængig prognostisk faktor for BFFs hos patienter med Gleason score 6 (HR 2,41, CI 95% 1,06-5,49, p = 0,037).

Konklusion

høj stromale udtryk for miR-21 blev forbundet med dårlig biokemisk recidiv overlevelse efter RP. For patienter med Gleason score 6, kan miR-21 hjælpe med at forudsige risikoen for fremtidig sygdomsprogression og derved hjælpe med at udvælge patienter til potentiel adjuverende behandling eller en mere stringent opfølgning

Henvisning:. Melbø-Jørgensen C, Ness N, Andersen S, Valkov A, Dønnem T, al-Saad S, et al. (2014) Stromal Ekspression af MIR-21 forudser Biokemisk Svigt i Prostata Cancer Patienter med Gleason Score 6. PLoS ONE 9 (11): e113039. doi: 10,1371 /journal.pone.0113039

Redaktør: Ichiro Aoki, Yokohama City University School of Medicine, Japan

Modtaget: 14. august 2014 Accepteret: 17 oktober 2014; Udgivet: November 17, 2014

Copyright: © 2014 Melbø-Jørgensen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Helse Nord, Den nordlige Health Administration (www.helse-nord.no) og Universitetet i Tromsø Arctic University Norge (www.uit.no). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PC) er den næststørste årsag til kræft dødsfald blandt mænd [1]. Resultatet sygdom er variabel og vanskelig at forudsige. I løbet af de sidste 30 år er antallet af radikale prostatektomi (RP) steget 25 gange, primært som følge af patienter overdiagnosticeres med ikke-letal kræft [2]. Testning for prostata-specifikt antigen (PSA) er den mest almindelige værktøj til at detektere prostatacancer. Imidlertid har nyere undersøgelser vist, at PSA koncentrationer ikke er i stand til at skelne mellem indolent og livstruende kræft på diagnosetidspunktet [3]. En identifikation af bedre prognostiske markører for risiko lagdeling vil derfor have stor indflydelse på den kliniske behandling af PC.

miRNA udgør en klasse af små ikke-kodende RNA-molekyler (-20 nukleotider), der er involveret i reguleringen af ​​protein-ekspression . miRNA kan produceres som et biprodukt fra mRNA produktion som inter-intron passagerer, eller kan transkriberes som en enkelt- eller polycistronisk produkt med RNA-polymerase II [4]. De virker ved at binde til 3’UTR af mål-mRNA og inducere inaktivering af mRNA ved Argonaut (siden) protein i RNA-inducerede Silencing proteinkompleks (RISC) [4], [5]. Mange miRNA er dereguleret i kræft og indflydelse på tumordannelse og progression, fordi de er placeret i områder af genomet, der er almindeligt overeksprimeres eller slettede [6]. Adskillige miRNA og deres mål udtrykkes unormalt i PC, hvilket fører til tumor progression, invasion, og metastase. De ændrede udtryk for nogle udvalgte miRNA er potentielt egnede som biomarkører for diagnose, prognose og klassifikation henblik på PC [7] – [9]. MIR-21 var de første onkogene miRNA at blive opdaget [10]. I PC, er miR-21 anses for at fungere som et onkogen, men dens rolle er uklar, og rapporterne er modstridende. Hulf et al. [11] fandt MIR-21 til at fungere som et tumorsuppressorgen, mens Ribas et al. [12] rapporterede, at overekspression af MIR-21 fremmes både hormon-afhængige og hormon-uafhængig tumorvækst i PC cellelinier. Desuden konkluderede de, at forhøjede niveauer af MIR-21 øger tumorudvikling, tumorvækst og induceret kastrationsresistent fænotype [13]. I modsætning hertil Folini et al. [14] fandt ingen forskelle i miR-21-ekspression mellem normal prostata væv og PC. Shi et al. [15] fundet miR-21 at være involveret i kemoresistens og at miR-21 blev opreguleret i Docetaxel resistent PC3 (pCR3) celler i forhold til vildtype PC3 celler.

