PLoS ONE: c-MET Network som Novel Prognostisk markør for Forudsigelse blærekræft Patienter med en øget risiko for udvikling Aggressive Disease

Abstrakt

Tidligere undersøgelser har vist, at

c-MET

er overudtrykt i tilfælde af aggressiv blærekræft (BCA). Identifikation af krydstale mellem

c-MET

andre RTK såsom

AXL

og

PDGFR

tyder på, at

c-MET

netværk gener (

c-MET

–

AXL

–

PDGFR

) kan være klinisk relevant for BCA. Her undersøger vi, om ekspression af

c-met

netværk gener kan anvendes til at identificere BCA patienter med øget risiko for at udvikle aggressiv sygdom.

In vitro

analyse,

c-MET

knockdown undertrykt celleproliferation, invasion, og migration, øget følsomhed over for cisplatin-induceret apoptose. Desuden

c-MET

netværk gen (

c-MET

,

AXL

, og

PDGFR

) udtryk tilladt diskrimination af BCA væv fra normal kontrol væv og syntes at forudsige dårlig sygdomsprogression i ikke-muskel invasive BCA patienter og dårlig samlet overlevelse i muskel invasive BCA patienter. Disse resultater antyder, at

c-MET

netværk genekspression er en hidtil ukendt prognostisk markør for at forudsige, hvilke BCA patienter har en øget risiko for at udvikle aggressiv sygdom. Disse gener kan være en nyttig markør til co-targeting terapi, og forventes at spille en vigtig rolle i at forbedre både respons på behandling og overlevelse af BCA patienter

Henvisning:. Kim YW, Yun SJ, Jeong P, Kim SK, Kim SY, Yan C, et al. (2015)

c-MET

Netværk som Novel Prognostisk markør for Forudsigelse blærekræft Patienter med en øget risiko for udvikling Aggressiv sygdom. PLoS ONE 10 (7): e0134552. doi: 10,1371 /journal.pone.0134552

Redaktør: Renato Franco, Istituto dei tumori Fondazione Pascale, ITALIEN

Modtaget: Marts 26, 2015; Accepteret: 13 Juli 2015; Udgivet: 30 Juli 2015

Copyright: © 2015 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af en Grundforskningsfonden Korea (NRF) tilskud finansieret af den koreanske regering (MSIP; http:. //www.msip.go .kr /web /main /main.do) (nr NRF-2014R1A2A1A09006983) og af Basic Science Research Program gennem National Research Foundation Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og Teknologi (http: //www.moe.go.kr/main.do)(2012R1A1A4A01008753). Desuden blev dette arbejde delvist støttet af R01DK100974; U01 DK103260; U24 DK097154; NIH NCATS UCLA CTSI UL1TR000124; en Steven Spielberg Discovery Fund i Prostata Cancer Research Career Development Award; en IMAGINE INGEN IC Research Program Award (til JK). JK er en amerikansk Urological Association Foundation Research Scholar og en Harvard Medical School Eleanor og Miles Shore Scholar. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Overekspression af receptortyrosinkinaser (RTK’er) forekommer i tilfælde af aggressiv blærekræft (BCA); således RTK-målretning behandlinger anbefales til disse patienter [1, 2]. Farmakologisk hæmning af RTK-aktivitet (fx med gefitinib) er guldstandarden behandling for BCA patienter, selv om det har haft begrænset succes [3, 4].

c-MET

proto -oncogene, som er beliggende på kromosom 7q21-31 [5], overudtrykkes i BCA.

c-MET

aktiveres af dens ligand, hepatocytvækstfaktor (HGF), og inducerer øget proliferation, migration, bevægelighed og invasion af BCA-celler [6]. Ved stimulering og dimerisering af

c-MET

, tyrosinphosphorylering forekommer ved specifikke steder inden i intracellulære domæne (dvs. Y1234, Y1235, Y1349, og Y1356), hvilket øger den iboende aktivitet af tyrosinkinaser og fører til rekruttering af mange signalproteiner, herunder vækstfaktorreceptor-bundet protein 2 (Grb2), Grb2-associeret bindemiddel-1 (GAB1), Src homologi 2 domæne indeholdende (SHC), phospholipase C1 (PLC1), og phosphoinositid 3-kinase (PI3 -K) [7]. Den Ras /Erk-MAPK, PI3-K /Akt /mTOR [8], er og STAT3 signalveje også aktiveret, hvorved der induceres flere biologiske reaktioner [6, 9].

