PLoS ONE: Guggulsteron Mål røgfri tobak induceret PI3K /Akt Pathway i hoved- og halscancer Cells

Abstrakt

Baggrund

Epidemiologisk sammenslutning af hoved- og halscancer med røgfri tobak (ST) fremhæver nødt til at opklare de molekylære mekanismer involveret i udviklingen af ​​kræft, og identificere farmakologisk sikre midler til tidlig intervention og forebyggelse af recidiv. Guggulsteron (GS), et BIOSAFE nutraceutical, inhiberer PI3K /Akt pathway, der spiller en kritisk rolle i HNSCC udvikling. Men for at potentialet i GS undertrykke ST og nikotin (vigtig del af ST) induceret HNSCC forbliver uudforsket. Vi hypotese GS kan ophæve virkningen af ​​ST og nikotin på apoptose i HNSCC celler, dels ved aktivering af PI3K /Akt vej og dens downstream mål, Bax og Bad.

Metoder og Resultater

vores resultater viste ST og nikotin behandling resulterede i aktivering af PI3K, PDK1, Akt, og dens downstream proteiner – Raf, GSK3p og PS6 mens GS inducerede en tidsafhængig nedgang i aktivering af PI3K /Akt pathway. ST og nikotin behandling resulterede også i induktion af Bad og Bax fosforylering, øget sammenslutningen af ​​Bad med 14-3-3ζresulting i sin binding i cytoplasmaet i hoved- og halscancer celler, hvilket blokerer dets pro-apoptotiske funktion. Især GS forbehandling hæmmede ST /nikotin induceret aktivering af PI3K /Akt vej, og hæmmede Akt medieret fosforylering af Bax og Bad.

Konklusioner

Som konklusion, GS behandling ikke kun hæmmet spredning, men også induceret apoptose ved ophævelse af virkningerne af ST /nikotin på PI3K /Akt pathway i hoved- og halscancer celler. Disse resultater giver et rationale for at designe fremtidige undersøgelser at vurdere kemoforebyggende potentiale GS i ST /nikotin tilknyttet hoved- og halscancer

Henvisning:. Macha MA, Matta A, Chauhan SS, Siu KWM, Ralhan R (2011 ) Guggulsteron Mål røgfri tobak induceret PI3K /Akt Pathway i hoved- og halscancer Cells. PLoS ONE 6 (2): e14728. doi: 10,1371 /journal.pone.0014728

Redaktør: Madhuri Kango-Singh, University of Dayton, USA

Modtaget: Juli 24, 2010; Accepteret: December 14, 2010; Publiceret: 24 feb 2011

Copyright: © 2011 Macha et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Muzafar A . Macha er en modtager af en Senior Research Fellowship of Rådets videnskabelig og industriel forskning (CSIR), New Delhi, Indien. Ajay Matta er modtageren af ​​en MITACS Accelerate Fellowship, Ontario, Canada. Ranju Ralhan taknemmeligt anerkender støtte fra Joseph og Mildred Sonshine Center for hoved og hals Sygdomme, Alex og Simona Shnaider Laboratory of Molecular Oncology, Temmy Latner /Dynacare, og Institut for Hals-og ørelæge-Hoved og halskirurgi, Mount Sinai Hospital, University of Toronto . K.W. Michael Siu anerkender støtte fra Ontario Institute for Cancer Research (OICR), og infrastrukturelle støtte fra Ontario forskning og udvikling Challenge Fund og AB SCIEX. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hoved og hals pladecellekræft (HNSCC) er fortsat en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed på verdensplan med fem års overlevelse satser på omkring 50%, skæmmet af hyppige tilbagefald eller dannelse af sekundære primære tumorer (10-25% af tilfælde) [1], [2]. På globalt plan, brug af tobaksvarer er den største risikofaktor, med røgfri tobak (ST) forbrug er knyttet til den høje forekomst af HNSCC [3] – [5]. ST bruges i flere former, nemlig naswar, gutkha, khaini (en blanding af ST med kalk) og har eller med betel quid, blevet klassificeret som kræftfremkaldende for mennesker af International Agency for Research in Cancer (IARC) [6], [7] . Foreningen af ​​rygning med HNSCC er velkendt, men forbindelsen mellem ST brug og hoved- og halskræft er ved at opstå. I en nylig rapport, Stepanov

et al.