I denne undersøgelse undersøgte vi miRNA profil i PC patienter. Blandt 1435 miRNA, miR-21 var den eneste kandidat miRNA, der var betydeligt opreguleret og gennemgik yderligere evaluering som en prognostisk markør for hele kohorten. Det regionale udvalg for medicin og sundhed Etik (2009/1393), i databeskyttelsesdirektivet officielle for Forskning (NSD), og National Datainspektionen har godkendt denne undersøgelse. Den etiske komité frafaldes behovet for samtykke. De patientjournaler blev anonymiseret og anonymiseres før analyse.

Patienter og metoder

Patienter og vævsprøver

Primær tumorvæv fra 535 radikal prostatektomi (RP) patienter diagnosticeret på University Hospital i Nordnorge, St. Olav Hospital og Nordland hospitalets køkken fra 1995-2005 blev anvendt i denne undersøgelse. Passende paraffin indlejret væv blokke og komplette demografiske og klinisk-patologiske data blev opnået for alle patienter (tabel 1). De tumorer blev gradueret i henhold til den ændrede Gleason klassificeringssystem [16] og iscenesat i henhold til de retningslinjer fra WHO [17]. Alle primære væv blev histologisk revideret af to patologer (ER og LTB).

miRNA screening

For miRNA profilering, 30 patienter i Gleason Score (GS) 7 undergruppe blev fortløbende valgt , 14 af dem med en hurtig biokemisk svigt BF (PSA≥0.4 ng /ml inden for 24 måneder efter kirurgi) og 16 patienter uden BF. GS 7 blev valgt som disse patienter viser en heterogen klinisk resultat. De miRNA blev identificeret ved microarray hybridisering og kvantificeres med RT-qPCR (tabel 2). I alt 1435 miRNA blev kvantificeret ved microarray hybridisering og selekteres miRNA med den højeste standardafvigelse (n = 50) blev valideret ved kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR). Syv miRNA blev identificeret som den mest op- eller nedreguleret. Af disse miR-21 var den eneste kandidat miR der var signifikant opreguleret af fold-ændring. MIR-21-ekspression blev derefter undersøgt i hele kohorten ved chromogen

i

situ

hybridisering (CISH) og vurderet som en prognostisk markør til PC. Begge tumor epitelceller og tumorassocierede stromale områder blev undersøgt separat. Den mediane follow-up tid var 89 måneder (spændvidde 6-188). Den sidste patient opdatering var November 2012.

Microarray byggeri

Tissue Microarray (TMA) konstruktion blev valgt til high-throughput molekylær patologi analyse [18]. For hvert tilfælde, en patolog (ER) histologisk identificeret og mærket to kerner med områder af tumorceller (epithelial tumor celler), to kerner med tumor stromale væv, én leder fra områder med normale epitelceller, og en kerne med normal stromavæv. TMA’erne blev samlet under anvendelse af et væv-arraying instrument (Beecher Instruments, Silver Springs, MD, USA). Kort beskrevet anvendtes en nål diameter 0,6 mm til at høste de markerede vævsområder fra de tilsvarende formalin-fikserede paraffin-indlejrede (FFPE) vævsblokke. Prøverne blev indført i en tom recipient paraffinblok ifølge et koordinatsystem mønster. For at inkludere alle kerneprøver blev tolv væv array-blokke bygget. Multiple 4 um snit blev skåret med en Micron mikrotom (HM355S), anbringes på objektglas, og forseglet med paraffin. Den detaljerede metode er blevet rapporteret tidligere [19].