Overekspression af

c- MET

korrelerer med BCA metastaser [7, 10]; ja,

c-MET

er overudtrykt i mere end 60% af lokalt avancerede og metastatisk BCA tilfælde [5], og er knyttet til dårlig overlevelse [11]. I betragtning af at dimerisering af RTK er vigtig for at kontrollere deres biologiske funktion i forbindelse med kræft, bør krydstale mellem

c-MET

andre RTK’er undersøges nøje, hvis vi skal forstå betydningen af ​​

c- MET

i human cancer progression. Dele af primær tumor fra patienter med en sjælden form for BCA, kaldet neuroendokrine (NE) BCA, show

c-MET

udtryk [12]. Dette antyder, at NE BCA kan være en egnet mål for

c-MET

hæmmere. En tidligere undersøgelse har vist, at et medlem af

c-MET

familie, recepteur d’origine Nantais (RON), danner en heterodimer med epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) [13]. Desuden RTK microarray analyse afslørede, at RTK som

AXL

og

PDGFR

krydstale med

c-MET

[11].

AXL

og

PDGFR

er forbundet med aggressiv brystkræft [14], nyre [15], lunge [16, 17], og prostatakræft [18, 19], hvilket tyder på, at

c-MET Z –

AXL

–

PDGFR

kan være klinisk relevante for BCA [11]

Formålet med denne undersøgelse var at undersøge den kliniske foreningen. mellem udtryk for

c-MET

netværk gener (

c-MET

–

AXL

–

PDGFR

) og sygdom resultat for BCA patienter, og at undersøge, om

c-MET

netværk gener kan bruges til at identificere BCA patienter med øget risiko for at udvikle aggressiv sygdom.

Materialer og metoder

patienter og vævsprøver

Primær tumor prøver fra patienter, som gennemgik transuretral resektion (TUR) eller radikal cystektomi ved Chungbuk National University i Sydkorea, blev histologisk verificeret som urothelial karcinom. Normal blære slimhinde blev høstet fra patienter med benigne sygdomme, såsom godartet prostatahyperplasi (BPH), ureter sten, og stressinkontinens, efter informeret samtykke. Alle kontrol væv blev histologisk bekræftet som normalt. Patienter med samtidig karcinom

in situ

(CIS), SNG læsioner alene, en kort opfølgningsperiode (mindre end 6 måneder), eller for hvem oplysningerne var ufuldstændige, blev udelukket for at give en mere homogen undersøgelsespopulation. I alt 165 (135 mænd og 30 kvinder, gennemsnitsalder, 65 år) BCA patienter og 34 kontroller (19 mandlige og 15 kvindelige, gennemsnitsalder, 54 år) blev inkluderet. Alle tumorer blev makro-dissekeret (typisk inden for 15 minutter kirurgisk resektion), og hver BCA prøve blev bekræftet ved patologisk analyse af en frisk frosset væv sektion stammer fra TUR eller cystektomi prøver. Tumorprøver blev derefter frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. NMIBC patienter gennemgik en anden TUR 2-4 uger efter første resektion hvis BCA prøven ikke indeholdt den korrekte muskel lag, eller når en høj kvalitet tumor blev opdaget. Patienter med en T1 tumor, flere tumorer, store tumorer ( 3 cm i diameter), eller high-grade Ta NMIBC modtog en cyklus af intravesikal behandling [bacillus Calmette-Guérin (BCG) eller mitomycin-C]. Respons på behandling blev vurderet ved cystoskopi og urin cytologi. Patienter, der var sygdomsfri inden for 3 måneders behandling blev fulgt op hver 3. måned for de første 2 år og derefter hver 6. måned derefter. MIBC patienter med klinisk lokaliseret eller lokalt fremskreden tumorer og god Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) performance status (0 eller 1) undergik radikale cystektomi og fulde bækken lymfeknude dissektion. Patienter, der ikke er berettiget til radikal cystektomi grund metastatisk sygdom, dårlig levetid, eller dårlig ECOG performance status (≥2) gennemgik TUR eller biopsi til histopatologisk diagnose. Patienter med pT3, pT4 eller lymfeknude-positiv sygdom (baseret på en analyse af radikale cystektomi prøver), og dem med metastatisk sygdom, men god performance status modtaget mindst fire cyklusser af cisplatin kemoterapi. Patienter, der nægtede eller ikke gennemfører en billeddannende oparbejdning [computertomografi (CT) scanning eller magnetisk resonans imaging (MRI)] mindst en gang hver 3. måned for at vurdere svarene blev udelukket fra yderligere analyse.

