PLoS ONE: antitumorvirkninger og mekanisme af Novel emodin rhamnosid Derivater mod humane cancerceller in vitro

Abstrakt

En række nye anthracen L-rhamnopyranosides forbindelser blev designet og syntetiseret og deres anti-proliferative aktiviteter på kræft cellelinjer blev undersøgt. Vi fandt, at en derivat S-8 (EM-d-Rha) inhiberede stærkt celleproliferation af et panel af forskellige humane cancercellelinier, herunder A549, HepG2, OVCAR-3, HeLa og K562 og SGC-790 cellelinjer, og vises IC50 værdier i lave mikro-molær intervaller, som er ti folder mere effektiv end emodin. Desuden fandt vi EM-d-Rha (3-(2”,3”-Di-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-2’,3’-di-

O

-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl)-emodin) væsentlige inducerede cellulær apoptose af HepG2 og OVCAR-3-celler i den tidlige vækstfase. Endvidere EM-d-Rha førte til faldet af mitokondrielle transmembranpotentiale, og opreguleret udtrykkelige af celler apoptose faktorer i en koncentrations- og tidsafhængig måde. Resultaterne viste EM-d-Rha kan hæmme væksten og proliferationen af ​​HepG2 celler gennem vejen af ​​apoptose induktion, og den mulige molekylære mekanisme kan skyldes aktiveringen af ​​intrinsic apoptotisk signal pathway

Henvisning:. Xing Jy, Song Gp, Deng Jp, Jiang Lz, Xiong P, Yang Bj, et al. (2015) antitumorvirkninger og mekanisme af Novel emodin rhamnosid Derivater mod humane cancerceller

In Vitro

. PLoS ONE 10 (12): e0144781. doi: 10,1371 /journal.pone.0144781

Redaktør: Gautam Sethi, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, Singapore

Modtaget: 30 juli, 2015; Accepteret: November 22, 2015; Udgivet: 18. december 2015

Copyright: © 2015 Xing et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Major Program for Videnskab og Teknologi Program for Guangzhou (PX, 11C32100704), Kina, Reserch projekt af kinesisk medicin administration Guangdong-provinsen (px, 2.010.276), Kina og Natural Science Foundation for Unge (GPS pX, B020602), Kina. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

emodin (3-methyl-1, 6, 8-trihydroxyanthraquinone) (figur 1), en vidt udbredt anthraquinon, er afledt af rødder og rodstokke af

Rheum palmatum L

., og andre planter såsom

Polygonum

,

korsved-familien

,

Leguminosae

, og

Liliaceae

. Emodin er en vigtig del af kinesiske urter og strukturelt ligner antracyklin. Det har den samme tricykliske plane kromofor skelet som visse antitumor antibiotika, såsom daunorubicin og mitoxantron som kan indskyde DNA af cancerceller. Antitumoraktiviteten af ​​emodin er veldokumenteret. Det blev påvist, at emodin besidder antiproliferative, forebygge cancermetastase [1-3], sensibiliserende cancerceller for strålebehandling og kemoterapeutiske midler [4-6], antiangiogene [7, 8] og vende multilægemiddelresistent (MDR) af cancerceller [ ,,,0],9]. Det er blevet bekræftet, at emodin er et bredspektret inhiberende middel af cancerceller, herunder leukæmi [10, 11], lungecancer [12-14], human tunge skællede cancer [15, 16], tyktarmskræft [17, 18] , galdeblæren kræft [19-21], pancreascancer [22-24], brystkræft [25-27], menneske livmoderhalskræft [28] og hepatiske carcinomaceller [29-31]. De anticancer mekanismer emodin var involveret i mange biologiske veje [32-34], såsom caseinkinase Ⅱand ERK1 /2. Men emodin er et utilfredsstillende kemoterapeutisk middel til cancer på grund af sin mangel på bioaktivitet, relativt ringe biotilgængelighed og toksicitet in vivo. På trods af dette, emodin, som en naturlig forbindelse, giver fremragende grundlag for at udvikle nye chemoprevention og kemoterapeutiske stoffer mod kræft (figur 1). Da potentielle kandidater fra naturlige produkter blev betragtet som en af ​​de mest produktive strategier i aktuelle lægemiddelforskning og udvikling [35].