[8] identificerede 23 polycykliske aromatiske hydrocarboner (PAH) i ST foruden nitrosaminer og nikotin som rapporteret i tidligere undersøgelser [7]. Nikotin forbedrer proliferation, accelererer tumorvækst og inhiberer apoptose i visse typer af humane cancercellelinier og inducerer angiogenese in vivo ved langvarig aktivering af den mitogene pathways [9] – [11]. Nikotin er blevet rapporteret at inhibere apoptose induceret af opioider og genotoksisk stress induceret af etoposid, cisplatin, eller UV-bestråling i lungecancerceller [12], [13]. Desuden nikotin aktiverer PI3K /Akt pathway og hæmmer de pro-apoptotiske funktioner Bax og Bad gennem fosforylering [14], [15]. Disse resultater fik os til at undersøge, om ST (khaini) inducerer PI3K /Akt pathway aktivering i hoved- og halscancer celler.

Desuden identifikation af farmakologisk sikre kemoforebyggende midler, der kan undertrykke ST /nikotin induceret PI3K /Akt vej i HNSCC forventes at have potentiale til at forhindre ST induceret hoved og hals carcinogenese. Guggulsteron (GS), (4,17 (20) -pregnadien- 3,16-dion), en bestanddel af indisk ayurvedisk lægeplante

Commiphora mukul

er en BIOSAFE nutraceutical med antineoplastiske egenskaber [16] – [18]. GS er blevet rapporteret at inducere apoptose, undertrykke proliferation, invasion, angiogenese, metastaser og reverse lægemiddelresistens, hvilket gør det til en potentiel komplementær anticancermiddel [19] – [24]. GS binder til farnesoid X-receptor og har vist sig at modulere ekspressionen af ​​proteiner involveret i apoptose (IAP1, XIAP, Bfl-1 /A1, Bcl-2, cFLIP, survivin), celleproliferation (cyclin D1, c-Myc), angiogenese og metastase (MMP-9, COX-2, VEGF) [25]. Denne sterol udøver sine biologiske virkninger ved regulering af transkriptionsfaktorer – nuklear faktor kappa B (NFKB), STAT-3 og C /EBP alpha, og steroid receptorer – glukokortikoid receptorer og androgen receptor. Vores gruppe og andre for nylig demonstreret anticancer aktivitet af GS i HNSCC og myelom cellelinier ved hæmning af NFKB og STAT3; efterfølgende undersøgelser rapporteret lignende virkninger i andre cancer cellelinjer og i dyremodeller af tyktarmen og hudkræft [19], [24], [26].

I denne undersøgelse undersøgte vi aktiveringen af ​​PI3K /Akt vej i hoved- og halscancer celler på behandling med ST /nikotin og dets inaktivering af GS. Yderligere vi udfordrede aktivering af Akt og dens downstream mål (PS6, GSK3p og Raf), ved ST /nikotin i hoved- og halscancer celler (SCC4) ved forbehandling med GS.

Resultater

Effekt af ST og nikotin aktivere PI3K /Akt pathway i hoved- og halscancer celler

dosis og tid kinetik ST og nikotin (vanedannende komponent af tobak) behandling i hoved og hals kræft celler (SCC4 og HSC2 de ), blev bestemt ved MTT-assayet (figur 1A og 1B). Lignende kinetik iagttoges i begge cellelinier og resultaterne for SCC4 celler er vist i figur 1. Udsættelse for ST og nikotin øget celleproliferation i både hoved- og halscancer cellelinier på en dosisafhængig måde med en optimal dosis på 20 ug /ml for ST og 10 uM for nikotin. Disse optimale doser er blevet anvendt i alle efterfølgende eksperimenter. For at undersøge virkningen af ​​ST eller nikotin på Akt pathway i HNSCC celler, blev begge SCC4 og HSC2 celler behandlet med 20 ug /ml ST eller med nikotin (10 uM) for forskellige tidsintervaller eller holdes ubehandlet, og Akt aktivering (Akt phosphorylering ved Ser-473 og Ser-309) blev bestemt i de proteinekstrakter ved Western blotting. Både ST og nikotin hurtigt øget Akt fosforylering uden at påvirke de samlede Akt niveauer i både HSC2 og SCC4 celler (figur 2A og 2B henholdsvis). Disse undersøgelser viser, at ST og nikotin aktivere Akt ved doser, der kunne være fysiologisk relevant. Endvidere vores western blot analyse viste både ST og nikotin inducerede en tidsafhængig stigning i phosphorylering af både opstrøms kinaser, PI3K og PDK1 samt downstream mål, Raf, GSK3p, og PS6 i SCC4-celler (figur 2A og 2B ), der afspejlede den hurtige indtræden af ​​øget Akt phosphorylering. Lignende resultater blev observeret i både de cellelinier (SCC4 og HSC2) derfor data for kun SCC4 celler er blevet vist her.