RNA-ekstraktion

RNA blev isoleret fra formalin-fikseret paraffinindlejrede prøver med RECOVERALL Total Nucleic Acid Isolation Kit til FFPE væv (Life Technologies) , og blev sendt til Exiqon (Vedbæk, Danmark), der udførte miRNA screening eksperimentet. Væv anvendt til RNA-ekstraktion var tre 4 mm dyb, 0,6 mm cylindriske diameter kerner høstet fra mærket tumor rum fra FFPE blokke. Mikroarrayet anvendte LNA matrix 6

th generation menneske, rotte og viral microarray designet med en miRNA bibliotek med 1435 mennesker, rotter og viral miRNA. Totalt RNA (500 ng) fra både prøve og reference blev mærket med Hy3 og hY5 fluorescerende mærke henholdsvis ved hjælp af miRCURY LNA microRNA Hi-Power Labeling Kit, Hy3 /hY5 (Exiqon, Danmark) ved at følge fremgangsmåden beskrevet af producenten procedure. De Hy3-mærkede prøver og en hY5-mærket henvisning RNA prøve blev blandet parvis og hybridiseret til miRCURY LNA microRNA Array 6th Gen (Exiqon, Danmark), der indeholder capture prober rettet mod alle microRNA til human, mus eller rotte er registreret i miRBase 16,0. Hybridiseringen blev udført i overensstemmelse med miRCURY LNA microRNA Array Instruktionsbog anvendelse af et Tecan HS4800 hybridisering station (Tecan, Østrig). Efter hybridisering blev microarray objektglas scannes og gemmes i en ozon frit miljø (ozon niveau under 2,0 ppb) for at forhindre potentiel blegning af fluorescerende farvestoffer. De miRCURY LNA microRNA Array slides blev scannet ved hjælp af Agilent G2565BA Microarray Scanner System (Agilent Technologies, Inc., USA) og billedet analyse blev udført ved hjælp af Imagene 9 (miRCURY LNA microRNA Array Analysis Software, Exiqon, Danmark). De kvantificerede signaler blev baggrund korrigeret og normaliseret ved hjælp af den globale Lowess (lokalt vægtet Scatterplot Smoothing) regression algoritme.

Kvantificering af modne miRNA ved real-time qPCR

Kriterierne for udvælgelse miRNA til PCR validering var; signifikant P-værdi, høj fold forandring og forudgående plausibilitet. De miRNA valgt til yderligere afprøvning var miR-21, miR-141, miR-23a, miR-222, miR-205, miR-143 og miR-145 (tabel 2). Alle realtid qPCR forsøg blev udført af Exiqon (Vedbæk, Danmark).

RNA (2 pi) blev omvendt transskriberet i 10 pl reaktioner ved hjælp af miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR, polyadenylering og cDNA-syntese kit (Exiqon ). cDNA blev fortyndet 100 x og analyseret i 10 pi PCR-reaktioner i overensstemmelse med protokollen for miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR; hver microRNA blev analyseret tre gange ved qPCR på microRNA specialfremstillede pick-n-mix panel. Negative kontroller ekskl skabelon fra revers transcription reaktionen blev udført og profileret som prøverne. Amplifikationen blev udført i en LightCycler 480 Real-Time PCR System (Roche) i plader med 384 brønde. Amplifikationsprodukterne kurverne blev analyseret under anvendelse af Roche LC software, både til bestemmelse af Crossing punkt (Cp) af den 2. derivat metode og for smeltekurveanalyse.

amplifikation blev beregnet under anvendelse af algoritmer svarende til LinReg software . Alle assays blev undersøgt for forskellige smeltekurver og smeltetemperaturen (T

m) blev kontrolleret for at være inden for kendte specifikationer for assayet. Endvidere blev assays detekteret ved 5 Cp er mindre end den negative kontrol, og med Cp 37, der skal indgå i dataanalyse. Data, der ikke videregive disse kriterier blev udeladt fra yderligere analyse.

Brug NormFinder den bedste normalizer viste sig at være den miR-23b. Alle data blev normaliseret til denne miRNA i alle prøver (miR-23b – assay Cp).

