PLoS ONE: Sekretion af Novel SEL1L Endogen Varianter fremmes af ER Stress /UPR via endosomer og Shed blærer i Human Cancer Cells

Abstrakt

Vi beskriver her to nye endogene varianter af den menneskelige endoplasmatiske reticulum (ER) fragt receptor SEL1LA, betegnet p38 og P28. Biokemiske og RNA-interferens studier i tumorigene og ikke-tumorigene celler indikerer, at p38 og P28 er N-terminalen, ER-anchorless og mere stabil i forhold til den kanoniske transmembrane SEL1LA. P38 udtrykkes og konstitutivt secerneres, med stigning efter ER stress, i KMS11 myelom linie og i brystkræft linjer MCF7 og SKBR3, men ikke i den ikke-tumorigene brystepithelceller MCF10A linje. P28 detekteres kun i dårligt differentieret SKBR3 cellelinje, hvor det udskilles efter ER stress. I overensstemmelse med tilstedeværelsen af ​​p38 og P28 i dyrkningsmedier, morfologiske studier af SKBR3 og KMS11 celler detektere N-terminale SEL1L immunmærkning i sekretoriske /nedbrydende rum og ekstracellulært frigivne membranvesikler. Vores resultater tyder på, at de to nye SEL1L varianter er engageret i endosomale handel og sekretion via vesikler, som kan bidrage til at lindre ER stress i tumorigene celler. P38 og P28 kunne derfor være relevant som diagnostiske markører og /eller terapeutiske mål i kræft

Henvisning:. Cattaneo M, Lotti LV, Martino S, Alessio M, Conti A, Bachi A, et al. (2011) Sekretion af Novel SEL1L Endogen Varianter fremmes af ER Stress /UPR via endosomer og Shed blærer i humane cancerceller. PLoS ONE 6 (2): e17206. doi: 10,1371 /journal.pone.0017206

Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: 26 oktober, 2010; Accepteret 22. januar 2011; Publiceret: 17 feb 2011

Copyright: © 2011 Cattaneo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra MIUR-FIRB nRBIP064CRT Ministero Università e Ricerca (MIUR), og MAPLOMBARDIA, Grant 7/193 ar 3 til IB, MIUR 60% tilskud fra universitetet La Sapienza til LVL, MIUR 60% tilskud 2008-2010 fra G . d’Annunzio University til RMC, og ved en 2009 bevilling fra Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) til RMC. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Flere homeostatiske mekanismer, der styrer protein foldning og samling og fremme afsætningen af ​​defekte proteiner operere i forskellige cellulære rum til at yde beskyttelse fra endogene proteotoxic stress [1] – [4]. Det endoplasmatiske reticulum (ER) er foldningen og samling site for residente strukturelle proteiner og enzymer, såvel som for sekretorisk og plasmamembranproteiner [5]. Denne bemærkelsesværdige arbejdsbyrde administreres af effektive og high-fidelity proteinfoldning og fejlfolde-korrektion systemer, baseret på ATP-afhængige chaperoner og disulfid isomeraser, parallelt med kvalitet kontrolmekanismer, der tillader Golgi transit kun til korrekt foldede proteiner [6]. Endvidere er clearance af afvigende proteiner tilbageholdes i ER medieret gennem ER-associeret nedbrydning (ERAD) pathway [7], en multi-trins proces, der kræver anerkendelse af defekte proteiner, retro-translokation til den cytosoliske side af ER-membranen, ubiquitinering og nedbrydning af 26S proteasomet [8].

Ikke desto mindre kan det cellulære protein-foldning kapacitet og ERAD pathway være svækket og /eller overbelastet af en række patologiske tilstande, der forstyrrer energi og calcium homeostase, stigning sekretorisk proteinsyntese og /eller forstyrre proteinglycosylering og disulfidbindingsdannelse [6], [9]. I sådanne tilfælde intralumenal akkumulering af ufoldede /malfolded proteiner bestemmer ER stress, som igen aktiverer en kompleks kaskade af overlevelse signalveje, kollektivt betegnet udfoldet protein reaktion (UPR). Det sigter mod at lindre ER stress ved at dæmpe hastigheden af ​​proteinsyntese og ved opregulering af protein folde enzymer, den ERAD maskiner og den sekretoriske kapacitet [6], [10], [11]. Hvis homeostase ikke kan genoprettes, UPR-aktiverede machineries kan udløse død /ældning programmer [12].