Tumorer var iscenesat og karakter efter TNM klassifikationen 2002 og

European Association of Urology (EAU)

retningslinjer baseret på 1973

WHO

klassificeringssystem [20, 21]. Gentagelse blev defineret som tilbagefald af primær NMIBC med en lavere eller den samme patologiske stadium, og progression blev defineret som identifikationen af ​​T2 eller højere trin sygdom ved tilbagefald. I tilfælde af MIBC blev progression defineret som locoregional tilbagefald eller en ny fjernmetastaser i cystectomized patienter og en stigning i massen af ​​den primære tumor eller en ny fjernmetastaser i ikke-cystectomized patienter ≥20%.

RNA-ekstraktion og revers transkription til cDNA

RNA blev isoleret fra væv ved homogenisering med 1 ml TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) i et 5 ml reagensglas. Homogenatet blev derefter overført til et 1,5 ml rør og blandet med 200 ml chloroform. Efter inkubering i 5 minutter ved 4 ° C blev homogenatet centrifugeret i 13 min ved 13.000 g ved 4 ° C. Den øvre vandige fase blev overført til et rent rør indeholdende 500 ml isopropanol. Blandingen blev inkuberet i 60 minutter ved 4 ° C og derefter centrifugeret i 8 minutter ved 13.000 g ved 4 ° C. Den øvre vandige fase blev kasseret, og blandet med 500 ml 75% ethanol og centrifugeret i 5 min ved 13.000 g ved 4 ° C. Den øvre vandige fase blev kasseret, og pelleten blev tørret ved stuetemperatur, opløst i DEPC-behandlet vand, og derefter opbevaret ved -80 ° C. Kvaliteten og integriteten af ​​RNA blev bekræftet ved anvendelse af en NanoDrop enhed. cDNA blev fremstillet ud fra 1 mg totalt RNA ved anvendelse af en First-Strand cDNA Synthesis Kit (Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Tyskland) ifølge producentens protokol.

Cellekultur og transfektion

T24 BCA celler blev opnået og dyrket i henhold til instruktionerne giver ved ATCC. Medier blev suppleret med 10% kalvefosterserum, 2% glutamin og 1% antibiotika (Invitrogen, Carlsbad, CA), og celler blev holdt under en fugtig atmosfære af 5% CO2 ved 37 ° C. For Knockdown eksperimenter blev celler forbigående transficeret med 200 pmol siRNA pulje til tavshed MET (MET siRNAs, Life Technologies, katalognummer 103.545, 103.551, 103.557, 103.767 og 103.769) eller negative kontrol siRNAs, hjælp Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Proliferationsassay

siRNA-transficerede celler blev podet i 24-brønds plader ved en densitet på 1 x 10

4 /brønd. Celler blev derefter farvet med krystalviolet og talt 7 dage senere [22].

forankringsuafhængig blød agar vækst assay

siRNA-transficerede celler (1 x 10

4) blev podet i 3 ml 0,35% agar i FBS-holdigt dyrkningsmedium og overlejret på 2 ml 0,7% agar i FBS-holdigt dyrkningsmedium i 6-brønds plader. Billeder af 3- (4, 5-dimethylthiaz-113 olyl-2) -2, 5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) -stained kolonier blev fanget under et Zeiss mikroskop som tidligere beskrevet [22].