Celler blev behandlet med (A) ST (1-500 pg /ml), ( B) nicotin (1-100 uM) i 24-96 timer. Illustration viser gennemsnittet af tre eksperimenter udført uafhængigt.

SCC4-celler (2-3 x 10

6) blev behandlet med (A) ST (20 ug /ml) eller (B) nicotin ( 10 uM), for de angivne tidsintervaller og hel-celle ekstrakter blev forberedt. Helcelleekstrakterne (60 ug protein) blev opløst på 10% SDS-PAGE, elektrooverført til en PVDF-membran og ikke-specifik binding blev blokeret med 5% fedtfri mælk natten over. Proteinekspression blev bestemt ved probing med phospho-specifikke antistoffer til Pakt (thr-309), Pakt (ser-473). pGSKβ3, pRaf, pPDK1 og Akt hjælp forøget kemiluminescens metode. Western blotting for α-tubulin blev gjort for at vise lige protein belastning.

Effekt af Guggulsteron på ST og nikotin induceret aktivering af PI3K /Akt pathway

Både ST og nikotin induceret stimulering af Akt vej, derfor undersøgte vi effekten af ​​GS på ST og nikotin induceret aktivering af Akt pathway. SCC4-celler blev behandlet med GS (50 uM) for forskellige tidsintervaller og deres proteinekstrakter blev testet for Akt aktivering. Som vist i figur 3A, GS hæmmede aktivering af Akt, opstrømskinaser PI3K, PDK1, samt de nedstrøms proteiner, Raf, GSK3p, og PS6. Dosis standardisering af PI3K /Akt inhibitor, LY294002, blev udført ved at behandle SCC4-celler med forskellige koncentrationer af inhibitoren (0,5-10 uM) i 1 time. Som vist i figur 3B, LY294002 (10 uM) fuldstændigt hæmmede ekspressionen af ​​aktiveret Akt; mens der blev observeret nogen effekt på de samlede Akt ekspressionsniveauerne. SCC4-celler blev forbehandlet med GS i 4 timer eller LY294002 (10 uM) i 60 minutter, efterfulgt af ST (20 ug /ml) i 6 timer eller nikotin (10 uM) i 4 timer. Resultaterne indikerer, at GS samt LY294002 blokeret ST og nikotin-fremkaldt Akt pathway aktivering (figur 3C), selvom ingen virkning blev observeret på ekspressionen af ​​total Akt og GSK3p på disse tidspunkter. Salg

SCC4-celler ( 2-3 × 10

6) blev behandlet med (A) GS (50 uM) for de angivne tidsintervaller og /eller (B) med LY294002 i forskellige koncentrationer i 1 time. (C) SCC4-celler (2-3 x 10

6) blev forbehandlet med 50 um GS i 4 timer eller med LY294002 (10 uM) i 1 time og stimuleret med ST (20 ug /ml) i 6 timer eller med nikotin (10 uM) i 4 timer. Tres mikrogram proteiner fra helcelle-ekstrakter blev opløst på 10% SDS-PAGE, elektrooverført til en PVDF-membran efterfulgt af blokering med 5% fedtfri mælk natten over. Proteinekspression blev bestemt ved probing med specifikke antistoffer ved hjælp forøget kemiluminescens metode.

Guggulsteron og PI3K-specifik inhibitor LY294002 blok ST og nikotin induceret Bad og Bax fosforylering

Både ST og nikotin potent stimulerede serin-phosphorylering af Bax og Bad på en tidsafhængig måde (figur 4A og 4B), hvilket resulterer i ophævelse af deres pro-apoptotiske funktion. For at demonstrere en funktionel rolle af Akt som den fysiologiske ST og nikotin aktiveret Bax og Bad kinase, LY294002, en PI3K specifik inhibitor, der kan blokere PI3K /Akt-signalvejen, blev anvendt. SCC4-celler blev forbehandlet med LY294002 (10 uM) i 60 minutter eller 50 pm GS i 4 timer efterfulgt af ST (20 ug /ml) i 6 timer eller med nikotin (10 uM) i 4 timer. GS samt LY294002 blokeret ST og nikotin induceret Bax og Bad phosphorylering (figur 4A og 4B). blev ikke observeret nogen effekt på ekspressionen af ​​total Bad og Bax på disse tidspunkter. Disse resultater antyder, at inhibering af ST og nikotin induceret Bax og Bad phosphorylering af GS kan genoprette den pro-apoptotiske funktion af disse molekyler.