Indtil nu, strukturel ændring af emodin hovedsageligt involveret omdannelsen af ​​sidekæden , herunder methyl, hydroxyl og arylringdel. Faktisk blev det vist, at indførelsen af ​​sidekæder, såsom polymethyleneamine, sukker eller heterocyklisk til emodin kan forøget anti-tumor-aktivitet [36-38]. Desuden er de andre opnåede derivater ved at indføre aminogrupper og glycosidbindinger viste også højere anticanceraktivitet [39-41]. Emodin glycosid derivat er blevet isoleret fra

R

.

nepalensis

,

korsved-familien

planter [42],

Rhamnus frangula L

. [43] og

Rumex japonicus Houtt

. [44]. Nogle naturlige emodin glycosid derivater, såsom

frangulin B

og

2

,

3-di-O-acetylfrangulin A

[45-47], viste signifikant højere antitumoraktivitet end emodin. Disse undersøgelser viste, at tilsætning af sukker kæder på C3-OH site på emodin molekyle ikke kun øget sin opløselighed, men også væsentligt forbedret sin anti-tumor aktivitet [46]. Men indtil videre, forskningen på emodin derivater af glycosyleringsmodifikationer er sjældent rapporteret. For nylig har vi syntetiseret en række hidtil ukendte anthracen L-rhamnopyranosides derivater af emodin ved at forbinde L-rhamnopyranosides til et plant aromatisk molekyle (figur 2) [48]. I denne undersøgelse har vi screenet og analyseret antitumor virkninger af alle derivater. Vi fandt en forbindelse, EM-d-Rha, inhiberer kraftigt væksten og proliferation af cancerceller, som var næsten ti folder stærkere end emodin. I denne undersøgelse har vi yderligere demonstreret den antiproliferative aktivitet af EM-d-Rha på cancercelle, og udforskede mekanismen virkning af EM-d-Rha hæmme væksten og proliferationen af ​​HepG2-celler.

Materialer og Methods

emodin derivater syntetiseret

syntesen af ​​målforbindelserne S-2, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9 var den samme som tidligere beskrevet (figur 2) [48].

cellelinjer og kemiske reagenser

Menneskelig lungekræft A549, human hepatisk carcinoma HepG2, human brystcancer MCF-7 , human prostatacancer PC-3, human livmoderhalskræft HeLa, human kronisk myeloid leukæmi K562, human mavekræft SCG-7901, Madin-Darby Canine Kidney celle (MDCK), human normal lever celle L02 og human ovariecancer OVCAR-3 celler opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Alle undtagen leukæmi K562-celler blev dyrket ved 37 ° C i en fugtighed kontrolleret atmosfære indeholdende 5% CO2 i Dulbeccos modificerede Eagle-medium suppleret med natriumbicarbonat (2,2%, vægt /volumen), L-glutamin (0,03%, vægt /volumen), penicillin (100 ug /ml), streptomycin (100 ug /ml) og føtalt bovint serum (FBS, 10%). Leukæmi K562-celler blev dyrket i RPMI-1640 komplet medium suppleret med 10% FBS.

Cisplatin (

TOKYO Chemical Industry Co

.

LTD

), HCPT (

SHAANXI Sciphar Naturprodukter Co

.

Ltd

), dimethylsulfoxid (DMSO,

MP Biomedicals LLC

), kalvefosterserum (FBS, Hyclone, USA), Dulbeccos Modified Eagle Medium ( DMEM,

Hyclone

,

USA

), RPMI Media 1640 (

Hyclone

,

USA

), penicillin-streptomycin Dobbelt antibiotikum (

SIGMA -ALDRICH

), 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT,

Sigma-Aldrich

), 0,25% Trypsin-EDTA (

Gibco

,

USA

), Trypan Blå Stain (

Sigma-Aldrich

), Hoechst 33342 Farvning Solution (

Pik dag Institute of Biotechnology

,

Jiangsu

), Apoptose-DNA stigen ekstraktionssæt (

Pik dag Institute of Biotechnology

,

JiangSu

), Annexin Apoptose Detection kit V-F1IC /7-AAD (

BD Pharmagen Company

,

USA

), PI /RNase farveopløsning (

BD Pharmagen Company

,

USA

), EZNA

TM Total RNA Kit II (

OMEGA

), M-MLV Reverase transkriptase (

Promega

), dNTP (

Promega

), Oligo (

Promega

), GoTaq®qPCR Master Mix (

Promega

).