Invasion assay

celler (3 × 10

5 celler /ml) blev talt og podet på collagen-coatede inserter (Millipore Corp., Billerica, MA). Efter 16 timer blev cellerne der migrerede på undersiden af ​​inserterne farvet med krystalviolet-opløsning. Farvestoffet blev ekstraheret fra cellerne under anvendelse af 10% eddikesyre-opløsning, og absorbansen blev aflæst i en Fluostar Omega mikropladelæser (BMG Labtech, Cary, NC) som beskrevet tidligere [22].

Cell apoptose assay

T24 celler transient transficeret med siRNA blev inkuberet i medium med eller uden 10 pM cisplatin i 8 timer. Cellelevedygtighed blev målt i en MTT-assay som tidligere beskrevet [23]. Celle apoptose blev kvantificeret ved måling af metabolisk aktive masse af de behandlede celler efter normalisering mod ubehandlede celler.

sårheling (in vitro bunden) assay

T24 celler dyrket på poly-L-lysin blev co-transficeret med plasmidet, der koder GFP. De blev derefter udsat for

in vitro

scratch assay med billeder taget ved 0 og 16 timer efter inkubation ved hjælp af fluorescens-mikroskop. Celler flyttet fra kanten af ​​bunden mod midten af ​​bunden (markeret med gule stiplede linjer).

Western blot-analyse

Transficerede T24 celler blev hurtigt høstet, flash frosset i flydende nitrogen, og opbevaret ved -80 ° C. Totalt protein blev ekstraheret i lysepuffer [1% Nonidet P-40, 50 mM Tris (pH 7,4), 10 mM NaCI, 1 mM NaF, 5 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid, og Complete protease inhibitor cocktail tablet (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland)] ved de angivne betingelser og centrifugeret ved 12.500

g

i 15 min. 25 ug proteiner pr hver betingelser blev underkastet SDS-PAGE-gel kører, som blev overført til nitrocellulosemembraner til Western blot analyse. Efter blokering med 10% BSA /PBST i 1 time blev membraner inkuberet med specifikke antistoffer mod

c-MET

, MMP2, MMP9 eller β-actin. Pletterne blev visualiseret ved forøget kemiluminescens.

Computational analyse

For at undersøge sammenhængen mellem

c-MET

netværk gener og kliniske parametre i BCA patienter, vi undersøgte udtryk profiler af disse gener i BCA patienter ved hjælp af tidligere opnåede microarray data (tiltrædelse nummer GSE13507). Microarray data var tilgængelige for 165 patienter. Kliniske resultater, herunder progressionsfri overlevelse (PFS), samlet overlevelse (OS), og kræft-specifik overlevelse (CSS) blev opnået fra medicinske journaler. Sammenhængen mellem genekspression og udfald sygdom blev undersøgt ved hjælp af Cox proportionel risiko regressions analyse. Kaplan-Meier (KM) overlevelse kurveanalyse under anvendelse af en delmængde af genekspressionsprofiler fra patienter med “lav” og “høj” ekspression af hvert gen blev anvendt til at identificere virkningerne af

c-MET

netværk genekspression på BCA. Den 50

percentil (median) af genekspression blev anvendt som manchetten-off værdi. Den log-rank test blev udført for at vurdere betydningen af ​​forskelle mellem to overlevelseskurver.

Etisk erklæring

Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i Chungbuk Nationale Universitet. Alle emner forudsat skriftligt informeret samtykke. Prøvetagning og analyse blev godkendt af Institutional Review Board of Chungbuk Nationale Universitet.

Resultater

Kliniske og patologiske karakteristika BCA patienter

Den gennemsnitlige alder af de 165 patienter i undersøgelsen kohorte var 65,2 ± 12,0 år, og den gennemsnitlige opfølgningsperiode var 48,4 måneder. Af de 165 patienter, 62,4% (103/165) havde NMIBC og 37,6% (62/165) havde MIBC. Den gennemsnitlige alder af de 34 patienter i den normale kontrol kohorte var 54,0 ± 10,4 år. Baseline karakteristika for de patienter og kontroller er vist i tabel 1.