In situ

hybridisering

Kromogen

i

situ

hybridisering (CISH) blev udført i henhold til “En-dags microRNA ISH-protokol” er udviklet af Exiqon, Vedbek, Danmark. Mærket låst nukleinsyre (LNA) modificerede prober fra Exiqon for miR-21 (HSA-miR-21miRCURY LNA Prod. Nr 38.102-15), positiv kontrol (U6 har /MMU /RNO) og negative kontroller (scramble-miRNA) blev anvendes. Nogle optimeringer af fremgangsmåden blev gjort for at få en specifik og sensitiv detektion af miRNA i vores afsnit fra FFPE TMAs.

4 um TMA objektglas blev inkuberet i tre dage ved 37 ° C for at vedhæfte kerner til super Frost Plus slides . Snit blev deparaffinised i xylen (3 x 5 min) og derefter hydratiseret til ethanolopløsninger til PBS, pH 7,4. Proteinase-K 20 um /ml, behandling blev udført i PK-puffer (5 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1 mM NaCl, autoklaveret) ved 37 ° C i 20 minutter i en ThermoBrite Hybridizer. Efter PBS vaske blev snittene rehydreret gennem ethanol og lufttørret. LNA-prober blev denatureret ved opvarmning til 90 ° C i 4 min. Hybridisering af LNA-prober MIR-21 (50 nM), krypteret miRNA (50 nM) og U6 (1 nM) blev udført i en ThermoBrite Hybridizer ved 50 ° C i 60 minutter. Stringente vaskninger blev udført i stuetemperatur 5x SSC puffer, forvarmede SSC buffere (50 ° C), 5 min i 5 x SSC, 2 x 5 min i 1 x SSC, 2 x 5 min i 0,2 SSC og 5 min i RT 0.2 x SSC. Snit blev blokeret mod uspecifik binding i blokerende opløsning fra DIG vaske og Block buffer sæt (11 585 762 001, Roche, Mannheim, Tyskland) i 15 minutter ved stuetemperatur i et fugtigt kammer. Alkalisk phosphatase (AP) -konjugeret anti DIG (11 093 274 910, Roche, Mannheim, Tyskland) 1:800 blev inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur i et fugtigt kammer til immunologisk påvisning. Efter PBS-T vaske substratet enzymatiske reaktioner blev udført med NBT /BCIP (11 697 471 001, Roche, Mannheim, Tyskland) ved 30 ° C i ThermoBrite i 120 min. Reaktionen blev standset med en 2 x 5 min vask i KTBT buffer (50 nM Tris-HCI, 150 nM NaCI, 10 nM KCI) efterfulgt af vask med dobbeltdestilleret vand. Snit blev modfarvet med nuklear fast red (WALDECK, ZE-012-250) ved stuetemperatur i 1 min og derefter skyllet i ledningsvand. Dehydrering blev udført ved at øge gradienter af ethanol-løsninger og endelig montering med Histokitt montering medium (Assistant-Histokitt, 1025/250 Sondheim /Rhoen Tyskland).

Scoring af CISH

blev udført Billedet analyse ved hjælp af ARIOL billeddannende system (Genetix, San Jose, USA) komponere af et mikroskop (Olympus BX 61) udstyret med en automatisk fase og slide loader, sammen med et kamera. Kernerne blev fotograferet under anvendelse af 20x forstørrelser. Den dominerende farvningsintensitet i epiteliale tumorceller og tumor- omgivende stromale celler blev scoret som; 0 = negativ, 1 = svag, 2 = moderat og 3 = stærk. Alle prøver blev anonymiseret og uafhængigt scoret af to patologer (ER og AV). Ved vurderingen én variabel i en bestemt kerne blev observatører blindet for snesevis af de andre variable og resultatet. Mean score for hvert enkelt tilfælde blev beregnet ud fra alle fire kerner og begge censorer. I tilfælde af uenighed (score uoverensstemmelse 1), dias blev fornyet overvejelse og konsensus blev nået ved observatørerne