Cell spredning og levedygtighed celle assay

levedygtighed kræftceller blev vurderet ved MTT-analysen. Kort fortalt blev cellerne inokuleret i 96-brønds dyrkningsplader med en densitet på 1 x 10

4 /brønd med komplet medium indeholdende 10% føtalt kalveserum i et slutvolumen på 0,2 ml. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i mindst 24 timer for at tillade optimal vedhæftning. Når cellerne nåede 60% konfluens, blev de behandlet med cisplatin, HCPT og emodin rhamnopyranosides derivater i forskellige koncentrationer og inkuberet i en fugtreguleret CO 5%

2 inkubator ved 37 ° C i 72 timer. Medium blev udvekslet en gang hver 24 timer. Cell kontrolgruppen og blank gruppe blev oprettet på samme måde, med hver gruppe har seks parallelle brønde. Celle overlevelse blev vurderet ved direkte at tilsætte 22 pi af 5 mg /ml MTT til 0,2 ml medium. Efter tre timer blev formazan bundfald opløses i 200 pi isopropanol per brønd, og fuldstændigt blandet under stuetemperatur. Bagefter blev den optiske densitet af hver brønd detekteret ved 570 nm bølgelængde af iMark mikropladelæser (

Bio-rad

,

USA

). Dette eksperiment blev gentaget mindst tre gange.

Morfologisk analyse

I morfologisk observation blev HepG2-celler i logaritmisk vækstfase podet i en 96-brønds plade med en densitet på 1 x 10

4 /brønd med 0,2 ml komplet medium indeholdende 10% føtalt kalveserum. Celler lodes binde ved 37 ° C i 24 timer. Derefter blev cellerne behandlet med EM-d-Rha og HCPT ved en specifik koncentration. Hver gruppe har seks parallelle brønde. Celler blev inkuberet i en befugtet 5% CO2 inkubator ved 37 ° C i 72 timer. Medium blev udvekslet en gang hver 24 timer. Efter 48 timer blev de vækst- stater og morfologiske ændringer af HepG2-celler observeret med et inverteret mikroskop (

Nikon

,

Japan

).

Fluorescens mikroskopi assay

HepG

2-celler blev inokuleret i to eksemplarer til 3 × 10

5 /brønd densitet i 6-brønds plade og fik lov at vedhæfte ved 37 ° C i 24 timer. Bagefter blev cellerne behandlet med 10 pM HCPT, 25 uM emodin og specifik koncentration EM-d-Rha (0,1 uM, 0,5 pM, 2.5μM) hhv. Celle kontrolgruppen blev sat på samme måde. Derefter blev cellerne inkuberet i en befugtet inkubator med 5% CO

2 ved 37 ° C i 72 timer. Medium blev udvekslet som tidligere beskrevet. I sidste ende blev alle medium kasseret, og cellerne blev fordøjet med 2 ml 0,25% trypsin-EDTA-opløsning ved 37 ° C i 5 min. Efter cellerne blev høstet, blev cellerne vasket med PBS to gange efterfulgt af centrifugering ved 300 x g i 5 minutter. Endelig blev cellerne resuspenderet i 100 pi kold PBS efter supernatanten blev kasseret. Celler blev dyrket i mørke i 10 minutter ved stuetemperatur efter tilsætning af 100 pi 1 mg /ml Hoechst 33342 farveopløsning. Celler blev høstet igen som tidligere beskrevet til at skille farvningsopløsningen. Vask de høstede celler to gange med PBS før der gælder for de rene objektglas. De morfologiske ændringer i celler kerner blev observeret og fotograferet under fluorescens mikroskop (

Olympus

,

Japan

) ved 350 nm excitation bølgelængde. Eksperimentet blev gentaget tre gange.

DNA stigen assay

DNA-stige-dannelse er et vigtigt kriterium for at bestemme celler apoptose. For at bekræfte apoptoseinduktion virkning blev analysen af ​​DNA fragmentation udført. HepG2-celler i logaritmisk vækstfase blev inokuleret i 10 cm culture diameter plader ved en densitet på 5 x 10

5 celler med 12 ml komplet medium indeholdende 10% føtalt kalveserum og lodes binde ved 37 ° C i 24 timer. Bagefter blev cellerne behandlet med EM-d-Rha og cisplatin i en specifik koncentration. Celler blev dyrket og høstet som beskrevet tidligere. Endelig DNA af alle prøver blev ekstraheret under anvendelse af apoptose DNA-stige afsløring kit ifølge producentens anvisninger. DNA fragmentering blev analyseret ved elektroforese på en 1,5% agarosegel indeholdende 0,5 mg /ml ethidiumbromid (EtBr) på 5V /cm i 2,5 timer og fotograferet under ultraviolet. Størrelsen af ​​DNA-fragmentering blev sammenlignet med markøren (molekylvægt standard).

