PLoS ONE: Ceruloplasmin er en roman Adipokine Hvilket er overudtrykt i fedtvæv af overvægtige og i fedme-associerede Cancer Cells

Abstrakt

Fedme giver en øget risiko for at udvikle specifikke kræftformer. Selvom de mekanismer er uklare, øget fedt celle sekretion af specifikke proteiner (adipokiner) kan fremme /lette udviklingen af ​​maligne tumorer i fedme via cross-talk mellem fedtvæv (er) og væv tilbøjelige til at udvikle kræft blandt overvægtige. Vi søgte efter hidtil ukendte adipokiner der blev overudtrykt i fedtvæv af overvægtige patienter samt i tumorceller afledt af kræftsygdomme, der almindeligvis er forbundet med fedme. Til dette formål ekspression data fra human fedtvæv af overvægtige og ikke-overvægtige samt fra et stort panel af humane cancercellelinjer og tilsvarende primære celler og væv blev undersøgt. Vi fandt ekspression af ceruloplasmin skal den mest beriget med fedme-associeret cancerceller. Dette gen var også signifikant opreguleret i fedtvæv af overvægtige patienter. Ceruloplasmin er kroppens vigtigste kobber luftfartsselskab og er involveret i angiogenese. Vi viser, at ceruloplasmin er en roman adipokine, som produceres og udskilles ved øget satser i fedme. I fede tilstand, fedtvæv bidrog markant (op til 22%) til den totale cirkulerende proteinniveauet. Sammenfattende har vi gennem bioinformatik screening identificerede ceruloplasmin som en ny adipokine med forøget ekspression i fedtvæv af overvægtige patienter såvel som i celler fra fedme-associerede cancere. Om der er en årsagssammenhæng mellem adipose overekspression af ceruloplasmin og kræft udvikling i fedme, kan ikke besvares af disse tværsnitsundersøgelser sammenligninger

Henvisning:. Arner E, Forrest ARR, Ehrlund A, Mejhert N, Itoh M, Kawaji H, et al. (2014) Ceruloplasmin er en roman Adipokine Hvilket er overudtrykt i fedtvæv af overvægtige og i fedme-associerede cancerceller. PLoS ONE 9 (3): e80274. doi: 10,1371 /journal.pone.0080274

Redaktør: Qiong Wu, Harbin Institute of Technology, Kina

Modtaget: Juli 9, 2013; Accepteret: 11 Oktober 2013; Udgivet: Marts 27, 2014

Copyright: © 2014 Arner et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. FANTOM5 var muliggjort af en forskningsbevilling til RIKEN omik Science center fra MEXT til Yoshihide Hayashizaki og en tildeling af Research program for nyskabende Cell Biology ved Innovative Technology (Cell Innovation Program) fra MEXT, Japan til Yoshihide Hayashizaki. Denne undersøgelse blev også støttet af tilskud fra den svenske Forskningsråd og den svenske Cancer Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Der er en verdensomspændende stigning i fedme prævalens og fedme og dens følgesygdomme er blevet et stort sundhedsproblem i de fleste lande [1]. Fedme-associeret cancer har for nylig fået meget opmærksomhed. World Cancer Research Fund konkluderede i 2007, at fedme overbevisende er forbundet med øget risiko for bugspytkirtlen, (postmenopausal) bryst, endometrie og nyrekræft [2]. Disse konklusioner blev senere bekræftet og udvidet i en nylig metaanalyse af prospektive studier der vurderer kræftrisikoen ≥ 5 kg /m

2 stigninger i body mass index (BMI) [3]. Den stærkeste risiko (odds ratio ≥1.30) blev observeret for nyrekræft og oesophagal adenokarcinom i begge køn, for kræft i skjoldbruskkirtlen hos mænd og for endometrie og galdeblære kræft hos kvinder.

De mekanismer der forbinder fedme til kræft er dårligt forstået selv om flere teorier er blevet fremsat [4], [5], [6], [7], [8]. I betragtning af at fedtvæv udgør kroppens største endokrine orgel, udskiller hundredvis af peptid-signaler kollektivt betegnes adipokiner, og at adipokine sekretion er forstyrret i væsentlig grad i fedme, en attraktiv hypotese er, at adipøst afledte signaler til andre væv kan være involveret i udviklingen af ​​kræft. De to mest grundigt undersøgte adipokiner, adiponectin og leptin, er i virkeligheden blevet forbundet med udviklingen af ​​maligne tumorer ved skridt på beslægtede receptorer påvirker insulinfølsomheden og /eller aktiverende cancerassocieret signalering [4]. Desuden flere adipokiner er vækstfaktorer, der kunne tjene som direkte signaler til tumorer [9]. Disse samt andre, endnu ikke opdaget adipokiner, kan derfor have kræft-fremme egenskaber.