Det er mere tydeligt, at UPR har en stor rolle i cancer, hvor det er nødvendigt for at opretholde den maligne fænotype og at udvikle resistens over for kemoterapi [13]. Faktisk skal kræftceller tilpasse sig næringsstof sult og hypoxi, som påvirker cellulær redox status og tilgængeligheden af ​​energi fra ATP hydrolyse. Dette forventes at gå på kompromis deres protein folde kapacitet, disponerer til ER stress [14] – [16]. Derfor opregulering af ERAD-UPR veje kan bidrage væsentligt til de komplekse cellulære tilpasninger, der er nødvendige for kræft progression [17], [18]. I denne forbindelse er det kendt, at mange ER-resident proteiner dereguleret, posttranslationelt modificeret, unormalt secerneret og /eller celleoverflade re-lokaliseret i forskellige cancertyper [13], [19] – [21].

mangesidede ERAD gen

SEL1L

(sel-1 suppressor af lin-12,

C.elegans

-lignende) koder for mindst tre forskellige protein isoformer,

dvs.

, den kanoniske eR-resident SEL1LA, en last receptor, der associerer med E3 ubiquitin-protein-ligase HRD1 [22] – [25], og den mindre, for nylig klonet SEL1LB og -C, der mangler den C-terminale SEL1LA membran- udspændende region for indsættelse i ER [26]. Adskillige rapporter har vist, at SEL1L proteinekspression varierer i humane tumorer i forhold til matchede normale væv, hvilket antyder en involvering i cancer progression [27] – [32].

Vi rapporterer her identifikationen, karakteriseringen og subcellulære lokaliseringer af to nye anchorless endogene SEL1L varianter, p38 og P28, studerede i brystkræft cellelinier SKBR3 og MCF7, den myelomatose linje KMS11 og ikke-tumorigene linjer MCF10A (bryst) og 293FT (embryo nyre). Vi fandt, at:

i

p38 og P28 kodes af 5′-enden af ​​den

SEL1L

genet;.

ii

. p38 opreguleres og konstitutivt secerneres i cancercellerne, forskelligt fra den ikke-tumorigen MCF10A linje; .

iii

P28 udtrykkes kun i dårligt differentierede SKBR3 brystkræft linje; .

iv

ER stress /UPR kraftigt øge p38 sekretion i kræftcellerne;

v

. N-terminale SEL1L er til stede i sekretoriske og nedbrydende rum i SKBR3 og KMS11 celler, og i vesikler frigives i det ekstracellulære rum. Samlet set biokemiske og morfologiske beviser understøtter det synspunkt, at SEL1L p38 og P28 er impliceret i veje forbinder ER stress /UPR til endosomal menneskehandel og at sekretion via ekstracellulært-kaste vesikler. Endvidere ekspressionen af ​​p38 og P28 og frigivelsen i dyrkningsmediet opreguleres i tumorigen relativt til ikke-tumorigene celler, hvilket antyder cancer-relaterede funktioner.

Materialer og metoder Salg

Cellelinier, kultur betingelser, transfektioner

Humant myelomatose KMS11, brystcancer MCF7, SKBR3, MDAMB453, lymfom Namalwa, livmoderhalskræft HeLa og glioblastoma G144, G166, G179 og celler blev holdt i RPMI indeholdende 10% føtalt bovint serum (Euroclone, Celbio, Pero, Italien). Humane embryo 293 FT nyreceller blev dyrket i DMEM indeholdende 10% føtalt bovint serum (Euroclone, Celbio, Pero, Italien). Ikke-tumorigene bryst MCF10A celler [33] blev holdt i MEBM (Lonza, Treviglio, Italien) suppleret med EGF, 20 ng /ml; bFGF, 20 ng /ml; insulin, 10 pg /ml; og hydrocortison 0,5 ug /ml. Ikke-tumorigene humane føtale hjerne CB660 celler, opnået fra Prof. Austin Smith (Cambridge, UK), blev opretholdt i human neural stamcelle medium på laminin-overtrukne skåle. Cellerne blev kortvarigt transficeret med de angivne plasmider og siRNA’erne ved Lipofectamine 2000 (Invitrogen, S.Giuliano M.se, Italien) og høstet efter den angivne tid. Celler blev behandlet med DTT (2 mM) i 3 timer, MG132 (10 uM) i 3 eller 22 timer, cycloheximid (200 ug /ml) i 3, 6, 18 timer, som angivet.