Flowcytometrianalyse

Flowcytometrianalyse blev bestemt under anvendelse Annexin V-APC /7-AAD Apoptosis Detection Kit (

BD Parmagen

,

U

.

S

.

A

). HepG

2-celler blev podet ved en densitet på 3 × 10

5 /brønd i plader med 6 brønde og fik lov at vedhæfte ved 37 ° C i 24 timer. Bagefter blev cellerne behandlet med specifik koncentration EM-d-Rha, og dyrket og høstet som beskrevet tidligere. Celler af hver prøve blev resuspenderet i 300 pi kold bindingsbuffer før tilsætning 2.5μL Annexin V-APC konjugat og 5 pi 7-AAD opløsning. Derefter blev cellerne inkuberet i 15 minutter på is i mørke. Cellesuspension blev fortyndet til et slutvolumen på 250 pi med iskold, 1 × Annexin V Binding Buffer. Analysen blev udført ved flowcytometri (

BD FACSCalibur

,

USA

). Scatter plots blev genereret ved hjælp af Cell Quest pro software (

BD Biosciences

,

San Jose

,

CA

). Eksperimentet blev gentaget tre gange.

Analyse af mitokondrie membranpotentiale

HepG

2-celler blev podet i 10 cm culture diameter plader ved en densitet på 5 x 10

5-celler, og lodes binde ved 37 ° C i 24 timer. Bagefter blev cellerne behandlet med 5.0μM EM-d-Rha i 0, 24, 48h og 72h henholdsvis. Celler blev inkuberet i en fugtig inkubator leveres med 5% CO

2 ved 37 ° C i 72 timer. Medium blev udvekslet en gang hver 24 timer. De høstede celler fra hver prøve blev suspenderet i 500 pi PBS før tilsætning af 5 pi Rhodamine123. Derefter blev prøverne inkuberet ved 37 ° C i mørke i 15 minutter. Celler blev igen opsamlet ved centrifugering ved 300 x g i 5 minutter, og supernatanten blev kasseret. Cellepellets blev vasket to gange med 4 ° C PBS. Endelig celler af alle prøver blev resuspenderet i 500 pi PBS. Før du udfører analysen, justere excitation bølgelængde og emission bølgelængde til 480 nm, 520 nm henholdsvis blev A ^ m ændringer i HepG2 mitokondrie målt med et flowcytometer (

BD FACSCalibur

,

BD Biosciences

,

US

). Eksperimentet blev gentaget mindst tre gange.

Cellecyklusanalyse (PI-farvning)

HepG2-celler i logaritmisk vækstfase blev inokuleret i 10 cm dyrkningsplader ved densitet på 5 x 10

5 celler og inkuberet natten over og fik lov at vedhæfte. Efter at være blevet udsat for EM-d-Rha ved specifikke koncentrationer i 48 timer blev cellerne høstet og vasket med koldt PBS to gange. Så de indsamlede celler blev fikseret med 1 ml PBS og 3 ml kold 100% ethanol ved 4 ° C natten over. Derefter blev cellerne igen høstet ved centrifugering ved 300 x g i 10 min. Cellerne blev vasket med koldt PBS og resuspenderet i 450 pi PBS, og derefter behandlet med 50 pi ribonuklease (RNase, 10 mg /ml) ved 37 ° C i 15 min. 500 pi propidiumiodid (PI, 50 ug /ml) blev tilsat til prøverne. Efter at cellerne var inkuberet i 30 minutter ved 4 ° C i mørke, blev fordelingen cellecyklus måles med et BD FACSCalibur flowcytometer (

BD Biosciences Salg,

USA

), og 10,000cells blev talt for hver prøve. Procentdelen af ​​celler i forskellige faser af cellecyklussen blev analyseret ved flow Jo (

BD Biosciences

,

USA

). Eksperimentet blev gentaget tre gange.

Gene analyse ved RT-qPCR

HepG

2-celler blev podet i 6-brønds dyrkningsplader ved en tæthed på 3 x 10

5 celler /brønd, og fik lov at vedhæfte ved 37 ° C i 24 timer. Derefter blev cellerne behandlet med specifikke koncentrationer af EM-d-Rha og inkuberet i en fugtig inkubator leveres med 5% CO

2 ved 37 ° C i 48 timer. Medium blev ændret én gang hver 24 timer. Bagefter mRNA blev ekstraheret fra hver gruppe ved hjælp E.Z.N.A.