Tab af

c-MET

undertrykker BCA celledeling og invasion og øger følsomheden over for cisplatin-induceret apoptose

Tidligere undersøgelser tyder på, at stromale HGF signalering via

c-MET

vej øger invasion og metastase af BCA celler [6, 11, 13]; Derfor søgte vi at bestemme virkningerne af

c-MET

lyddæmpning på proliferation og invasion, og på den apoptotiske respons på cisplatin (et stort kemoterapeutisk middel anvendes til behandling af BCA patienter). Vi fandt, at BCA celler, hvori

c-MET

blev slået ned dannede færre (og mindre) kolonier end de negative kontrolceller, hvilket antyder en reduktion i celleproliferation i blød agar (figur 1A). Cellen invasion assay viste, at BCA celler huser intakt

c-MET

var mere indgribende end dem, hvor

c-MET

blev slået ned.

c-met

-silenced T24-celler var meget mindre invasiv end kontrol celler (ikke-transficerede celler og celler transficeret med kontrol siRNA) (Fig 1B). Vi undersøgte dernæst konsekvensen af ​​

c-MET

tab på celle apoptose i en MTT assay.

c-met

knockdown celler viste øget følsomhed over for cisplatin-induceret apoptose (fig 1C).

Alle eksperimenter blev udført under anvendelse af tre

c-met

Knockdown cellelinier (si

c-MET

-1, si

c-MET

-2, og si

c-MET

-3) transficeret med forskellige

MET

siRNAs , og to kontroller cellelinier (Ctrl og NT). Ctrl, kontrol; NT, ikke-transficeret * p. . 0,05

Tab af

c-MET

hæmmer celle migration af BCA celler ved at nedregulere MMP2 og MMP9

Vi undersøgt cellevandring og MMP2 og MMP9-ekspression i BCA celler. Sårheling assay (også kaldet som in vitro-scratch assay) viste, at

c-MET

-knockdown celler migrerede mindre effektivt end kontrol-celler (Fig 2A). Vi fandt også, at vælte

c-MET

nedreguleret udtryk for MMP2 og MMP9 i BCA celler (Fig 2B).

(A) sårheling assay viser, at knockdown af c-MET inhibitsthe migration af T24-celler. (B) tab af

c-MET

nedreguleret ekspression af matrixmetalloproteinaser (MMP) -2 og MMP-9. Alle eksperimenter blev udført under anvendelse af to

c-met

Knockdown cellelinier (si

c-MET

-1 og si

c-MET

-2) transficeret med forskellige MET siRNAs , og to kontrol cellelinier (Ctrl og NT). Ctrl, kontrol; NT, ikke-transficeret.

Angivelse af

c-MET

korrelerer med OS i MIBC patienter

For at besvare spørgsmålet om, hvorvidt

c-MET Salg netværk gener er involveret i BCA progression og aggressivitet, analyserede vi ekspressionen af ​​mRNA for disse gener i en DNA microarray og sammenlignede resultaterne med sygdomskarakteristika såsom tumorklassificering (G), tumor fase (T, N og M ), tumorstørrelse, gentagelse, progression, og CSS. Yderligere sammenligninger blev derefter udført efter patienter blev kategoriseret i NMIBC og MIBC grupper. Resultaterne viste, at

c-MET

mRNA-ekspression i MIBC patienter korrelerede signifikant med OS (p = 0,023, HR, 2,107; 95% konfidensinterval (CI), 1,110-3,998) (Tabel 2). Disse data blev bekræftet af KM overlevelse kurve analyse (figur 3). BCA patienter med høje niveauer af

c-MET

udtryk viste dårligere overlevelse end dem med lav ekspression (log-rank test, p = 0,020).

Udtrykket af

AXL

kan skelne mellem NMIBC og MIBC patienter og raske kontrolpersoner

Vi næste undersøgte den kliniske sammenhæng mellem kendte

c-MET

partnere,

AXL

PDGFR

, og BCA progression. Resultaterne viste, at

AXL

udtryk klart korreleret med både NMIBC og MIBC. Blæretumorer (NMIBC og MIBC) viste 0,471 gange højere udtryk for

AXL

mRNA end kontrol væv.

AXL

mRNA-ekspression ved NMIBC (p 0,0001, falsk opdagelse sats (FDR) 0,0001) og MIBC (p = 0,0001, FDR = 0,0006) var signifikant højere end i normale kontroller (tabel 3) .