Konstruerer

Tagged TPD52 isoform 1 konstruktioner blev genereret ved kloning af fuldlængde TPD52 isoform 1-kodende sekvens, fusioneret med en myc eller GFP tag ved 3 ‘enden, ind pCDNA3.1myc-Hys (-) a eller peGFPN3 vektorer henholdsvis (Invitrogen, S. Giuliano M.se, Italien). Myc-tagget

SEL1LB

konstruktioner blev beskrevet tidligere [26].

RT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRI-reagens-opløsning (Applied Biosystems, Monza Italien) . RNA blev revers-transkriberet med SuperScript TM II revers transkriptase (Invitrogen, S. Giuliano M.se, Italien) ifølge producentens instruktioner. Semi-kvantitativ PCR-amplifikationer blev udført med 2 pi RT produkt pr reaktion og 0,15 enheder af Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen, S. Giuliano M.se, Italien), ved anvendelse af en Mastercycler instrument (Eppendorf, Milano, Italien). PCR-betingelser for alle forsøgene her beskrevne var: denaturering ved 95 ° C i 3 minutter, efterfulgt af 22 cyklusser ved 95 ° C i 30 sekunder, og derefter ved 60 ° C i 72 sekunder. Følgende specifikke primere blev anvendt:

SEL1LA

: forstand: 5′-ctcgctaacaggaggctcagtagtac-3 ‘; antisense: 5’-gccactggcatgcatctgagc-3 ‘

HRD

1: sense: 5′-ggccagggcaatgttccgc-3′; antisense: 5′-gtccattgcctggagctcc-3 ‘

BIP

: forstand:. 5′-tgcagcaggacatcaagttc-3′; antisense: 5′-cgctggtcaaagtcttctcc-3 ‘

ATF6

: forstand: 5′-ctgatggctgttcaatacac-3′; antisense: 5′-aatgactcagggatggtgct-3 ‘

CHOP

: forstand: 5′-gatggcagctgagtcattgc-3′; antisense: 5′-atgcttggtgcagattcacc-3 ‘

XBP-1

: forstand: 5′-ccttgtagttgagaaccagg-3; antisense: 5′-ggggcttggtatatatgtgg-3 ‘

GADD45β

: forstand: 5′-ggaagagctcgtggcgtgcg-3′; antisense: 5′-gtctcgggcctcggtggtgc-3 ‘

SEL1LB

: forstand: 5′-ccggccccgagaggaggatgcgggtc-3′; antisense: 5′-ggggaaacatagataccatg-3 ‘

SEL1LC

: forstand: 5′-ccggccccgagaggaggatgcgggtc-3′; antisense: 5′-ggggcaatcagccaaactaatca-3 ‘

HPRT

: forstand: 5′-aattatggacaggactgaacgtc-3′ antisense: 5′-cgtggggtccttttcaccagcaag-3 ‘

Western blotting, immunopræcipitation, analyse af kultursupernatanter, N-glycosidase F og endoglycosidase H fordøjelse

Monoklonalt SEL1L antistof blev rejst mod det N-terminale peptid af humant SEL1L [34]. Affinitetsrenset polyklonalt antistof til SEL1L N-terminus blev venligst stillet til rådighed af Dr. H. L. Ploegh [35]. Affinitetsoprenset polyklonalt C-terminale SEL1L antistof blev fremstillet mod et bakterielt udtrykt rekombinant fragment koder for aminosyrerne 575-738 af humant SEL1L (Primm, Milano, Italien). Monoklonalt anti-vinculin og anti-myc antistoffer blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, Milan, Italien). Polyklonalt anti-TPD52 blev venligst stillet til rådighed af professor J. Byrne (University of Sydney, Sydney, NSW, Australien). Celler blev lyseret i 10 mM Tris-HCI (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1% NP40, indeholdende proteaseinhibitorer (Pierce, Celbio, Pero, Italien). Proteinkoncentrationer blev bestemt ved Bradford-assay; prøver blev opløst på SDS-polyacrylamidgeler, blottet på PVDF-membraner, probet med specifikke antistoffer og fremkaldt med ECL (Genespin, Milano, Italien). For immunopræcipitation cellelysater blev præ-blokerede og inkuberet med antistoffer immobiliseret på protein G-sepharose (Invitrogen S. Giuliano M.se, Italien). Immunpræcipitater blev vasket to gange med 10 mM Tris-HCI pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,25% NP40, en gang med 5 mM Tris-HCI og elueret med prøvebuffer før gelelektroforese. Til analyse af supernatanter celler blev vasket og inkuberet med OPTIMEM (Invitrogen, S. Giuliano M.se, Italien) i 16 timer. Supernatanter blev udvundet, centrifugeret, udfældet med 10% TCA, resuspenderet med 1 M Tris-HCI pH 7,4 og opløst på SDS-polyacrylamidgeler. Alle Western blots blev udført ved hjælp af X-BLOT Afdeling (www.isenet.it).