TM Total RNA Kit II ifølge producentens anvisninger. Det ekstraherede mRNA blev opløst i 20 pi ddH

2O (

Qiagen

) indeholdende diethylpyrocarbonat (DEPC). Koncentrationen af ​​mRNA blev kvantificeret med en NanoDrop ND-100-enhed (Thermo Fisher Scientific). cDNA blev syntetiseret under anvendelse af 3 ug af det ekstraherede mRNA fra hver prøve med PCR-system (

BIO-RAD

,

USA

). CDNA-syntesereaktionen blev fremstillet ifølge producentens anvisninger ved at blande 3 ug mRNA, 4.0μL 5 × MMLV buffer, 3 pi oligodT18, 0,5 pi 10 mM dNTP-opløsning, 0.8μL RNase inhibitor, 3.7μL MMLV RTase, og 6.0μL DEPC ddH

2O i PCR-rør. Reaktionen betingelse var 5 min ved 70 ° C, 60 min ved 42 ° C og 10 min ved 4 ° C. Produkterne blev anvendt til efterfølgende RT-qPCR analyse. Niveauet af mRNA-ekspression blev målt ved RT-qPCR ved hjælp af en CFX96

TM C1000 Real-Time PCR System (

BIO-RAD

,

USA

) .De primere blev designet ved hjælp idt .dna softwaresystem (http //www.idtdna.com). De specifikke primere var: Cyto C: 5′-AGATGGTGAGCACAAGGTAAG-3 ‘(fremad), 5’CTCACTGTCCCACAAAGATACA -3 «(tilbage); Caspase 3: 5’CCTACAGCCCATTTC TCCATAC-3 ‘(fremad), 5′-GCCTCACCACCTTTAGAACAT- «(tilbage); β-actin: 5’-GGACCTGACTGACTACCTCAT-3 ‘(fremad), 5′-CGTAGCACAGCTTCTCCTTAAT-3’ (revers). Produktet størrelser af Cyto C, caspase 3 og β-actin var 91bp, 125bp og 107bp, hhv. PCR-reaktionen blev udført i et slutvolumen på 20 pi anvendelse af et optisk 96-brønds bakke. Reaktionsblandingen bestod af 10 pi SYBR I grøn Mix /GoTaq®qPCR

Master Mix (

Promega

), 0,3 pi af hver primer (10 uM), og 1,0 pi cDNA template. PCR cycling betingelse var en cyklus af 5min ved 95 ° C, 39 cyklusser og hver blev bestod af 15 sekunder ved 95 ° C, 15 sekunder ved 62 ° C og 30 sekunder ved 72 ° C med endelig ekstension ved 60 ° C i 5 sekunder. Den termiske parameter smelte blev undersøgt for at vurdere homogenitet PCR. Hver prøve blev analyseret firdobbelt og middelværdien blev anvendt til yderligere analyse. MRNA ekspressionsniveauer af hver prøve blev kvantificeret ved måling af tærskelværdi cyklus (CT) værdier af gener. De relative værdier af målgenekspression blev beregnet efter CT værdier af målgener og henvisningen genet (β-actin) ved at anvende Livak og Schmittgen metode. Det vil sige, det er lig med 2

-Δ ACt, ACt lig gennemsnittet af Ct for target-genet minus middelværdien af ​​Ct for β-actin-gen, og ΔΔCT lig ACt af den behandlede gruppe minus ACt for kontrolgruppen.

Western blot-analyse

HepG

2-celler blev inokuleret, dyrkes og høstes som beskrevet tidligere. Derefter blev eksperimentet udført på is. Den høstede cellepellet blev vasket med kold PBS inden de resuspenderes i 300 pi cytosol lysepuffer gennem vortex. Derefter celler af alle prøver blev lyseret ved sonikering metode på isen ved hjælp af ultralyd celle disruptor (100 W for 30s × 4 gange). Total protein af hver prøve blev målt ved Bradford-assay under anvendelse af protein kvantificering af reagenser fra Bio-Rad. Alle prøver blev tilsat 2 × loading buffer inden analyse på 12% geler ved SDS-PAGE. Derefter blev proteinerne overført til nitrocellulosemembraner ved elektro-blotting. Membranerne blev blokeret i 1% bovint serumalbumin (BSA) eller 5% mælk opløsning ved stuetemperatur i 30 min, efterfulgt af inkubation med det primære antistof mod kanin (

Univ-bio

,

Kina

) ved 4 ° C natten over. Membranerne blev derefter vasket tre gange med 1 × TBST, hver gang sidste i 5 minutter. Membranerne blev derefter inkuberet med de sekundære antistoffer i 3 timer ved 4 ° C, efterfulgt af vask med 1 × TBST som beskrevet tidligere. Endelig blev de immunoreaktive bånd detekteret og dokumenteret anvendelse af et forstærket kemiluminescerende Western blotting-systemet (

Thermo-videnskabelig

,

USA)

på en Versa Doc imaging system.