SCC4-celler (2-3 x 10

6) blev behandlet med ( A) ST (20 ug /ml) eller (B) Nikotin (10 uM) for de angivne tidsintervaller. SCC4-celler blev forbehandlet med LY294002 (10 uM) i 60 minutter, eller 50 um GS i 4 timer, efterfulgt af ST (20 ug /ml) i 4 timer, eller med nikotin (10 uM) i 4 timer, og hele -celle ekstrakter blev forberedt. Tres mikrogram proteiner fra helcelle-ekstrakter blev opløst på 10% SDS-PAGE, elektrooverført til en PVDF-membran efterfulgt af blokering med 5% fedtfri mælk natten over. Proteinekspression blev bestemt ved anvendelse forøget kemiluminescens fremgangsmåde og probet med antistoffer mod pBAD og PBAX. Blottene blev strippet og testet igen for Bax og dårlige proteiner.

Akt er co-lokaliseret med Bax i cytoplasma

For at vurdere en potentiel direkte rolle for Akt som en fysiologisk Bax kinase, sub-cellulære distribution af Akt og Bax blev bedømt ved immunfluorescensfarvning. Bax blev primært co-lokaliseret med Akt i cytoplasmaet i SCC4-celler (figur 5A) tyder på, at både ST og nikotin aktiveret Akt har potentiale til direkte phosphorylere og inaktivere Bax i SCC4-celler.

Phosphorylering af Bax og Bad resulterer i fastholdelse af disse proteiner i cytosol og manglende målrette mitokondrier

Vores resultater viste, at ST og nikotin kan fremkalde Bax (Ser-184) og Bad (ser-136) phosphorylering og phosphorylering på disse steder resulterede i inaktivering af pro-apoptotiske funktion Bax og Bad. Det er velkendt, at den pro-apoptotiske aktivitet af Bax og Bad er afhængig af cytosoliske eller mitokondrisk lokalisering. For at teste, om phosphorylering af Bax og dårlige effekter dets sub-cellulære lokalisering blev SCC4-celler holdes ubehandlet eller behandlet med GS (50 uM) i 4 timer, ST (20 ug /ml) i 6 timer og nikotin (10 uM) i 4 h. Sub-cellulære fraktioneringer blev udført for at isolere mitokondrier og cytosol som beskrevet under materialer og metoder. I ubehandlede SCC4-celler, blev størstedelen af ​​Bax og Bad fundet i cytosolen, og kun en lille mængde af disse proteiner, blev lokaliseret i mitochondrierne (figur 5B). I GS blev observeret flertal behandlede celler af disse proteiner i den mitokondriske fraktion. I modsætning hertil både ST og nikotin behandlede celler, Bax og Bad blev overvejende observeret i cytosolen (figur 5B).

Navnlig forbehandling af SCC4-celler med GS (50 uM) i 4 timer, efterfulgt ved ST (20 ug /ml) behandling i 6 timer eller nikotin (10 uM) i 4 timer, viste et skift i lokalisering af Bax og Bad og størstedelen af ​​disse proteiner blev observeret i den mitokondriske fraktion (figur 5B). For at bekræfte renheden af ​​de subcellulære fraktioner opnået, succinatdehydrogenase, et protein eksklusivt til mitochondrier, blev vurderet ved Western blotting. Succinat-dehydrogenase, blev kun detekteret i den mitokondriske fraktion og ikke i cytosolen (figur 5B), hvilket bekræftede renheden af ​​de mitochondriske og cytosoliske fraktioner. β-actin blev anvendt som kontrol for at sikre lige protein loading i alle baner.