I denne undersøgelse har vi til formål at finde nye humane adipokiner der kan være forbundet med fedme-associerede kræftformer. Til dette formål, udvundet vi data fra romanen FANTOM5 udtryk atlas, som giver en hidtil uset dækning af humane væv, primærelementer og kræft cellelinjer [10]. Vi fokuserede på cancercellelinjer afledt af maligne tumorer med den stærkeste association med fedme (odds ratio ≥1.3 hos begge køn) ifølge Renehan et al [3]. Formodede hidtil ukendte adipokiner af potentiel relevans for fedme-associerede cancere blev identificeret ved sammenligning transkriptomet beriget med både cancerceller og fede fedtvæv. Dette blev gjort ved at kombinere FANTOM5 udtryk atlas data med en nyligt offentliggjort undersøgelse af genekspression i fedtvæv fra en stor gruppe af overvægtige og ikke-overvægtige kvinder [11].

Dette værk er en del af FANTOM5 projektet . Data downloads, genomiske værktøjer og co-offentliggjorte manuskripter er opsummeret her https://fantom.gsc.riken.jp/5/.

Metoder

Emner og fedtvæv

Alle emner blev informeret i detaljer om undersøgelsen og blev opnået skriftligt informeret samtykke. Undersøgelserne blev godkendt af udvalget for etik ved Karolinska Institutet, Stockholm, Sverige. Tre forskellige grupper af forsøgspersoner blev anvendt i undersøgelsen. I den første gruppe, beskrevet tidligere [11], subkutant fedtvæv blev opnået fra 26 ikke-fed og 30 overvægtige kvinder. Fedme blev defineret som BMI 30 kg /m

2 eller derover. RNA blev ekstraheret og underkastet global udtryk mikroarray som beskrevet [11]. De genekspression data er blevet deponeret i National Center for Biotechnology Gene Expression Omnibus (tiltrædelse nummer GSE25402). Protokollen nummer fra Udvalget for etik er 592/03 (godkendt 1

st fra december 2003).

I den anden kohorte blev subkutane fedtvæv opnås ved kosmetisk fedtsugning og anvendes til eksperimentelt identificere nye adipokiner . Ni kvinder blev undersøgt. Alle var ikke-fed og sund ifølge selvrapportering. Værdier (middel ± SD) for alder og BMI var 45 ± 13 år og 27,4 ± 1,2 kg /m

2. Vævet blev underkastet collagenase fordøjelse og stroma-kar portion blev differentieret til adipocyter i kultur som beskrevet [11]. Til proteinbestemmelse i konditioneret medium, blev portioner fjernet 4, 8 og 12 dage efter påbegyndelsen af ​​differentiering. Protokollen nummer fra udvalget om Etik er 2009 /1881-1831 /1 (godkendt 14

th januar 2010).

I den tredje kohorte, fedtvæv sekretion af proteiner og deres plasmaniveauer blev bestemt . Tyve fede (alder 46 ± 6 år middel ± SD) og 19 ikke-overvægtige raske kvinder (alder 47 ± 9 år) blev undersøgt om morgenen efter en nats faste. Den fede var planlagt til fedmekirurgi. Syv var sunde, 10 havde hypertension og tre havde type 2-diabetes i behandling med orale midler. Total kropsfedt blev bestemt ved dobbelt røntgen absorptiometri (62 ± 10 kg i overvægtige og 24 ± 8 kg i ikke-fede). Derefter blev en venøs plasma prøve opnået til bestemmelse af cirkulerende proteinniveauer. Endelig blev fedtvæv opnået ved en subkutan abdominal biopsi som beskrevet [11], [12]. Del af fedtvæv prøven blev underkastet

in vitro

inkubering i 2 timer og konditioneret medium blev anvendt til proteinbestemmelse som beskrevet [12]. Den anden del blev underkastet collagenasebehandling og isolerede fedtceller blev opnået til bestemmelse af fedt cellestørrelse og volumen som beskrevet [13]. Proteinsekretion var relateret til antallet af fedtceller i den inkuberede vævsprøve og til den totale mængde af kropsfedt. I sidstnævnte tilfælde blev proteinsekretion relateret til mængden af ​​lipider i inkuberet væv og denne værdi blev multipliceret med den samlede kropsfedt vægt som beskrevet [12]. Protokollen nummer fra udvalget om Etik er 2005 /1441-1432 (godkendt 1

st februar 2006).