For fordøjelse af

N

-glycosidase F (PNGase F) eller endoglycosidase H (endo H), cellelysater blev denatureret ved opvarmning til 95 ° C i 0,05% SDS, 0,1% mercaptoethanol i 10 min og derefter inkuberet ved 37 ° C i 1 time med eller uden PNGase F eller endo H (New England Biolabs, Celbio, Pero, Italien) , i overensstemmelse med leverandørens anvisninger.

immunfluorescensmikroskopi

SKBR3-celler, dyrket på dækglas, ubehandlede eller behandlet med DTT som beskrevet ovenfor, blev fikseret med 4% paraformaldehyd i PBS i 30 minutter, vasket i 0,1 M glycin i 20 minutter, og permeabiliseret i 0,1% Triton X-100 for yderligere 5 min. For at undersøge de subcellulære lokaliseringer af SEL1L blev cellerne inkuberet med det N-terminale anti-SEL1L monoklonalt antistof [34] og med polyklonale antistoffer mod ER markør calreticulin (Affinity bioreagenser, Breda, Holland) og Golgi markør Giantin (Covance , Princeton, NJ, USA). Kernerne blev farvet med 4,6-diamido-2-phenylindol (DAPI, Sigma-Aldrich, Milan, Italien). Primære antistoffer blev visualiseret under anvendelse fluoresceinisothiocyanat-konjugeret gede-anti-muse-IgG (Cappel Research Products) eller Texas-Red-konjugeret gede anti-kanin IgG (Jackson Immunoresearch Laboratories) i 30 minutter ved stuetemperatur. Celler blev analyseret under anvendelse af et Apotome Axio Observer Z1 inverteret mikroskop (Zeiss, Oberkochen, Tyskland), udstyret med en AxioCam MRM Rev.3 ved 40X forstørrelse. Colokalisering af fluorescenssignaler blev analyseret med AxioVision 4.6.3 software. Billedanalyse blev udført ved hjælp af Adobe Photoshop.

Cryoimmunoelectron mikroskopi

Celler behandles til cryoimmunoelectron mikroskopi blev dyrket som ovenfor og fikseret i 2% paraformaldehyd, 0,2% glutaraldehyd i 0,1 M phosphatpuffer, pH 7,4, i 2 timer ved 25 ° C. Celler blev skrabet af dækglas, centrifugeres indlejret i 10% gelatine (Sigma-Aldrich) i 0,1 M PBS, pH 7,4 og størknet på is. Efter infusion i 2,3 M saccharose natten over ved 4 ° C blev celleblokke monteret på aluminium stifter og nedfrosset i flydende nitrogen. Ultratynde kryosektioner (60 nm) blev skåret ved -120 ° C ved hjælp af en Ultracut EM FC6 cryoultramicrotome (Leica Microsystems, Wien, Østrig), indsamlet med 1% methylcellulose i 1,15 M saccharose og enkelt- eller dobbelt-immunolabelled med primære antistoffer. Bundne antistoffer blev visualiseret under anvendelse af gede-anti-muse konjugeret med 5- eller 15-nm kolloidt guld (British Biocell International, Cardiff, UK) eller ved protein-A konjugeret med 10-nm kolloidt guld (leveret fra G.Posthuma og J. Slot , Utrecht, Holland). Immunolabeling blev udført med de følgende primære antistoffer: monoklonalt anti-SEL1L N-terminus [34], polyklonalt anti-SEL1L N-terminus [35], polyklonalt anti SEL1L-C terminus, polyklonalt anti-calreticulin (Affinity Bioreagents), anti-CD63 monoklonalt H5C6, udviklet af JT August og J.E.K. Hildreth, opnået fra Developmental Studies Hybridoma Bank udviklet i regi af den NICHD og vedligeholdes af The University of Iowa, Institut for Biologi (Iowa City, IA 52.242), og monoklonalt anti-c-myc (Sigma-Aldrich)

SEL1LBmyc

transficerede 293 FT celler [26]. Enkelt og dobbelt immunolabeling blev udført som beskrevet tidligere [23], [36]. Kryosnit blev analyseret med en Philips CM10 transmission elektron mikroskop.