SCC4-celler (5 x 10

3) blev udpladet på dækglas og inkuberet med et muse-antistof mod humant Bax og en kaninantistof mod human Akt antistoffer. Alexa flour®594 -konjugeret anti-kanin (rød) og fluorescein isothiocyanat-konjugeret (grøn) anti-muse sekundære antistoffer blev anvendt til at visualisere Akt (rød) og Bax (grøn) lokaliseringsmønstre bruger fluorescerende mikroskop. Panel (i) DAPI farvede kerner i blå farve; (Ii) cytoplasmatisk ekspression af Bax; (Iii) cytoplasmatisk ekspression af Akt protein; og (iv) fusioneret mikrofotografi (ii) og (iii) viser co-lokalisering af Bax og Akt. (B) Phosphorylering af Bax på (Ser-184) og Bad (Ser-136) resulterer i fastholdelse af Bax og Bad i cytosol. SCC4-celler blev holdt ubehandlet eller behandlet med 50 pM GS i 4 timer, ST (20 ug /ml) i 6 timer, 10 uM nikotin i 4 timer. SCC4-celler blev forbehandlet med 50 um GS i 4 timer, efterfulgt af ST i 6 h eller med nikotin i 4 timer. Cytoplasmatiske (C) og mitochondrial (M) ekstrakter blev fremstillet som beskrevet i materialer og fremgangsmåder og separeret på 10% SDS-PAGE. Proteiner blev derefter elektro-overført på PVDF-membran efterfulgt af blokering med 5% fedtfri mælk natten over. Blots blev inkuberet med specifikke antistoffer mod Bax og Bad. Proteinekspression blev bestemt ved anvendelse forøget kemiluminescens-metoden. Renheden af ​​de subcellulære fraktioner opnået blev bestemt under anvendelse western blot for mitokondrie-protein, succinat-dehydrogenase. β-actin blev anvendt som en belastning kontrol.

ST og nikotin induceret Bad fosforylering forbedrer samspillet med 14-3-3ζ

Bad fosforylering (ser-136) fremmer dens translokation fra mitokondrier i cytosol og interaktion med stilladset protein 14-3-3. At vurdere, om ST eller nikotin påvirker Bad forening blev SCC4-celler behandlet med ST (20 ug /ml) eller nikotin (10 uM) for forskellige tidsintervaller. Co-immunfældning af 14-3-3ζ og Bad viste en tidsafhængig stigning i bundet pBAD i immunkomplekserne (IP) af 14-3-3ζ indikerer associering mellem 14-3-3ζ og pBAD (figur 6A og 6B), på behandling med ST og nikotin henholdsvis. Lignende resultater blev observeret i omvendte immunopræcipitationsanalyser, blev western blotting gjort for 14-3-3ζ i immunkomplekser opnås ved anvendelse af pBAD-specifikt antistof, hvilket bekræfter interaktionen af ​​14-3-3ζ med pBAD (figur 6A og 6B). Disse resultater antyder ST og nikotin induceret Bad phosphorylering resulterede i sekvestrering Bad i cytoplasmaet, funktionelt blokere dens pro-apoptotiske funktion.

SCC4 blev behandlet med (A) ST (20 ug /ml) eller (B) med nikotin (10 uM) for forskellige tidsintervaller og immunopræcipitationsanalyser blev udført ved anvendelse af hele cellelysater og analyseret ved western blotting som beskrevet i Materialer og Metoder. 14-3-3ζ blev immunpræcipiteret under anvendelse af specifikt antistof, og den bundne pBAD protein co-udfældet med 14-3-3ζ blev bestemt ved western blot-analyse. Reverse immunopræcipitationsanalyser blev udført, hvor pBAD blev immunopræcipiteret, efterfulgt af western blotting-analyse af 14-3-3ζ anvendelse af et specifikt antistof mod dette protein. (C) Figur viser den hypotetiske model for inhibering af ST /nikotin induceret aktivering af PI3K /Akt pathway af GS. Vores resultater viste behandling med ST og /eller nikotin aktiverer Akt (phosphoryleret ved Ser-473 og Ser-309), hvilket resulterer i phosphorylering af dens downstream mål Raf, GSK3p, og PS6, hvorimod GS behandling inhiberer aktivering af Akt pathway. Interessant, forbehandling af hoved- og halscancer celler med GS hæmmer aktivering af Akt og dens downstream mål (Raf, GSK3p, og PS6) ved udsættelse for ST /nikotin. GS forbehandling også frigør Bad fra hæmmende virkning af 14-3-3ζ derved aktivere indre vej af apoptose. Således er vores resultater viste GS som en potentiel terapeutisk agent for ST-induceret hoved og hals carcinogenese.