Protein foranstaltninger

Ceruloplasmin og osteopontin blev målt ved kommercielle ELISA-kits ( . Abcam, Cambridge, UK)

adipøst bidrag til den samlede ceruloplasmin produktion

for at estimere bidraget af fedtvæv-afledte ceruloplasmin til kredsløbet blev følgende antagelser: (a) ceruloplasmin sekretion fra fedtvæv udrugning

in vitro

ligner i forskellige adipose regioner og afspejler

in vivo

sekretion. (B) ceruloplasmin er jævnt fordelt i vandet plads, der er 0.530 l /kg legemsvægt i ikke-overvægtige og 0,465 l /kg legemsvægt hos overvægtige [14]. (C) plasmaniveauet af ceruloplasmin om morgenen medtager 24 timers niveauer og halveringstiden af ​​proteinet er 5,5 dage [15]. Baseret på disse antagelser, blev samlet ceruloplasmin produktion timen estimeres som: (målt plasmaniveau x 5,5 x kroppens samlede vand) divideret med 24. Totalt fedt sekretion timen måles som sekretion pr lipid vægt af fedtvæv timen gange total kropsfedt . Fra disse værdier kan beregnes procentdelen af ​​fedt bidrag væv til ceruloplasmin produktion.

Kræft og kontrolprøver

Baseret på Renehan et al [3], vi identificeret følgende kræft cellelinjer i Fantom 5 datasæt som er afledt af tumor typer er forbundet med fedme og har en odds ratio ≥1.30 i mænd, kvinder eller begge dele. Uterus: endometrial stromal sarkom cellelinje (OMC-9), endometrial carcinom cellelinie (OMC-2), endometrioide adenocarcinom cellelinie (JHUEM-1), clear cell carcinoma-cellelinie (TEN); Nyre: renalcellecarcinom cellelinje (OS-RC-2), renalcellecarcinom cellelinje (TUHR10TKB); Galdeblære: galdeblære carcinoma-cellelinie (TGBC2TKB), galdeblære carcinoma-cellelinie (TGBC14TKB); Thyroid: thyreoideakarcinom cellelinie (TCO-1), thyroid carcinoma-cellelinie (KHM-5 M), papillær adenocarcinom cellelinie (8505C). Som kontrolprøver vi brugt følgende væv og primære celleprøver. Livmoder: voksen og fostervæv; Nyre: voksen og føtalt væv, Renal kortikale epithelceller (to donorer), Renal epithelceller (tre donorer), Renal glomerulær endotelceller (tre donorer), Nyrer mesangialceller (tre donorer), Renal proksimal Tubular epitelcelle (tre donorer) ; Galdeblære: voksent væv; Thyreoidea:. Voksen og fostervæv

Identifikation af nye kræft-relaterede adipokine kandidater

Genekspression i FANTOM5 databasen blev beregnet som den normaliserede tag count (tags per million, TPM) i en 1 kb vindue omkring RefSeq [16] transskription start-sites. Gener blev identificeret som kandidater, hvis de blev udtrykt ved et funktionelt signifikant niveau (her defineret som 10 TPM eller højere) og beriget mindst to gange i de ovenfor anførte cancercellelinjer sammenlignet med alle cellelinier tilgængelige i FANTOM5, uden at være beriget blandt de tilsvarende væv eller primære celler. Berigelse blev beregnet som beskrevet i [17] med p-værdier korrigeret for multipel testning ved hjælp af Benjamini-Hochberg metoden [18]. Kandidatgener blev bibeholdt, hvis de var signifikant opreguleret ved 5% FDR i fedtvæv af overvægtige patienter ifølge en tidligere undersøgelse [11]. Brug af FANTOM5 udtryk database, krævede vi mindst 10 TPM CAGE genekspression tværs af en receptor locus i et eller flere fedme associeret cancer cellelinjer for at fastholde det til yderligere undersøgelse.

Statistisk analyse

Værdierne er gennemsnit ± standardfejl. De blev sammenlignet ved variansanalyse (gentaget foranstaltning), uparret t-test og lineær regressionsanalyse.