Statistiske metoder

Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af den statistiske pakke IBM. SPSS version 21 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) (S1). Scoring værdier fra hver patolog blev sammenlignet for inter-observatør pålidelighed ved anvendelse af en to-vejs tilfældig effekt model med absolut aftale definition. En Wilcoxon signed rank test blev anvendt til at vurdere, om det var en statistisk signifikant forskel i ekspressionen af ​​MIR-21 mellem normalt væv og cancervæv. En sammenligning af de to prøvegrupper (BF versus ikke-BF gruppe) fra qPCR resultater blev tosidet t-test anvendes. For hele kohorte blev Pearson chi-square test og Spearman s Korrelation test udført for at undersøge sammenhængen mellem miR-21-ekspression og klinisk-patologiske markører. Kaplan-Meyer metode blev anvendt til fremstilling af plots BFFs og CFFS. Log-rank testen blev anvendt til at teste for statistisk signifikans. Væsentlige variable fra de univariate analyser blev yderligere vurderet i den multivariate overlevelsesanalyse ved hjælp af en baglæns trinvis Cox regressionsmodel med en sandsynlighed for trinvis fjernelse indrejse ved 0,05 og 0,10, henholdsvis. Signifikansniveauet anvendtes, var p 0,05 for alle analyser. Alle overlevelse analyser blev udført ved hjælp af tre forskellige endepunkter: (i) biokemisk fiasko overlevelse (BFFs), (ii) klinisk svigt overlevelse (CFFS), og (iii) PC ​​død overlevelse (PCDF). BF blev karakteriseret som en PSA≥0.4 ng /mL og stiger i mindst to forskellige blodprøver postoperativt. CF blev defineret som verificeret lokal symptomatisk progression og /eller kontrolleret metastaser til knogler, indre organer eller lymfeknuder på CT, MR, knoglescanning eller ultralydsundersøgelse. PCDFC blev defineret som død forårsaget af progressiv PC.

Resultater

patientrettigheder karakteristika og klinisk-patologiske variabler

Total kohorte.

En oversigt over patientens kohorte s demografiske, kliniske og histopatologiske karakteristika er vist i tabel 1. Median alder ved operation var 62 (interval 45-75). De prostatektomi var retropubic i 435 tilfælde og perineale i 100 sager. Omsider opfølgning, havde 170 patienter oplevede BF, 36 CF, og 15 patienter var døde af PC.

miRNA screening undergruppe.

I de 30 patienter med Gleason score 7, der gennemgik miRNA screening, median alder var 65 år (spændvidde 57-71), median PSA 18,8 ng /mL (interval 5-79), median tumorstørrelse 22 mm (interval 3-45), 21% oplevede CF og 14% var døde af prostata kræft. I den samlede gruppe af patienter med Gleason score 7 (n = 270), median alder var 62 (spændvidde 47-74), median PSA 18,0 ng /mL (interval 0,7-71), median tumorstørrelse 23 mm, 22% oplevede CF og 9% var døde af prostatacancer. Ingen af ​​disse forskelle var statistisk signifikante.

Microarray screening og qPCR validering

600 af 1435 miRNA undersøgt af mikroarrays, havde ekspression over baggrund (baggrund signalstyrke defineret som 1,2 gange intensiteten af ​​1 -quartile hver slide) (tabel 2). Af disse blev analyseret yderligere 50 miRNA med den højeste standardafvigelse (SD). Fra mikroarrayet analyser, en hierarkisk 2D-klyngedannelse viste en relativ ekspressionsniveau af miRNA, der var opreguleret i begge grupper (figur 1a). Ekspressionsniveauer af 7 miRNA blev valideret ved RT-qPCR (tabel 3, figur 1a). Fem af de syv analyserede miRNA viste lignende tendens i de to grupper. Den Heat Map diagram viser resultatet af de to-vejs hierarkisk klyngedannelse af udtrykket niveauet for de fem miRNA. Den z-score blev beskåret fra -2 til +2 (figur 1b). miR-21 var den eneste miRNA, der var betydeligt opreguleret i BF gruppen. Dette var i overensstemmelse med de i array-resultater. Der var en stærk korrelation mellem array hybridisering og QRT-PCR.