Discussion

Tobak i forskellige former er et af de vigtigste ætiologiske faktorer for udvikling og progression af HNSCC. Afvigende ekspression af gener involveret i cellevækst, overlevelse, angiogenese, invasion og metastase i ST associeret hoved og hals carcinogenese er blevet rapporteret af vores gruppe og andre [27] – [31]. I dette studie demonstrerede vi aktivering af Akt i HNSCC celler behandlet med ST /nikotin, som fremgår af en vedvarende phosphorylering af Akt i serin 473 og threonin 308, samt dens downstream substrater (PS6, GSK3p, pRaf), i en tidsafhængig måde. Både ST og nikotin også inducerede phosphorylering af opstrømskinase PDK1 (Ser241), og p85-underenheden af ​​en anden opstrømskinase, PI3K i SCC4-celler. Disse observationer støttes af tidligere rapporter, som viser aktivering af PI3K /Akt i dyrkede corticale neuroner, normal human bronchial og små luftvejs-epitelceller i respons på nicotin behandling [11], [32] – [34]. Endvidere viste vi begge ST og nikotin aktiveret Akt, induceret Bad (Ser136) og Bax phosphorylering (Ser184), hvilket resulterer i cytoplasmatisk tilbageholdelse af disse proteiner. Men behandling med LY294002, en PI3K /Akt inhibitor, kraftigt hæmmet ST og nikotin induceret fosforylering af Bad (Ser-136) og Bax (Ser-184), hvilket resulterer i mitokondrie relocalization af disse proteiner, yderligere styrke vores observation, at ST og nikotin induceret phosphorylering af Bad (Ser-136) og Bax (Ser-184) ved aktivering af PI3K /Akt. Interessant, både ST og nikotin induceret fosforylering af Bad (Ser-136) i SCC4 celler øget sin tilknytning til 14-3-3ζ som afsløret ved co-IP-analyser. Dette resulterer i binding af Bad i cytoplasmaet, hvilket forhindrer den indre vej af apoptose. Tidligere rapporter har vist fosforylering enten Ser112 eller Ser136 letter dannelsen af ​​et kompleks mellem Bad og 14-3-3s i cytosolen, blokere deres interaktion med Bcl2 /Bcl-xl i mitokondrierne [35], [36].

for nylig demonstrerede vi overekspression af PI Synthase, PI3-K og cyklin D1 i ST behandlede celler fra orale læsioner og kræft i mundhulen [37]. Endvidere analyserer kliniske prøver fra orale leukoplakic læsioner uden dysplasi, med dysplasi og mundtlige planocellulært karcinom (OSCCs), vi gav første tegn på øget ekspression af PI Synthase i tidlige stadier af oral præcancer og kræft og dets overensstemmelse med tumor dedifferentiation og tobak forbrug [37]. Her i vi udvidet disse resultater for at demonstrere GS kunne hæmme induktion af PI3K /Akt af ST og nikotin.

Således hæmme induktion af Akt aktivitet ved ST tobak komponenter kan være en værdifuld tilgang til at afbøde virkningerne af tobak i forbrugerne i risiko for udvikling af HNSCC, og /eller i HNSCC patienter, der fortsætter med at ryge eller bruge ST-produkter. I denne henseende observerede vi, at GS undertrykt phosphoryleringen af ​​Akt (Ser473 og Thr308), PDK1 (Ser241) og p85-underenheden af ​​PI3K, hvilket fører til nedsat phosphorylering af GSK3p, pRaf, PS6, downstream mål for Akt. Især vores undersøgelse viste, at GS ikke kun hæmmede konstitutive PI3K /Akt vej, men dens forbehandling ophævede både ST og nikotin induceret aktivering af PI3K /Akt vej. ST og nikotin ophævede den pro-apoptotiske virkninger af Bax /Bad af phosphorylering og sekvestrering i cytoplasmaet, men GS forbehandling inhiberede virkningen af ​​ST og nikotin, målretning Bax og Bad til mitochondrier, inducere apoptose. Men virkningen af ​​GS er ikke specifik og begrænset til kun hoved- og halscancer celler. Vi og andre har vist anti-cancer effekter af GS i en række cancer celletyper nemlig hoved og hals; leukæmi, multipel myelom, lunge, melanom, ovarie, gut afledt adenocarcinom, colorectal, colon, hud, prostata, spiserøret, og bryst [19], [21] – [24], [38] – [43]

.

som konklusion vores undersøgelse viste, at både ST og nikotin fremme overlevelsen af ​​humane celler med hoved- og halscancer SCC4, ved at inaktivere de pro-apoptotiske funktioner Bax og Bad via sin phosphorylering og binding disse proteiner i cytoplasmaet. GS ikke kun hæmmer konstitutivt aktiv PI3K /Akt pathway, men også inhiberer ST og nikotin induceret aktivering af denne pathway og fremmer apoptose signaler i disse celler (figur 6C). Derfor kan GS blive udforsket som et kemoforebyggende middel til ST induceret hoved og hals carcinogenese.