Off-gel proteiner fraktionering

Semi-flydende fase isoelektrofokusering fraktionering blev udført på en Off-Gel 3100 apparat (Agilent Technologies, Cernusco, IT ) under anvendelse af en 24 cm strimmel med immobiliserede pH gradientgeler i 4-7 interval. Total cellelysaturenheder prøver (360 pi, svarende til 1300 ug af proteiner) blev blandet med 3240 pi isoelektrisk fokusering puffer (Agilent Technologies) og sat på apparatet. Protein fraktionering blev udført i 26 timer med maksimalt 8000 volt for i alt 60.000 V /hrs, ifølge fabrikantens protokol. De resulterende flydende fraktioner (150 pi) med 0,25 pH-området blev opsamlet, og aliquoter af proteiner yderligere opløst på 10% acrylamid SDS-PAGE for Western blot probing.

Protein identifikation ved MALDI-TOF massespektrometri (MS) analyse

Bands af interesse fra SDS-PAGE blev udskåret fra gelerne, reduceret, alkyleret og fordøjet natten over med bovin trypsin (Roche, Milano, Italien), som tidligere beskrevet [37]. One pi (1 pi) alikvoter af supernatanten blev anvendt til masse-analyse under anvendelse af det tørrede dråber teknik og α-cyano-4-hydroxykanelsyre som matrix. Massespektre blev opnået på et MALDI-TOF Voyager-DE STR massespektrometer (Applied Biosystem, Foster City, CA). Alternativt, sur og basisk peptid ekstraktion fra gelstykker efter tryptisk fordøjelse blev udført, og de resulterende peptidblandinger underkastet en enkelt afsaltning /koncentrationstrin før MS-analyse i løbet Zip-TipC18 (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA). Spectra blev internt kalibreret ved hjælp af trypsin autolyse produkter og behandles via Data Explorer-softwaren. Proteiner blev entydigt identificeret ved at søge en omfattende ikke-redundante protein database for National Center for Biotechnology Information (NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) og massespektrometri protein sekvens DataBase (MSDB, http: //msdn.microsoft.com/en-us/library/ms187112.aspx), valgt som standard hjælp i hus de programmer ProFound v4.10.5 og Mascot v1.9.00 henholdsvis [38], [39]. En forpasset spaltning pr peptid var tilladt, og en første masse tolerance på 50 ppm blev anvendt i alle søgninger.

Resultater

Novel ER-anchorless SEL1L varianter

Et monoklonalt antistof rejst mod den N-terminale ende af SEL1L protein [34] blev anvendt til at screene et panel af hele lysater fra fem humane cellelinjer, herunder MCF7 og SKBR3 (brystkræft), KMS11 (Ig-K-secernerende myelomatose), 293FT ( embryo nyre) og den ikke-tumorgene epithelial brystcellelinjen MCF10A. Udover den kendte 95 kDa SEL1LA protein, to additive bånd, betegnet p38 og P28, blev visualiseret ved ca. 38 kDa og 28 kDa (figur 1A). Mens P28 udelukkende blev detekteret i SKBR3 linje, blev p38 udtrykkes kraftigt, til niveauer over SEL1LA, i alle de testede, med lavere niveauer i MCF10A, hvor SEL1LA ekspression (protein og RNA) var også lavere (fig 1a- cancercellelinier B). Et polyklonalt antistof rejst mod SEL1L C-terminus, som omfatter SEL1LA hale anker til indføring i ER-membranen, detekteres 95 KDa SEL1LA protein, men ikke p38 og P28, selvom en ekstra bånd blev påvist ved ca. 55 KDa, der kunne angiver den carboxyterminale fragment er resultatet af spaltning af det native protein (figur S1A). Navnlig p38 variant var stærkt udtrykte også i andre testede cancercellelinier, herunder Namalwa (lymfom), MDAMB453 (brystkræft), HeLa (livmoderhalskræft), og G144, G166, G179 (glioblastoma), som alle resulterede negativ for P28 (Figur S1B). Analyse af SEL1L protein profil i nontumorigene humant føtalt hjerne-cellelinie CB660 sammenlignet med de tre glioblastoma-cellelinier (fig S1B) gav yderligere

in vitro

bevis for, at p38 faktisk blev udtrykt ved højere niveauer i tumorceller.