Resultater

Indledende analyse af FANTOM 5 database [10] og den offentliggjorte fedtvæv array [11] identificeret 700 gener, som blev udtrykt væsentligt (≥10 TPM) og mindst to-fold beriget med en cancercellelinie af interesse, men ikke beriges i de tilsvarende væv eller primære celler, og opreguleret i fedtvæv af fede. Det var ikke muligt at foretage en detaljeret analyse af alle identificerede gener eller at afgøre, hvilke af dem, der var faktisk udskilles fra fedtceller. Derfor vi yderligere indsnævret listen ved at begrænse ekspression i den relevante cancercellelinie til ≥100 TPM (et højt ekspressionsniveau), mindst fem gange berigelse i cancercellelinie sammenlignet med tilsvarende raske væv /celler, og mindst to fold opregulering i fedtvæv i fedme. Kun to gener mødte disse strengere kriterier, nemlig ceruloplasmin (geneID:

CP

) og osteopontin (geneID:

SPP1

). Overraskende begge kodede proteiner til stede i kredsløbet og blev derfor betragtet potentielle adipokiner. Vi undersøgte, om ceruloplasmin og osteopontin aktivt blev udskilt fra fedtceller ved at bestemme, om der var en tidsafhængig frigivelse til medierne. Mens osteopontin ikke var påviselig i inkubationsmediet (graf ikke vist), blev ceruloplasmin faktisk frigives på en tidsafhængig måde i differentierende adipocytter (fig. 1a). Selv osteopontin mRNA udtrykkes i fedtvæv ifølge microarray og opreguleres i fedme [11], det kodede protein synes ikke at secerneres fra fedtceller hvilket antyder, at osteopontin er ikke en adipokine. Indflydelsen af ​​fedme på plasmaniveauer og sekretion af ceruloplasmin fra subkutan fedtvæv blev også undersøgt (fig 1b-d). Plasma niveauer og fedt sekretion blev signifikant forøget i prøver fra overvægtige patienter. Der var en stærk positiv sammenhæng mellem cirkulerende og fedt-udskilt ceruloplasmin. Faktisk sidstnævnte forklarede 45% af den inter-individuelle variation i plasma ceruloplasmin (justeret r

2), som var uafhængig af BMI (delvis r = 0,36; p = 0,026) eller kropsfedt (partiel r = 0,44; p = 0,007). Bidraget fra fedtvæv til den samlede ceruloplasmin produktion blev bestemt som beskrevet i metoder og blev anslået til at være 13 ± 5% i ikke-fed og 22 ± 6% i overvægtige (p 0,0001).

A. Sekretion under differentiering af stamceller til fedtceller. Data analyseres ved ANOVA, gentagne målinger. B og C. Indflydelse af fedme på plasmaniveauer og sekretion fra fedtvæv som analyseret med uparret t-test. D. Forholdet mellem udskilt ceruloplasmin og dens plasmaniveauer som analyseres med lineær regression.

Vi yderligere undersøgt udtrykket mønster af

CP

i humane cancerceller. Figur 2 viser den genomiske placering af

CP

(fig 2a, b), fordelingen af ​​promotor-aktivitet som målt ved hætten analyse genekspression (Cage, Fig 2c) og

CP

ekspression tværs af en bred panel af kræft celletyper Frygteligt udtryk niveau (figur 2d). Især kræftcellen linje med det højeste udtryk for

CP

er en klar celle karcinom fra endometrium (Fig 2d, top fast pil). Andre fedme-associerede kræftformer (nyre, endometrie) vise også relativt højt

CP

udtryk (fig 2d, solide pile). Nedsat kræft blev ikke medtaget i denne undersøgelse, fordi det ikke opfyldte vores kriterium om fedme /kræft sammenslutning odds ratio på 1,30 eller derover; alligevel er det interessant at bemærke, at det er forbundet med fedme hos mænd, når du bruger lidt mindre strenge kriterier (odds ratio = 1,24 i reference [3]), og at flere leverkræft cellelinjer er blandt dem med de højeste

CP

ekspression (fig 2d, brudte pile). Blandt de ni kræft cellelinjer med den højeste

CP

udtryk, blev syv forbundet med fedme.

A. CP er placeret på på den negative (lilla) streng af kromosom 3 i position 3q23-Q25, flankeret af HPS3 på det positive (grøn) streng og CPHL1 på den negative streng. B. RefSeq mRNA modeller af locus. C. Promotoraktivitet signal fordeling målt ved CAGE i locus. Størstedelen af ​​ekspression stammer fra 5′-enden af ​​CP. D. Expression (tags per million, TPM) på tværs af locus for cellelinierne stede i FANTOM5. Cellelinier med ekspression over 10 TPM Her vises; i alt 269 cellelinier blev profileret. Fedme er forbundet cellelinjer er angivet med sort (OR = 1,30) og grå (OR = 1.20). Pile