AXL

mRNA-ekspression i NMIBC væv var ca. 1,532 gange højere end i MIBC væv (tabel 3).

Angivelse af

PDGFR

isoformer ændres væsentligt i BCA, og høj ekspression af

PDGFRL

forudser dårlig overlevelse

for at teste, om

PDGFR

er nyttig som et diagnostisk klassifikatør undersøgte vi udtryk for tre forskellige isoformer (dvs. ,

PDGFRA

,

PDGFRB

, og

PDGFRL

). Vi fandt, at ekspressionen af ​​

PDGFR Salg isoformer kunne anvendes til at skelne NMIBC og MIBC prøver fra normale kontroller. Udtrykket af

PDGFRA

mRNA klart diskrimineret blæretumorer (NMIBC og MIBC) fra normale kontrol væv (p 0,0001, FDR 0,0001), med

PDGFRA

udtryk i NMIBC og MIBC bliver cirka 0,274 gange højere end hos kontrolgruppen. Udtrykket af

PDGFRB

var også klart forskellig mellem tumorer og normale væv (p = 0,0001, FDR 0,0001).

PDGFRB

udtryk i NMIBC var signifikant større end i normale kontroller (p 0,0001), men ingen signifikant forskel blev vist mellem MIBC og normale kontroller (p = 0.0698). Tilsvarende

PDGFRL

blev udtrykkes forskelligt i NMIBC og normale kontroller, med en beskeden stigning (0,804 gange) (p 0,0001) i det tidligere. Således er det sandsynligt, at

er PDGFR

ekspression steg i alle typer af BCA. Det er bemærkelsesværdigt, at ekspressionen af ​​

PDGFR

isoformer i væv fra NMIBC patienter var generelt højere end i væv fra MIBC patienter (tabel 4).

Næste, for at forstå den kliniske relevans øget

PDGFR

udtryk i BCA, vi undersøgte den kliniske sammenhæng mellem

PDGFR

isoform udtryk og sygdomsprogression. Vi fandt, at

PDGFRL

udtryk var signifikant korreleret med NMIBC progression (p = 0,046, HR, 3,675; 95% CI, 1,024 til 13,188) (tabel 5). KM overlevelse analyse viste, at NMIBC patienter med høj ekspression af

PDGFRL

viste fattigere PFS end dem med lav udtryk for

PDGFRL

(log-rank test, p = 0,032) (figur 4).

Expression niveauer af

c-MET

netværk gener signifikant korreleret med sygdomsprogression i NMIBC patienter og med OS i MIBC patienter

for at identificere den kliniske betydningen af ​​

c-MET

netværk gener, vi undersøgte sammenhængen mellem

c-MET

netværk genekspression (

c-MET

,

AXL

, og

PDGFR

) og BCA prognose. Angivelse af

c-MET

netværk gener var baseret på en vurdering af risikoscore for hver patient beregnes ved at kombinere ekspressionsniveauerne af alle tre gener. Vi fandt, at ekspressionen af ​​

c-MET

netværk gener korreleret signifikant med sygdomsprogression i NMIBC patienter (p = 0,023, HR, 4,386; 95% CI, 1,221 til 15,757), og med OS i MIBC patienter (p = 0,038, HR, 1,976; 95% CI, 1,039-3,759) (tabel 6). KM overlevelse analyse viste, at NMIBC patienter med høj ekspression af

c-met

netværk gener viste fattigere PFS (log-rank test, p = 0,013) end dem med lav ekspression. Tilsvarende MIBC patienter (log-rank test, p = 0,034) med høj ekspression af c-MET netværk gener viste dårligere OS end dem med lav udtryk (figur 5).

Diskussion

resultaterne af den foreliggende undersøgelse tyder på, at tabet af

c-MET

gør BCA celler mindre invasiv og mere modtagelige for cisplatin. Også udtrykket mønster af

c-MET

netværk gener tillader diskrimination af BCA væv fra normale kontrol væv og synes at forudsige dårlige kliniske resultater i en koreansk patientpopulation.