Statistisk analyse

Alle data blev præsenteret som gennemsnit ± SEM Den SPSS statistisk software til Windows Version 17.0 blev anvendt til envejs ANOVA-analyse efterfulgt af Tukey HSD test for multiple sammenligninger når det er hensigtsmæssigt. Forskelle i målte variabler mellem to grupper blev sammenlignet ved t-test. P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. GraphPad Prism 5 software (

GraphPad Software

,

Inc

,

San Diego

,

Californien

,

USA

) blev anvendt til analysen. For RT-qPCR og flowcytometri eksperimenter, data var repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg.

Resultater

Cell levedygtighed assay

Vi har testet effekten af ​​forskellige koncentrationer emodin (S-1) og dets derivater (S-2, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9) på levedygtigheder af de testede humane cancerceller linier (fig 2 og tabel 1). Så den halv-hæmmende koncentration (IC

50) værdier blev beregnet ud fra disse data. Dataene viste, at forskellige derivater inhiberer væksten af ​​forskellige cellelinier med varierende grad (tabel 1).

Ifølge virknings- evaluering af standarder for antitumorlægemiddel in vitro-tests, IC

50 værdier af det syntetiserede forbindelse eller planteekstrakt bør være mindre end 10 ug /ml og effektiviteten bør har en dosis-afhængig måde, i mellemtiden den maksimale inhiberende virkning bør overstige 80%. Hvis den testede forbindelse opfylder alle de beskrevne kriterier, blev det anset for at have anti-spredning og inhiberende vækst effekter på cancerceller in vitro.

Som vist i tabel 1, blandt alle de syntetiserede forbindelser, S-8 og S-9-derivater viste stærkere inhiberende virkning på de testede kræftceller end forælder emodin. Faktisk S-8 handle bedre end S-9. Sammenlignet med IC

50 af emodin, IC

50 værdier af S-8 på A549, HepG2, OVCAR-3 og HeLa-celler faldt med 7,52, 19,68, 42,3 og 10,56 gange. I et andet ord, S-8 forbedret anticancer aktivitet med omkring ti størrelsesordener. Især HepG2 og OVCAR-3 celler viste sig at være modtagelige for S-8-derivat.

Struktur-aktivitet analyse af emodin rhamnopyranosides derivater Salg

Cellelevedygtighed assay viste sig at rhamnopyranosides derivater handlet bedre end forælder emodin. Men det er fortsat uklart, hvordan de ændrede kemiske strukturer bidraget til en øget aktivitet. Så vi foreløbig analyseret anticancer struktur-aktivitetsforhold (figur 2 og tabel 1). Fra de in vitro-data, kan det ses, at indførelsen af ​​rhamnose kan bidrage til at forbedre den anticanceraktivitet (figur 2). Imidlertid er den forbedrede aktivitet relateret til den indførte måde rhamnose og den substituerede stilling rhamnose hydroxyl ved acetylgrupper. Hvis kun en rhamnose blev indført i emodin, blev opløseligheden af ​​derivatet forbedret, men anticanceraktivitet var fattige (S-3). Endvidere, når hydroxylgruppen af ​​rhamnose blev disubstitueret med to acetylgrupper. Anticancer aktivitet af den genererede derivat fra 3, 4-hydroxyl af rhamnose disubstitueret med den tilstødende acetyl, er bedre end 2, 3-hydroxyl- eller 2, 4-hydroxyl disubstituerede derivat, dvs. den førstnævnte har en stærk antiprolifertion virkning (S-5). Når emodin rhamnopyranosides derivat havde sine sukker kæder forlænget, blev anticancer aktivitet in vitro væsentligt forbedret (S-8). Tilsvarende, når hydroxylgrupperne i C-1 og C-8 stillingen af ​​emodin er methyleret, dens anticanceraktivitet også blev forbedret (S-9).

inhiberende virkning af EM-d-Rha om multipel cancercelle linjer

for at bekræfte hæmmende virkning og antiproliferativ aktivitet af EM-d-Rha på kræftceller in vitro, og forstå dosis-respons-sammenhæng, vi yderligere gennemført de eksperimenter på forskellige koncentrationer af EM-d-Rha mod flere kræftceller. IC

50 værdier blev beregnet ud fra disse data.