a) Relative ekspressionsniveauer af 50 miRNA, der blev givet udtryk for i alle 30 matchede vævsprøver med Gleason score 7. X-aksen viser enkeltpersoner og Y-aksen viser miRNA. Røde firkanter koder for opreguleret miRNA og grønne firkanter koder for down-regulerede miRNA. b) Heat Kort resultaterne af de to-vejs hierarkisk klyngedannelse baseret på qPCR resultater. De miRNA viste den samme tendens i qPCR validering og i microarray analyse. De normaliserede (DCP) værdier er blevet anvendt til analysen. Rød farve repræsenterer et udtryk niveau over gennemsnittet, blå farve repræsenterer udtryk lavere end gennemsnittet.

Angivelse af miR-21 og sammenhænge i den samlede kohorte

Generelt miR-21 blev udtrykt på et højere niveau i tumor stromale områder end i tumor epitelceller (figur 2). Intensiteten af ​​MIR-21-ekspression var stærkere i cytoplasmaet af tumorvæv sammenlignet med normale væv fra patienter (p 0,001). Der var ingen forskel i miR-21-ekspression mellem tumor epitelceller og normale epitelceller. En signifikant højere ekspression af MIR-21 blev fundet i tumor stroma område end i ikke-neoplastiske stromal område (p 0,001). Ved at sammenligne tumor epitelceller med stromale tumorceller, blev miR-21 udtrykt ved højere niveauer i stromale tumorceller (p 0,001).

Der var betydelige sammenhænge mellem høj tumor stromale udtryk for miR-21 og pT-stadium (

r

= 0,134, p = 0,003), perineurale infiltration (PNI) (

r

= 0,175, p 0,001) og vaskulær infiltration (

r

= 0,222 p 0,001). Vi fandt en svag sammenhæng mellem stromale udtryk for mir-21 og Gleason score (

r

= 0,218, p 0,001). Der var også betydelige sammenhænge mellem stromale udtryk for miR-21 og Gleason Score (GS); GS 7, GS 7 og GS 7 (r = 0,238, p 0,001).

Der var ikke forskel i stromale udtryk for miR-21 mellem undergrupper af Gleason score, 3 + 4 (n = 220, 41%) og 4 + 3 (n = 80, 15%) (r = – 0,001, p = 0,991)

univariat analyse

Den klinisk-patologiske variabler pT-stadium (. p 0,001), præoperativ PSA værdi dikotomiseret ved 10 ng /dl (n = 221, p 0,001), Gleason score (p 0,001), tumor størrelse dikotomiseret ved 20 mm (n = 285, p 0,001), perineurale infiltration (PNI) (ingen = 134, p 0,001), positive kirurgiske margener (PSM) (n = 286, p = 0,041), positiv kirurgisk omkredsen margin (n = 154, p 0,001), positiv kirurgisk apikale margin (n = 210, p = 0,04), og vaskulær infiltration (n = 43, p 0,001) blev alle signifikant korreleret til BFFs i univariate overlevelse analyser (tabel 1)

4

th kvartil blev brugt. afskæringsværdi. En høj ekspression af MIR-21 i tumor stromale områder var signifikant korreleret med BF (n = 170, p = 0,006, figur 3a), og CF (n = 36, p = 0,041, figur ikke vist). Der var ingen korrelation mellem høj stromale udtryk for miR-21 og PCD (n = 14, p = 0,505).

b) Patienter med Gleason score 6.

i undergruppe analyser fandt vi høj stromale udtryk af miR-21 at være signifikant associeret med øget risiko for BF i patienter med GS 6 (n = 167, p = 0,023, figur S3b), men dette blev ikke fundet for patienter med GS 7 (n = 262, p = 0,228) , Gleason grad 3 + 4 (n = 189, p = 0,0290, Gleason grad 4 + 3 (n = 73, p = 0,818), og GS . 7 (n = 36, p = 0,895) Vi fandt også høj stromale udtryk korreleret til BF for patienterne med positive omkredsen margener (n = 139, p = 0,026), men ikke for dem med gratis omkredsen marginer (n = 339, p = 0,107).