Aberrant

c-MET

ekspression forekommer i forskellige cancerformer og er forbundet med en dårlig prognose [24]. Overekspression af

c-MET

i BCA er forbundet med dårlig OS og metastase overlevelse [5, 7, 10]. Yeh et al. rapporterede, at overekspression af

c-MET

er positivt forbundet med muskel invasion og dårlig langsigtede overlevelse (p 0,001) [11]. Tidligere rapporter tyder på, at

c-MET

udtryk er tæt forbundet med både tumor aggressivitet og patient overlevelse [5, 7, 10, 11, 18]. Resultaterne præsenteret heri er i overensstemmelse med de i tidligere undersøgelser. Vi fandt, at overekspression af

c-MET

var signifikant forbundet med dårlig overlevelse, især OS i MIBC patienter. Dette antyder, at hæmme

c-MET

udtryk kan spille en vigtig rolle i forebyggelsen af ​​BCA progression og forbedre patientens overlevelse.

In vitro

analyse viste, at

c- MET

knockdown undertrykt celleproliferation, invasion, og migration, og reducerede udtryk for MMP2 og MMP9. Dette blev ledsaget af øget følsomhed over for cisplatin-induceret apoptose. MMP2 og MMP9 nedbryder ekstracellulære matrixproteiner, hvilket letter celleinvasion og metastase [25, 26]. Disse resultater viser, at

c-MET

inhibering vil sandsynligvis reducere kræft invasion og metastase og forbedre overlevelsen af ​​kræftpatienter. Således er en mere fokuseret forståelse for vigtigheden af ​​

c-MET

hæmning nødvendig, hvis vi skal udvikle inhibitorer, der er målrettet

c-MET

i forskellige tumorer. For nylig, flere

c-MET

-targeting lægemidler blev afprøvet i kliniske forsøg, og alle viser lovende klinisk aktivitet med acceptable bivirkninger [27]. For eksempel, tivantinib (også kaldet ARQ197) og en dobbelt inhibitor af

c-MET

/VEGFR2 (foretinib) blev undersøgt i fase I til II kliniske forsøg med patienter med papillær renalcellecarcinom og avanceret hepatocellulært carcinom, henholdsvis [24]. En roman multikinasehæmmer inhibitor af

MET

,

VERFR1

,

AXL

,

TIE2

,

KIT

,

FLT3

og

RET

, kaldet cabozantinib (også kendt som XL184), inhiberer væksten, metastase, og angiogenese i bugspytkirtelkræft og glioblastom, og reducerer modstanden mod gemcitabin. Især kliniske forsøg i metastatisk kastrationsresistent prostatacancer (mCPRC) patienter rapporterede en lovende effekt på PFS, knoglemetastaser, og smerter [28]. Dog kan tumorer, der oprindeligt viser en god respons på markedsøkonomisk hæmmere senere udvikle resistens [24]. Erhvervet resistens over for markedsøkonomisk inhibitorer udvikles via flere mekanismer, herunder genetiske ændringer (fx sekundær

EGFR

T790M mutation), MET forstærkning, og aktiveret signalveje [29]. Således kan multipel kombination target terapi eller co-targeting behandling være nødvendig for at forhindre resistens over for lægemidler og for at opnå positive resultater [24].

Det er vigtigt at undersøge krydstale mellem

c-MET

og andre RTK’er fordi krydstale partnere

c-MET

kan være vigtige biomarkører for co-targeting terapi og bidrage til at forhindre modstand mod individuelle markedsøkonomisk inhibitorer.

RON

,

AXL

og

PDGFR

have en krydstale med

c-MET

. Overekspression af

AXL

og

PDGFR

er forbundet med aggressivitet og prognose af en tumor serie [14-19]. Resultaterne præsenteret heri er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser i denne henseende; der var imidlertid nogle forskelle. I modsætning til undersøgelsen af ​​Endnu et al, som evaluerede sammenhængen mellem

PDGFRA

og BCA progression, vi undersøgte alle tre

PDGFR

isoformer:.