Som vist i tabel 2 og tabel 3, kan vi se, at EM-d-Rha har meget betydelige anti-proliferative virkninger mod forskellige cancercellelinier i en koncentrationsafhængig måde. Men dens halvt inhiberende koncentrationsværdier for normale vævsceller er højere end for cancerceller. Det er muligt, at de væksthæmmende effekter af EM-d-Rha på celler er selektive til en vis grad.

Dosis-respons-kurve af EM-d-Rha mod HepG2

EM-d-Rha udøvede et signifikant anti-proliferativ virkning på HepG2-celler, resultaterne førte os til yderligere at undersøge og sammenligne dosis-respons-kurver for EM-d-Rha med den for emodin, Cisplatin og HCPT. Som vist i figur 3, den vækstinhiberende virkning af EM-d-Rha på HepG2-celler udviste en dosisafhængig måde. Med den stigende af log koncentration af EM-d-Rha, hæmning procentdel af HepG2-celler signifikant forøget (figur 3). Endvidere aktiviteten af ​​EM-d-Rha var stærkere i sammenligning med den for emodin mod HepG2-celler. Det er imidlertid underlegen i forhold til den for cisplatin og HCPT mod HepG2-celler.

Fire kurver repræsenterer dosisresponskurven af ​​HCPT, EM-d-Rha, cisplatin, og emodin mod HepG2 celle fra venstre mod ret igen. Fejlsøjlerne repræsenterer middelværdi ± standardafvigelse (tre gentagelser). Den vandrette akse repræsenterer log-koncentration af EM-d-Rha, den lodrette akse repræsenterer hæmning procentdel.

Virkning af EM-d-Rha på morfologien af ​​HepG2 celler

at se direkte vækstinhiberende virkning af EM-d-Rha på HepG2-celler, vi observerede morfologiske ændringer af HepG2 celler efter behandling (Fig 4). De morfologiske ændringer af cellerne kan afspejle vækst og død tilstand. Som et resultat heraf de ubehandlede HepG2 celler af kontrolgruppen viste en høj sammenløbet af monolag celler og blomstrede i den logaritmiske vækstfase, som havde tydelige morfologiske karakteristika arvehygiejniske celler, såsom intercellulære tætte forbindelser, klar membran, fuld cytoplasma og god refraktive ydeevne ( fig 4A). I modsætning hertil EM-d-Rha-behandlede celler viste tydeligt de morfologiske ændringer af apoptose såsom reduktion i cellevolumen og miste celle-celle-kontakter i en dosisafhængig måde (Fig 4D-4H). Ved behandling med 12.5μM EM-d-Rha, de morfologiske ændringer i HepG2-celler viste lignende funktioner til den af ​​2.5μM HPLC-behandlede (Fig 4C).

Bright-field mikroskopi billeder efter inkubation med HCPT for 48 timer på 0,5 pM; 2.5μM og med EM-d-Rha i 48 timer ved forskellige koncentrationer: 0μM (kontrol); 0,1 uM; 0,5 uM; 2.5μM; 12.5μM; 62.5μM (original forstørrelse 100 ×).

For yderligere at undersøge, om levedygtighed fald i HepG2 celle behandlet med EM-d-Rha skyldes apoptose induktion, vi foretaget den morfologiske observation med fluorescensmikroskopi som har forøget følsomhed og kontrast. HepG2-celler blev farvet med en DNA-fluorescerende farvestof Hoechst 33342, som har høj følsomhed og lav cytotoksicitet. Det kan trænge kræftceller membran og binde DNA og udsender en stærk indigo fluorescens. Hoechst binder DNA ved rillen regioner, der indeholder generøs AT basesekvens. Det har god vandopløselige og stabilitet. Derfor fluorescensmikroskopi kombinerer højeste følsomhed med molekylær specificitet og fremragende billedkvalitet kontrast. For at kontrollere, om testen er vellykket eller ej, vi etablerer HCPT forbindelse som positiv kontrol.