A. Western blot-analyse: Lysater (50 ug) fra forskellige cellelinier, herunder 293FT (embryo nyre), MCF10A (ikke-tumorigen bryst), MCF7, SKBR3 (brystkræft) og KMS11 (myelomatose), blev opløst ved SDS-PAGE ( 10%) og probet med monoklonalt til SEL1L N-terminus. Vinculin blev anvendt som en loading kontrol. Foruden SEL1LA (95 kDa), den N-terminale SEL1L antistof anerkendt to mindre kodede produkter, på ca. 38 og 28 kDa (betegnet p38 og P28). P38 var mere rigelig end SEL1LA og begge var up-moduleret i kræft cellelinjer forhold til MCF10A. P28 var påviselig kun i SKBR3. Bånd over p38, sandsynligvis svarer til umodne forstadier eller posttranslationelt modificerede produkter blev lejlighedsvis set i de testede cellelinier. Blottet repræsenterer fire uafhængige forsøg. B. RT-PCR-analyse: RNA’er fra KMS11, MCF10A og SKBR3 celler blev analyseret ved RT-PCR under anvendelse af primere specifikke for

SEL1LA

. Signaler vist blev opnået med 27 cykler for

SEL1LA

.

HPRT

blev anvendt som en loading kontrol.

SEL1LA

blev up-moduleret i kræftceller i forhold til den ikke-tumorigen MCF10A linje. Billedet repræsenterer tre forskellige assays baseret på uafhængige behandlinger. C.

Intra /inter

-molecular disulfid obligationer analyse af p38. 293FT cellelysater blev opløst ved SDS-PAGE (10%) under reducerende (R) og ikke-reducerende (NR) betingelser og blottet med monoklonalt anti-SEL1L N-terminus. P38 vandrede som en dublet under ikke-reducerende betingelser (banerne sammenligning p38 migration under reducerende og ikke-reducerende betingelser er fra den samme gel). D. Down-modulation af SEL1LA, P28 og p38 ved SEL1L lille interfererende RNA (siRNA): Venstre panel: SKBR3 celler (3 x 10

5) blev behandlet med røræg siRNA eller siRNA specifikke for SEL1L (siRNA SEL1L) i 48 timer, efterfulgt af en anden siRNA behandling for yderligere 48 timer. Silencing effektivitet blev verificeret ved Western blot. SEL1LA, P28 og p38 proteinniveauer faldt tæt på 55%, 30% og 16% sammenlignet med celler behandlet med scrambled siRNA. Vinculin blev anvendt som en loading kontrol. Højre panel: 293FT celler (6 x 10

5) blev behandlet med røræg siRNA eller siRNA-SEL1L i 48 timer. SEL1LA og p38 proteinniveauer faldt tæt på 45% og 23% sammenlignet med celler behandlet med scrambled siRNA. Vinculin blev anvendt som en loading kontrol. Histogrammerne viser værdier normaliseret i forhold til husholdning signaler og udtrykt som fold graduering i forhold til kontrol, blev densitometrisk analyse bestemmes ved hjælp af Scion billedbehandling program. (Www.scioncorp.com). Dataene er gennemsnit af tre uafhængige forsøg, ± SD; T-test blev anvendt til bestemmelse statistisk signifikans *

s Restaurant 0,1; **

s

0,05. E. Analyse af p38 og SEL1LA stabilitet: 293 FT-celler (6 x 10

5) blev behandlet i 3, 6 og 18 timer med cycloheximid (CHX, 200 pg /ml). Portioner af lysater (50 ug) blev opløst ved SDS-PAGE (10%) og probet med monoklonalt anti-SEL1L og anti-vinculin antistoffer. I modsætning SEL1LA, som gradvis faldt i cycloheximid eksponering på op til omkring 90%, har p38 niveauet ikke ændres væsentligt. Histogrammet viser de densitometriske kvantificeringerne opnået gennem Scion billedbehandling program (www.scioncorp.com). Værdier blev normaliseret i forhold til husholdning signaler og udtrykt som fold graduering i forhold til ubehandlede prøver. Dataene er et gennemsnit af to uafhængige forsøg, ± SD.