Diskussion

I denne undersøgelse tog vi en systematisk tilgang at identificere hidtil ukendte adipokiner der var forbundet med fedme og fedmerelaterede cancere ved sammenligning af ekspressionen af ​​alle fedme-inducerede gener i fedtvæv med gener beriget i alle cancercellelinier inkluderet i FANTOM5 undersøgelsen. Brug kriterier temmelig strenge udvælgelseskriterier, kun to gener scorede meget højt i denne sammenligning. I teorien kunne disse gener er kodet udskilt såvel som ikke-secernerede proteiner med enhver type af funktion. Men det viste sig, at begge gener kodet kredsløbssygdomme proteiner, nemlig osteopontin og ceruloplasmin. Osteopontin kunne ikke defineres som en adipokine (protein, der udskilles fra fedtceller) i henhold til vores resultater. I modsætning hertil ceruloplasmin opfyldte kriterierne for en ægte adipokine, dvs. det udskilles i en tidsafhængig måde. Da det ikke er inkluderet i den offentliggjorte secretome for humane fedtceller, anser vi det en roman adipokine [9]. Dog kan vores undersøgelse ikke fastslå, om der er en afslappet forhold mellem ceruloplasmin og fedme-associerede kræftformer, og er behov for yderligere undersøgelser for at fastslå, i hvilket omfang, om nogen, ceruloplasmin stammer fra adipocytter eller tumorceller spiller en funktionel rolle i væksten af ​​kræft væv. Ikke desto mindre kan vi konstatere, at

CP

er overudtrykt i fede fedtvæv og i cancerceller forbundet med fedme.

Ceruloplasmin i kredsløbet menes at være primært produceret af leveren [15], [19]. De foreliggende data tyder en hidtil ukendt bidragende rolle fedtvæv. I overensstemmelse med tidligere resultater [20], [21], de cirkulerende niveauer blev forøget i fedme. Endvidere blev adipose sekretion markant forøget hos overvægtige versus ikke-overvægtige personer. Vores estimater tyder på, at fedtvæv i fedme bidrager med op til 22% af de cirkulerende niveauer af ceruloplasmin og denne sekretion forklaret så meget som 45% af den inter-individuelle variation i plasma ceruloplasmin i både ikke overvægtige og fede fag. Forholdet mellem cirkulerende og fedt-udskilt ceruloplasmin var uafhængig af BMI eller kropsfedt masse. Det skal understreges, at den anslåede

in vivo

værdier er beregnet på baggrund af

in vitro

resultater, som kan være forskellige fra dem,

in vivo

. Desuden kan resultaterne køn forspændt siden fedtvæv microarray data anvendt heri var fra kvinder, mens forudsætninger om ceruloplasmin fordeling dels var baseret på en tidligere undersøgelse hos mænd [14]. Faktisk, selv om vi målte ceruloplasmin sekretion i fedtvæv fra kvinder, brugte vi mandlige data for kroppens samlede vand [14], da de sidstnævnte værdier blev opnået under anvendelse af en state-of-the-art teknik. De samlede krop vand værdier for kvinder målt med mindre nøjagtig biompedance metode kan sammenlignes med dem, der anvendes i vores nuværende beregninger, nemlig 0,527 ± 0,04, 0,472 ± 0,03, og 0,426 ± 0,028 l /kg legemsvægt i lean, overvægtige og fede hunner, henholdsvis [22].

Endelig vores undersøgelse undersøgte kun subkutant fedtvæv. Da ekspression og sekretion af visse adipokiner er forskelligt reguleret i forskellige fedtdepoter [23], ved vi ikke, om ceruloplasmin udtrykt og frigivet fra andre depoter kan vise andre korrelationer med fedme. På den anden side, subcutant fedtvæv er langt kroppens største fedt depot og derfor kvantitativt det vigtigste determinant af cirkulerende adipokine niveauer.

Sammenfattende ved bioinformatically udføre en systematisk screening for gener overudtrykt i fedme forbundet cancere denne undersøgelse identificerede ceruloplasmin som en ny menneskelig adipokine. Dens sekretion og udtryk øges i fedme og fedt ceruloplasmin er en stor bidragyder til det cirkulerende ceruloplasmin niveau.

Støtte oplysninger

tabel S1.

Liste over FANTOM5 konsortiets medlemmer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0080274.s001

(DOCX)

Tak

Vi vil gerne takke alle medlemmer af den FANTOM5 konsortiet for at bidrage til generation af prøver og analyse af data-sæt og takker Genas til produktion af data

Bemærk:. Riken omik Science center ophørte med at eksistere som 1. april 2013 på grund af Riken reorganisering.