Som det fremgår af figur 5, HepG2 celler viste den typiske apoptotiske nukleare morfologi efter udsættelse for 2.5μM HCPT for 48 timer, og præsenterede celle-til-celle-kontakt tab, nuklear krympning, membran blobbing, DNA kondensation og fragmentering (fig 5C). Tilsvarende, når HepG2 celler blev behandlet med varierende koncentrationer af EM-d-Rha i 48 timer, de klart viste karakteristika nuklear krympning og DNA kondensation, og fremlagt en dosis-afhængig forværret skade (Fig 5D-5F) forskellig side af HepG2-celler løsrevet fra monolaget og flød på dyrkningsmediet, men den apoptotiske nukleare udseende blev ikke observeret i ubehandlet kontrol HepG2-celler i kontrolgruppen syntes ensartet blå fluorescens (fig 5A). HepG2 celler behandlet med 25 pM emodin vises også apoptotiske morfologiske ændringer (figur 5B).

kernerne morfologiske ændringer af HepG2 celler blev observeret med fluorescens mikroskopi efter inkuberet med 25.0μM emodin, 2.5μM HCPT i 48 timer og med EM -d-Rha i 48 timer ved forskellige koncentrationer: 0μM (kontrol); 0,1 uM; 0,5 uM; 2.5μM (oprindelig forstørrelse 400 x). De kondenserede og fragmenterede fluorescerende kerner (hvide pile) af apoptotiske celler er synlige i de behandlede celler, men ikke i kontrol celler.

Virkninger af EM-d-Rha på DNA fragmentering af HepG2-celler

for yderligere at undersøge, om EM-d-Rha førte til DNA-fragmentering af HepG2-celler, som er et vigtigt træk ved celle apoptose. Kerne-DNA’et blev påvist med agarosegelelektroforese metode. Vi fandt også, at EM-d-Rha kan udøve sine apoptotisk induktion virkninger, når HepG2 celler blev behandlet med EM-d-Rha, den ekstraherede DNA fra HepG2-celler forekom typisk stige eller fragmentering form (figur 6), var svarende til hvad DNA fra HepG2-celler behandlet med cisplatin præsenteret, var imidlertid anderledes med DNA formen af ​​de ubehandlede HepG2-celler (figur 6). Resultatet foreslog, at EM-d-Rha dobbelt forårsaget DNA brud på HepG2-celler og induceret apoptose i HepG2-celler

Bane M:. DNA Ladder; Bane 6: Kontrol; Lanes1, og 2: Celler behandlet med 3.0μM og 6.0μM Cisplatin; Bane 3, 4 og 5: Celler behandlet med 2.5μM, 5.0μM og 10,0 pM EM-d-Rha henholdsvis

apoptoseinduktion effekter af EM-d-Rha på HepG2 og OVCAR-3. celler

Sådan påvist endvidere, at EM-d-Rha kan hæmme væksten og proliferationen af ​​HepG2-celler og OVCAR-3 celler via mekanismen for apoptose induktion, vi anvendte også flowcytometrianalyse med den dobbelte farvning fremgangsmåde til Annexin V-APC og 7-AAD (7-amino-actinomycin D). Apoptoseinduktionen aktivitet af S-8 blev detekteret af binder mellem Annexin V og phosphatidylserin (PS), som hovedsagelig distribuere i den cytoplasmatiske side af levende celler, men i den tidlige fase af celleapoptose, PS emigrere fra den cytoplasmatiske side til den cellevæg side, så dette kan generere specifikke binder mellem Annexin V og PS. 7-AAD er en nukleinsyre plet, som kan gennemtrænge cellemembraner på det sene stadium af celleapoptose og de døde celler og længere farve deres kerne rød. Så den kombinerede anvendelse af Annexin V-APC og 7-AAD kan skelne sent apoptotiske celler fra tidlig apoptotiske celler. HepG2-celler og OVCAR-3 celler undergik apoptose efter eksponering for EM-d-Rha på 2.5μM, 5 uM og 10 uM i 48 timer (figur 7 og figur 8). Procentdelen af ​​apoptotiske celler er vist i tabel 4 og tabel 5.

HepG2-celler blev inkuberet i 72 timer med EM-d-Rha ved 0, 2.5μM, 5 uM, 10 uM, hhv. Og cellerne blev farvet med FITC konjugeret Annexin V og 7-AAD. A: Repræsentative dot plots af Annexin V-FITC /7-AAD-farvning. a: kontrol, 72 timer; b: 2.5μM EM-d-Rha, 72h; c: 5 uM EM-d-Rha, 72h; d: 10 pM EM-d-Rha, 72 timer. 3-(2”,3”-Di-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-2’,3’-di-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl)-emodin

Be the first to comment

Leave a Reply