Multivariat analyse

Væsentlige klinisk-patologiske og molekylære markører fra univariat analyse blev indgået den multivariate model. Tabel 4 præsenterer de uafhængige prognostiske faktorer for BF; pT-fase (p = 0,001), Gleason bedømmelse (p = 0,021), ikke-apikal PSM (n = 286, p = 0,001), apikal PSM (n = 210, p = 0,003). For CF; Gleason bedømmelse (p = 0,013), PNI (n = 134, p = 0,028), ikke-apikal PSM (p = 0,028).

Høj stromale udtryk for miR-21 var en uafhængig prognostisk faktor for BF i patienter med Gleason score 6 (n = 167, HR 2,40, CI 95% 1,06-5,49, p = 0,037). En signifikant sammenhæng mellem høj stromale udtryk for miR-21 og BF blev også fundet i undergruppen af ​​patienter med PSM (HR 1,95, CI 95% 1,95-3,21, p = 0,008). Men for hele kohorten (n = 471), var der kun en tendens til en uafhængig forening mellem stromale ekspression af MIR-21 og BF (n = 170, p = 0,089). Høj stromale udtryk for miR-21 var ikke en uafhængig prognostisk variabel for CF (n = 36, p = 0,395).

Diskussion

I denne undersøgelse fandt vi en højere udtryk for miR- 21 i cancervæv sammenlignet med normalt prostatavæv. Ekspressionen var størst i tumor stromale områder. Høj tumor stromale ekspression af MIR-21 var en uafhængig prognostisk faktor for biokemisk svigt hos patienter med Gleason karakteren 6, men ikke klinisk svigt, sandsynligvis på grund af nogle hændelser i sidstnævnte gruppe. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse rapporterer tumor stromale ekspression af MIR-21 som en prognostisk markør for BF efter radikal prostatektomi. Derudover fandt vi også en høj stromale udtryk for at være en uafhængig markør for PSM i RP prøver.

Nylige undersøgelser har vist, at miRNA ændres væsentligt i prostatakræft, hvilket tyder på, at miRNA fungere som vigtige regulatorer af prostata carcinogenese. Adskillige undersøgelser er blevet udført for at identificere den PC-specifikke miRNA signatur, men n er opnået enighed med hensyn til miRNA rolle i udviklingen og progressionen af ​​PC [20], [21]. I en undersøgelse af Violinia et al. [22], blev totalt RNA ekstraheret fra 363 faste cancere, herunder prostatacancer og 177 normale væv. De fandt en generel opregulering af 39 miRNA, herunder miR-21, mens 6 miRNA blev nedreguleret. Disse resultater var i delaftale med en undersøgelse foretaget af Ambs et al. hvor den samlede RNA ekstraheret fra 60 mikro-dissekeret PC og 16 omgivende ikke-tumorvæv blev analyseret [23]. MIR-21 anses generelt for et onkogen, men hidtil dens rolle i PC er uklar, og rapporterne er modstridende [11], [12], [14], [20]. MIR-21 har vist sig at være forhøjet i PC3 og DU145 androgen-uafhængige cellelinjer [24]. Desuden blev MIR-21 identificeret som en androgen receptor-regulerede miRNA hvis niveau var forhøjet i PC sammenlignet med tilstødende normalt væv [12]. Hæmninger miR-21 mindske androgen-induceret PC celleproliferation, mens forhøjet udtryk for miR-21 fremmer forbedret tumorvækst og kastration modstand

i

vivo

[12]. Andre har også fundet MIR-21 opreguleret hos patienter med hormon- og kemoterapi PC [13], [15].