Når analyseret i 293FT celler ved SDS-PAGE og immunblot under reducerende betingelse, p38 vandrede som en monomer, mens det optrådte som en dublet under ikke -reducerende forhold (figur 1C). Medens mange proteiner indeholdende intramolekylære disulfidbindinger migrere hurtigere under ikke-reducerende betingelser på grund af den mere kompakte native struktur [40], p38 migrerede hurtigere i reduceret end i oxideret tilstand, et fænomen antyder, at jo langsommere migrerende form, kunne bringes i indgreb i intermolekylære disulfidbindinger [41] – [43]. Den P28-signalet viste sig som et enkelt bånd under både reducerende og ikke-reducerende betingelser (data ikke vist).

For at sikre, at p38 og P28 var

respektabelt

endogene

SEL1L

enkodede proteiner, blev SKBR3 og 293FT celler transficeret med siRNA’er rettet mod SEL1L N-terminus. Niveauerne af de tre SEL1L signalerne var signifikant lavere i cellerne behandlet med

SEL1L

versus scrambled siRNA’er, med fald på 55% og 45% for SEL1LA og 16% og 23% for p38 i SKBR3 og 293FT celler henholdsvis og på 30% for P28 i SKBR3 (figur 1D). I 293FT celler, inhibering af proteinsyntesen ved cycloheximid i 3 og 6 timer, tidsvinduer, som ikke resulterer i celledød, faldt SEL1LA niveau med ca. 50%, men havde næsten ingen virkning på p38 (figur 1E). På 18 timer, cycloheximid forårsagede celledød, samtidig til en drastisk udtømning af SEL1LA (ca. 90%), men ikke ændre p38 niveauet. Dette indikerer, at p38 er mere stabil end SEL1LA, hvilket kan forklare den beskedne p38 tømt af siRNA’er til SEL1L N-terminus.

Tilsammen indikerer disse data, at p38 og P28 er SEL1L proteinvarianter kodet af 5 enden af ​​den

SEL1L

gen. Mens p38 resulterede udtrykt i alle de testede cellelinjer, med højere niveauer i kræft linjer blev P28 opdaget kun i dårligt differentieret metastatisk brystkræft linje SKBR3 [44].

p38 og P28 varianter viser sekretoriske egenskaber

for at udforske adfærd og sekretion af p38 og P28 i celler under ER stress /UPR, vi analyseret ved SDS-PAGE og immunoblot cellelysater og kultursupernatanter fra MCF10A, SKBR3 og KMS11 celler under normale forhold og efter behandling med DTT, som forårsager protein misfoldning ved at reducere disulfidbindinger [45] (figur 2A-C). I alle de testede celler DTT udløst ER stress /UPR, vurderet af

XBP-1

splejsning kombineret med

BIP

,

ATF6

CHOP

op -modulation, og boostet

SEL1LA

mRNA-ekspression (figur 2A1, C1; Figur S2A-C), mens SEL1LA proteinniveauet ikke steg signifikant (figur 2A-C, C2). P38, men ikke SEL1LA, var let påviselige i SKBR3 og KMS11 supernatanter, stigende tæt på tre- og fem gange henholdsvis efter DTT (figur 2B-C). Der blev ikke fundet tegn på p38 i MCF10A supernatanter, under både normale og DTT-stressede forhold (Figur 2A). P28 blev udelukkende fundet efter DTT behandling og kun i supernatanten fra SKBR3-cellelinien, som udtrykker denne variant (figur 2B).

A. Western blot analyse af ubehandlede og DTT-behandlede MCF10A celler: MCF10A celler blev udsat for DTT (2 mM) i 3 timer og successivt opretholdt i 24 timer i OPTIMEM. Udskilte protein (50 ug) ekstraheret fra dyrkningsmediet ved TCA-udfældning, og alikvoter af cellelysater (50 ug) blev opløst ved SDS-PAGE (10%) og blottet med monoklonalt anti-SEL1L og anti-vinculin antistoffer. P38 var ikke påviselig i dyrkningsmediet, både i nærvær og i fravær af DTT. Foruden p38, viste MCF10A celler en højere bånd, formentlig svarende til en umoden precursor eller posttranslationelt modificeret produkt. Billedet repræsenterer to uafhængige forsøg. A1. RT-PCR-analyse af ubehandlede og DTT-behandlede MCF10A celler: RNA blev ekstraheret fra prøverne beskrevet i panel A og analyseret ved RT-PCR for UPR respons. Histogrammet viser udtryk værdier normaliseret i forhold til husholdning signaler og udtrykt som fold graduering i forhold til de ubehandlede prøver; densitometrisk analyse blev udført ved Scion imaging program. UPR aktivering på DTT behandling er indiceret med op-modulation af