PDGFRA

,

PDGFRB

, og

PDGFRL

. Men kun,

PDGFRL

var forbundet med NMIBC progression. De fleste undersøgelser, der har til formål at identificere en sammenhæng mellem BCA progression og

PDGFR

undersøgte

PDGFRA

og

PDGFRB

isoformer. Derfor er den nuværende undersøgelse er den første til at identificere en signifikant sammenhæng mellem

PDGFRL

udtryk og BCA prognose. Desuden Endnu et al. kun undersøgt roller

AXL

og

PDGFR

i avancerede tilfælde [11]. Her viste vi, at ekspressionen af ​​

AXL

og

PDGFR

skelnes NMIBC og MIBC fra raske kontroller. Især ekspression af begge disse gener var højere i NMIBC patienter end i MIBC patienter. Således

AXL

og

PDGFRL

kan være mere specifik for NMIBC end MIBC. En stor validering er nødvendig for at afklare roller og effekter af

PDGFR

isoformer på BCA (NMIBC og MIBC) prognose.

Vi fandt også, at

c-MET

netværk gen (

c-MET

,

AXL

, og

PDGFR

) udtryk blev tæt forbundet med sygdomsprogression i NMIBC patienter og med dårlig overlevelse (især OS) i MIBC patienter. Disse resultater antyder, at inhibering af

c-MET

pathway kan forhindre sygdomsudvikling i NMIBC patienter og forbedre overlevelse MIBC patienter. Også, kan multi-kombination eller co-targeting behandlinger være nødvendige for at forhindre, at erhvervet resistens. Yeh et al. viste, at 21,5% (14/65) af patienterne co-udtrykkende

c-MET-service /

AXL

/

PDGFR

viste dårlig langsigtede overlevelse (p = 0,015) [11]. Men de kun identificeret en klinisk sammenhæng mellem

c-MET

netværk gener hos patienter med lokalt fremskreden og metastatisk BCA. Her har vi identificeret en klinisk sammenhæng for patienter med NMIBC eller MIBC. Således er den nuværende undersøgelse tyder på, at

c-MET

netværk er en lovende biomarkør og mål for co-targeting narkotika; dette bør testes i kliniske forsøg med både NMIBC og MIBC patienter.

Samlet set antyder disse data, at (1)

c-MET-service /

AXL

/

PDGFR Salg niveauer kan anvendes til at skelne cancerpatienter fra normale kontroller og til at skelne NMIBC fra MIBC; og (2) udtryk for

c-MET

netværk gener signifikant associeret med dårligere overlevelsesrater for BCA patienter.

Identifikation af signalering netværk involverede kan give oplysninger, der vil fremme vores forståelse af mekanismer bag tumor biologi og hjælp til at forudsige potentielle lægemiddel resistens [30]. Vi mener, at

c-MET

netværk genekspression er en hidtil ukendt prognostisk markør for at forudsige, hvilke BCA patienter har en øget risiko for at udvikle aggressiv sygdom. Disse gener kan være en nyttig markør til co-targeting terapi, og forventes at spille en vigtig rolle i at forbedre både respons på behandling og overlevelse BCA patienter.

Støtte Information

S1 Table. Datasæt med tilbagefald, progression, og 5 gener i NMIBC patienter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0134552.s001

(PDF)

S2 tabel. Datasæt med progression, samlet overlevelse, kræft specifik overlevelse, og 5 gener i MIBC patienter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0134552.s002

(PDF)

S3 Table. Datasæt med tilbagefald, progression, og

C-MET

netværk gener i NMIBC patienter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0134552.s003

(PDF)

S4 Table. Datasæt med progression, samlet overlevelse, kræft specifik overlevelse, og

C-MET

netværk gener i MIBC patienter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0134552.s004

(PDF)

Tak

Dette arbejde blev støttet af en Grundforskningsfonden Korea (NRF) tilskud finansieret af den koreanske regering (MSIP) (nr NRF-2014R1A2A1A09006983) og af Basic Science Research Program gennem National Research Foundation Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og Teknologi (2012R1A1A4A01008753). Desuden blev dette arbejde delvist støttet af R01DK100974; U01 DK103260; U24 DK097154; NIH NCATS UCLA CTSI UL1TR000124; en Steven Spielberg Discovery Fund i Prostata Cancer Research Career Development Award; en IMAGINE INGEN IC Research Program Award (til JK). J.K.