Vi fandt, at en høj tumor stromal ekspression af MIR-21 i tumorer med Gleason score 6 forudsagt BF. Dette er i tråd med tidligere rapporter [25]. Stromal miR-21 ekspressionsanalyse kan være et potentielt redskab til at forudsige, hvilke stærkt differentierede tumorer, der er mest tilbøjelige til at udvikle. Nylige undersøgelser har givet værdifuld indsigt i at klarlægge involment af miR-21 i tumor mikromiljø: Bullock et al. [26] viste, at opreguleret MIR-21 ekspression forekommer i cancerassocierede stromale celler, men ikke i kolorektale cancerceller. Endvidere fandt de, at ektopisk MIR-21-ekspression i fibroblaster moduleres den cytotoksiske virkning af Oxaliplatin (chemotherapheutic bruges i behandling af coloncancer), hvilket resulterede i udviklingen af ​​kræft. Bronisz et al. [27] viste, at nedregulering af mir-320 i mælkekirtel stromale fibroblaster omprogrammerer tumormikromiljøet ved aktivering af en pro-onkogen secretome, og interessant nok Yao et al. [28] rapporterede, at myofibroblastdifferentiering transdifferentiering fra progenitor fibroblaster som svar på TGF-β kan forebygges ved anvendelse af specifikke antisense inhibitorer af MIR-21. Tilsammen tyder disse data pro-metastatisk indflydelse af mRNA’er i fibroblast differentiering og fænotype, og at MIR-21 kan medieres gennem tumormikromiljøet. Men biologisk og funktionel dokumentation til støtte for disse fund, især prostata carcinomer, er begrænset.

Det er velkendt, at mindre end 3% af patienterne med Gleason score≤6 nogensinde vil fremskridt både behandlet eller ej, og at en betydelig procentdel af disse patienter fortsat undergå unødvendig behandling efter en diagnose af PC lav risiko (baseret på en PSA 10 ng /ml og trin ≤ T2a) [29], [30]. Stromal miR-21 ekspressionsanalyse kan være et potentielt redskab til at forudsige, hvilke stærkt differentierede tumorer, der er mest tilbøjelige til at udvikle. Yderligere undersøgelser at klarlægge den nøjagtige rolle miR-21 i disse meget differentierede tumorer er nødvendige. I modsætning til tidligere rapporter, fandt vi høj ekspression af miR-21 hos patienter med positive kirurgiske margener, [25]. De molekylære mekanismer for dette er ukendt.

De divergerende resultater af miR-21 i forskellige undersøgelser kan afspejle heterogenitet PC, samt forskellige studiedesign og metode. En miRNA screening af hele kohorten ville have styrket vores undersøgelse. Desuden kan kvaliteten af ​​de undersøgte (herunder håndtering) væv drastisk påvirke fortolkningen af ​​microarray data. Udover de interessante data om BF, er vores studie noget begrænset af det lave antal tilfælde med klinisk tilbagefald eller PCD. Yderligere undersøgelser af denne microRNA og de tilhørende veje kan afdække nye mekanismer for kræft progression og terapeutisk intervention.

Konklusion

Denne undersøgelse på miRNA profilering og validering i prostatakræft tilføjer yderligere bevis for miR-21 som en prognostisk markør til PC. Disse resultater indikerer, at stromale udtryk for miR-21 har en vigtig rolle i sygdomsudviklingen, men den underliggende mekanisme kræver yderligere undersøgelse.

Støtte Information

File S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0113039.s001

(ZIP)

Tak

Vi takker de deltagende laboranter ved Patologisk Institut, UNN for deres støtte og tekniske færdigheder. Specielt ønsker vi at takke Magnus Persson, Mona Pedersen og Marit Nina Nilsen, Christopher Fenton, Øystein Størkersen og Anders Angelsen.