Materialer og metoder

Antistoffer og reagenser

z-Guggulsteron (GS), 3 – (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT), propidiumiodid (PI) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Muse monoklonalt antistof mod Bax (sc-7480); kanin polyklonalt antistof mod 14-3-3ζ (sc-1019), pPI3K p85 antistof (Tyr-508, SC-12929R) blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA. Kanin monoklonalt antistof mod phospho-Akt (Ser 473, cat-9271), phospho-Akt (Thr 308, cat-9275), Akt (cat-9272), phospho-GSK-3β (Ser 9, cat-9336), phospho -Raf (Ser 259, cat-9421), phospho-PDK1 (Ser 241, cat-3061), PI3-kinase inhibitor LY294002 (cat-9901) blev alle købt fra Cell Signaling Technology. For co-lokalisering undersøgelser, gede-anti-kanin-Alexa Fluor® 594 (kat ingen A-11012) blev købt fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Ged anti-mus FITC (kat nr. F2012) blev indkøbt fra Sigma (St. Louis, MO). Protein A-Sepharose-perler blev opnået fra GE Healthcare Biosciences, (Uppsala, Sverige).

Cellekultur

menneskelige hoved og hals pladecarcinom cellelinjer, SCC4 blev opnået fra American Type Culture Collection ( ATCC) og HSC2 (JCRB0622) blev opnået fra Health Science Research Resources Bank (HSRRB), Japan [44], [45]. Begge disse hoved- og halscancer cellelinier er kendt at huse mutant p53. SCC4 celler har en punktmutation ved kodon 51 CCC til TCC og HSC2 celler har en mutation i intron 6 [44], [45]. HSC-2 celler harbour muteret PIK3CA (H1047R) [46]. Både hoved og hals cancercellelinier (SCC4 og HSC2) blev dyrket i monolagskulturer i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) (Sigma, St. Louis, MO) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Sigma), 1 mM L-glutamin, 1X natriumpyruvat, 1X vitaminer, 1 mM minimum essentielt medium (MEM), 100 ug /ml streptomycin og 100 U /ml penicillin i en befugtet inkubator (5% carbon-dioxid, 95% luft) ved 37 ° C som tidligere beskrevet [47].

Udarbejdelse af røgfri tobak Ekstrakt (ST)

Almindeligt anvendte mærke af cured tobak (Khaini) blev købt fra det lokale marked. 25 g tobak var fint pulveriseret og homogeniseret i 225 ml destilleret vand. Blandingen omrøres på en magnetisk omrører i to timer og fik derefter lov at henstå i 24 timer ved 37 ° C. Derefter Supernatanten blev opsamlet efter centrifugering ved 5000 g i 20 minutter. Ekstrakten blev steriliseret ved passage gennem et 0,22 um filter og opbevaret ved 4 ° C indtil brug. Den endelige koncentration af tobak i vandig ekstrakt blev anslået til at være 2,7 g% [48].

cytotoksicitetsanalyse

hoved- og halscancer celler (5 x 10

3 /brønd) var udpladet i en 96-brønds plade i 24 timer. Celler blev inkuberet in triplo i nærvær af medium indeholdende ST /nikotin eller 0,02% DMSO, der tjente som en vehikelkontrol i et endeligt volumen på 100 pi i 24-96 timer ved 37 ° C. Celledød blev målt ved tilsætning 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) ved 37 ° C i 3-4 timer. Formazankrystallerne blev opløst i 100 pi dimethylsulfoxid (DMSO) og optisk densitet (OD) blev målt ved en bølgelængde på 570 nm. Den procentvise celledød blev beregnet individuelt for hver dosis som følger:. (OD

kontrol-OD

behandlet /OD

kontrol) × 100, som tidligere beskrevet [49]