BIP

CHOP

og

XBP-1

splejsning, samtidig

SEL1LA

øges ( grå bar). De tilsvarende billeder er vist i fig S2A. Dataene er gennemsnittet af to forskellige assays baseret på uafhængige behandlinger, ± SD. B. Western blot-analyse af ubehandlede og DTT-behandlede SKBR3-celler: Sekretion af p38 og P28 blev evalueret i ubehandlede og DTT-behandlede SKBR3 celler. Celler udsat for DTT (2 mM) i 3 timer eller ikke eksponeret blev opretholdt i 24 timer i OPTIMEM. Udskilte protein (50 ug) ekstraheret fra dyrkningsmediet ved TCA-udfældning, og alikvoter af cellelysater (50 ug) blev opløst ved SDS-PAGE (12%) og blottet med anti-SEL1L og anti-vinculin antistoffer. ER stress /UPR fremmes kraftigt sekretion af p38 og, i mindre omfang, P28 i dyrkningsmediet. Billedet repræsenterer fem uafhængige forsøg. C. Western blot-analyse af KMS11 celler behandlet med DTT og MG132: KMS11 celler blev udsat for DTT (2 mM) eller MG132 (10 uM) i 3 timer og successivt opretholdt i 24 timer i OPTIMEM. Udskilte protein (30 ug), ekstraheret fra dyrkningsmediet ved TCA-udfældning, og alikvoter af cellelysater (50 ug) blev opløst ved SDS-PAGE (10%) og blottet med anti-SEL1L og anti-vinculin antistoffer. Begge behandlinger markant induceret p38-sekretion i dyrkningsmediet. Billedet repræsenterer fem uafhængige forsøg. C1. RT-PCR-analyse af KMS11 celler behandlet med DTT og MG132: RNA blev ekstraheret fra de samme prøver som beskrevet i panel C og analyseret ved RT-PCR for UPR respons. Histogrammet viser udtryk værdier normaliseret i forhold til husholdning signaler og udtrykt som fold graduering i forhold til ubehandlede prøver; densitometrisk analyse blev bestemt ved Scion imaging program. UPR aktivering på DTT behandling indikeres af up-modulation af

ATF6

,

BIP

, og

CHOP

af

XBP-1

splejsning ( se figur S2C), samtidig udtryk for

SEL1LA

,

HRD1

GADD45β

øges (grå bar). De tilsvarende billeder er vist i fig S2C. MG132 behandling ikke udløse UPR aktivering, som indikeret ved fravær af

ATF6

BIP

un-modulation og mangel på

XBP-1

splejsning (se figur S2C) ikke desto mindre,

CHOP

og

GADD45β

blev markant op-moduleret og

SEL1LA

og

HRD1

ned-moduleret (sorte bjælker). Dataene er et gennemsnit af fire forskellige assays baseret på uafhængige behandlinger, ± SD. C2. SEL1LA proteinekspression i KMS11 celler behandlet med DTT og MG132: Histogrammet viser SEL1LA protein udtryk værdier opnået fra prøverne, der er beskrevet i panel C, normaliseret i forhold til husholdning signaler og udtrykt som fold graduering i forhold til den ubehandlede prøve; densitometrisk analyse blev udført ved anvendelse af Scion imaging program. MG132 bestemt SEL1LA proteinakkumulering op til 2 gange i forhold til kontrolgruppen niveau (sort søjle). Dataene er gennemsnit af fire uafhængige forsøg, ± SD.

MG132, som bestemmer ER stress gennem ERAD blokering af proteasomhæmning [46], blev testet på KMS11 myelom linje, bliver kendt, at brystcancercellelinier er ganske modstandsdygtige over for en sådan behandling [47]. Et ca. femdobling af p38 i KMS11 medium skete efter tre timers MG132 eksponering, samtidig til en betydelig stigning i

CHOP

og

GADD45β

udtryk, tegn på ER stress /UPR aktivering, selv hvis i fravær af

XBP-1

splejsning og

BIP

ATF6

up-modulation (Figur 2C-C1, figur S2C). MG132 behandling også øget SEL1LA proteinniveau (figur 2C, C2), som er konsistent med rapporterede beviser for, at SEL1LA nedbrydes via proteasom [22].