Western blotting og Co-immunopræcipitation (Co-IP) assay

Co-immunopræcipitation (Co-IP) assays og WB blev udført som beskrevet af os tidligere [39]. Hel-cellelysater blev fremstillet ud fra GS (50 uM) eller nikotin (10 uM) behandlede SCC4-celler og proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse af Bradford-reagens (Sigma) og ens mængder af proteiner (50 ug /bane) blev opløst på 12% natrium dodecylsulfat (SDS) -polyacrylamid gel. Proteinerne blev derefter elektro-overført til polyvinylidenedifluoride (PVDF) membran. Efter blokering med 5% fedtfri mælk i Tris-bufret saltvand (TBS, 0,1 M, pH = 7,4) blev blots inkuberet med specifikke antistoffer ifølge producentens anbefalede protokol ved 4 ° C natten over. Protein overflod af α-tubulin (Santa Cruz Biotechnology, CA) tjente som kontrol for protein lastning i hver bane. Membraner blev inkuberet med HRP-konjugeret sekundære antistoffer, (DAKO Cytomation, Glostrup, Danmark), fortyndet i en passende fortynding i 1% BSA, i 2 timer ved stuetemperatur. Efter hvert trin blev blots vasket tre gange med Tween (0,1%) – Tris-buffer saltvand (TTBS). Proteinbånd blev påvist ved den forøget kemiluminescens-metoden (ECL, Santa Cruz Biotechnology, CA) på XO-MAT film. Co-IP-analyser blev udført som beskrevet tidligere

Sub-cellulær fraktionering:. Isolering af cytoplasma og mitokondrier

Hoved og hals kræftceller (2 × 10

7) blev behandlet, høstet og vasket en gang med kold 1X PBS og resuspenderet i isotonisk mitokondrie-buffer (210 mM mannitol, 70 mM saccharose, 1 mM EGTA, 10 mM Hepes, pH 7,5, 0,1% BSA) indeholdende protease inhibitor cocktail. De resuspenderede celler blev homogeniseret med en polytron homogenisator i drift i fire byger af 10 s hver ved en indstilling på 5 og derefter centrifugeret ved 2000 g i 3 min for at pelletere kernerne og ubrudte celler. Supernatanten blev centrifugeret ved 13.000 g i 10 minutter til pelletering mitokondrier som beskrevet [50]. Supernatanten blev yderligere centrifugeret ved 15.000 g til pelletering lette membraner. Den resulterende supernatant indeholdt cytosoliske fraktioner. Mitokondrierne blev vasket med mitokondrie puffer to gange, resuspenderet med 1% Nonidet P-40 lysisbuffer, vugget i 60 min, og derefter centrifugeret ved 13.000 g i 10 minutter ved 4 ° C. Supernatanten indeholdende mitokondrielle proteiner blev opsamlet. Protein (100 pg) fra hver fraktion blev underkastet 12% SDS-PAGE og analyseret ved Western blot-analyse under anvendelse af anti-cytochrom c-antistof. Renheden af ​​fraktionerne blev bekræftet ved at vurdere lokalisering af fraktion-specifikke proteiner, herunder succinatdehydrogenase for mitokondrier.

co-lokalisering undersøgelser af Akt og Bax i orale cancerceller ved anvendelse af konfokal laser scanning mikroskopi

hoved og hals cancerceller, SCC4 og HSC2, blev dyrket på dækglas i DMEM medium suppleret med 10% FBS ved 37 ° C og forarbejdet til konfokal laser scanning mikroskopi som beskrevet af os tidligere [51]. Celler blev skyllet i Dulbeccos PBS (DPBS), fikseret i methanol i 5 minutter ved -20 ° C og inkuberet med specifikke primære antistoffer, monoklonalt muse-anti-Bax og kanin monoklonalt anti-Akt antistof, inkuberet som en cocktail ved 4 ° C natten . Efter skylning i phosphatbuffer saline- 0,1% Tween (PBST, 1X) dækglassene inkuberet med anti-mus FITC konjugeret /anti-kanin Alexa flour®594 konjugeret sekundært antistof i 45 minutter ved 37 ° C i mørke. Dækglas blev vasket og modfarvet med DAPI i 30 sek. En mus antistof mod humant Bax, et kanin-antistof mod human Akt, og fluoresceinisothiocyanat-konjugeret anti-muse (grøn) eller rhodamin-konjugeret anti-kanin (rød) sekundære antistoffer blev anvendt, således at celler kunne farves samtidigt uden krydsreaktion . I negative kontroller blev de primære antistoffer erstattes med ikke-immunt muse-IgG af samme isotype at sikre specificitet (data ikke vist). Derefter blev objektglassene skyllet og monteret i Fluorescensmonteringsmedium og undersøgt med Lieca TCS SP2 konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM).