PLoS ONE: Naringenin Fald invasiv og metastase ved at hæmme TGF-β-induceret epithelial til Mesenchymale Transition i kræft i bugspytkirtlen Cells

Abstrakt

Epithelial til mesenkymale overgang (EMT) fremmer cellulær motilitet, invasionsevne og metastase under fosterudviklingen og tumorigenese. Transformerende vækstfaktor-β (TGF-β) signalvejen er en vigtig regulator af EMT. En masse af beviser tyder på, at denne proces er Smad3-afhængig. Heri viste vi, at eksponering af aspC-1 og panC-1 bugspytkirtelkræftceller til TGF-β1 resulterede i karakteristiske morfologiske ændringer af EMT, og forbedring af cellemotilitet og gemcitabin (GEM) modstand samt en opregulering af EMT markører gener sådanne som vimentin, N-cadherin, MMP2 og MMP9. Naringenin (Nar) nedreguleret EMT markører udtryk i både mRNA og protein niveauer ved at hæmme TGF-β1 /Smad3 signalvej i bugspytkirtelkræftceller. Derfor Nar undertrykte migration og invasion celler og vendes deres modstand mod Gem in

Henvisning:. Lou C, Zhang F, Yang M, Zhao J, Zeng W, Fang X, et al. (2012) Naringenin Fald invasionsevne og Metastase ved at hæmme TGF-β-induceret epithelial til Mesenchymale Transition i bugspytkirtelkræftceller. PLoS ONE 7 (12): e50956. doi: 10,1371 /journal.pone.0050956

Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA

Modtaget: 24. februar, 2012; Accepteret: 29 Okt 2012; Udgivet: 26 december, 2012 |

Copyright: © 2012 Lou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Nature Sciences Foundation of China (81173633), tilskud fra stat Key udviklingsplan Project (2011CB707705), Research Foundation of Department of Health i Heilongjiang provinsen (2010-107) og opstart Fund af The Affiliated Third Hospital Harbin Medical University (JJ2010-15). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er en yderst aggressiv tumor karakteriseret ved tidlig hematogenic og lymphogenic spredning og høje lokalt recidiv [1]. Den manglende af den kliniske behandling af kræftpatienter er ofte tilskrives lægemiddelresistens og tumormetastaser [2]. Der er dog stadig ingen effektiv terapi til rådighed til at vende multiresistens og forhindre aggression og metastase af pankreatisk tumor [3], [4], [5]. Således kan en bedre forståelse af resistens over for lægemidler og metastase i bugspytkirtelkræft føre til udvikling af mere effektiv terapeutisk strategi.

I løbet af de sidste mange år, akkumulerende beviser tyder på, at epitelial til mesenkymale overgang (EMT) spiller en vigtig rolle i tumorudvikling, metastase og medikamentresistens i forskellige faste tumorer, herunder pancreascancer [6], [7], [8]. Denne proces er karakteriseret ved tab af epitel- og erhvervelse af mesenchymale egenskaber [9], [10]. Under EMT progression, ekspressionen af ​​mesenchymale markører, såsom vimentin, N-cadherin og /eller fibronectin, forøges, i kontrakt, der af epitel adhæsionsmolekyler, herunder E-cadherin eller /og cytokeratiner, formindskes. Desuden epitelcellerne også få øget aktivitet af matrixmetalloproteinaser (MMP’er), herunder MMP2, MMP3, MMP9, der bidrager til en invasiv og metastatisk fænotype [11], [12]. Da det er kendt, at tumorcellemetastase er den førende dødsårsag for kræftpatienter, kontrol med EMT-processen fortsat en prioritet for bugspytkirtelkræft terapi.

Tidligere undersøgelser har afsløret, at transformerende vækstfaktor-β1 (TGF- β1) og andre vækstfaktorer spiller afgørende roller i kørsel EMT i patogenesen af ​​kræft i bugspytkirtlen [13], [14], [15]. TGF-β overekspression fremmer tumormetastase i den sene fase af tumor [16]. Udvikling af TGF-beta signalering hæmmere er blevet betragtet som en attraktiv måde at forhindre tumor metastaser. I øjeblikket er der blevet udviklet en række injicerbare proteinbaserede TGF-β-inhibitorer, herunder antistoffer, som afbryder TGF-β ligand binding til receptoren, og oligonukleotider målrettet mod TGF-β1 mRNA [17], [18], [19]. Småmolekylære inhibitorer med et specifikt mål i denne signalvej har betydelige fordele i stabilitet og biotilgængelighed sammenlignet med makromolekylære kandidater. Indtil dato har flere småmolekylære inhibitorer vist sig at have hæmning virkninger på TGF-β-receptorfunktion [20], [21].

Vore nylige undersøgelser har vist, at Naringenin (Nar, 4 ‘, 5, 7-trihydroxy flavanon), en naturlig fremherskende flavanon, inhiberede signifikant transkriptionen af ​​TGF-β1-inducerede Smad3, og reducerede binding sandsynlighed for TGF-β1 til dens specifikke receptor TβRII hæmmer derved receptordimerisering og den efterfølgende nedstrøms signaltransduktion. Desuden kan Nar øge antitumorvirkningen af ​​doxorubicin til A549 og MCF-7-caner celler ved selektivt at hæmme aktiviteten af ​​multilægemiddelresistens-associeret protein, men ikke p-glycoprotein [22], [23], [24], [25 ]. Disse resultater viste også sin potentiale i behandlingen af ​​kræft som et TGF-β signalering antagonist.

Her forsøger vi at løse hvorvidt Nar udøver sine anti-metastatiske og anti-resistente virkninger på pancreas tumorceller ved at forhindre tumor celler EMT gennem ned regulerer TGF-β /Smad3 signalvejen. Denne undersøgelse kan give rimelige forklaringer på Nar anti-tumor effekt og terapeutiske fordele i kombination af Nar med andre anti-cancer medicin.

Resultater

Nar vender TGF-β1-induceret modstand mod gemcitabin i aspC-1-celler

Tidligere undersøgelser har vist, at aspC-1 og Panc-1 bugspytkirtelkræftceller var resistente over for gemicitabin (GEM) og havde en evne til invasionsevne og metastase [26]. Perle er en fælles kemoterapeutisk lægemiddel til patienter med kræft i bugspytkirtlen i klinikken. For at undersøge, om Nar øger følsomheden af ​​disse to cellelinjer til perle, vi bestemt potentielle toksicitet perle til aspC-1 og Panc-1 celler ved MTT assay i nærvær eller fravær af Nar. Som vist i figur 1A og B, eksponering af aspC-1 og Panc-1-celler til Nar i 72 timer førte til IC

50 (50% vækstinhiberende koncentration) værdier på 347 ± 13,6 pM og 541 ± 11,9 pM, henholdsvis. Nar lidt forøget celleproliferation op til 100 uM. Endvidere har vi målt den cellulære levedygtighed efter 24 timer forbehandling af 50 uM Nar, efterfulgt af 72 h behandling med forskellige koncentrationer af perle i aspC-1 celler. Den IC

50 værdier var 5,3 ± 0,4 uM for perle alene og 2,6 ± 0,4 uM for perle i tilstedeværelse af Nar, hvilket indikerer Nar øger cytotoksicitet af Gem til ASPC-1 celler (figur 2A). Som TGF-β signalvej spiller en vigtig rolle ved at fremme resistens af tumorceller over for kemoterapi, vi undersøgte virkningerne af Nar på cytotoksiciteten af ​​perle i celler stimuleret med TGF-β1. Som forventet, TGF-β1 stimulation forbedret aspC-1 celler resistens over for perle sammenlignet med de ubehandlede celler (IC

50 10 pM versus 5,3 ± 0,4 uM Figur 2B). Vores tidligere undersøgelser har allerede vist, at Nar væsentligt reduceret serum TGF-β1 niveau i bleomycininduceret lunge fiber model, og som følge heraf forhindres tumorcellemetastase til lungen [22]. Derfor formoder vi, at Nar kan have en evne til at vende TGF-β1-inducerede modstand af aspC-1-celler i Gem. Eksperimenter blev udført for at teste ideen. Cellerne blev forbehandlet med 5 ng /ml TGF-β1 i 24 timer, efterfulgt af forskellige koncentrationer af perle i nærvær eller fravær af 50 uM Nar i 72 timer blev levedygtigheden detekteret ved MTT-assayet. Som vist i figur 2B, tilsætning af TGF-β1 forøgede modstand af aspC-1 celle til perle mens Nar vendt TGF-β1-inducerede modstand. Disse resultater antyder, at TGF-β1 spiller en kritisk rolle i resistensen af ​​tumorceller over for kemoterapeutiske lægemidler, såsom perle.

(A) aspC-1 eller (B) panC-1-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af Nar i 24 timer, 48 timer og 72 timer. Levedygtighed af cellerne blev undersøgt af MTT. Data repræsenterer gennemsnit ± SD (

n

= 4) fra individuelle eksperimenter point. IC50 blev udført under anvendelse af SPSS software.

(A) 50 pM Nar forbehandling i 24 timer, efterfulgt af kæmning med forskellig dosis perle i 72 timer i aspC-1-celler. (B) Forbehandling med 5 ng /ml TGF-β1 i 24 timer, efterfulgt af behandling med forskellige koncentrationer af perle i nærvær eller fravær af 50 uM Nar for næste 72 timer blev levedygtigheden af ​​celler vurderet ved MTT-assayet. Hvert punkt repræsenterer middelværdi ± SD (

n

= 4) fra tre uafhængige forsøg. * P 0,05; ** p 0,01; *** p 0,005

Nar undertrykker TGF-β1-induceret migration og invasion af Panc-1 og ASPC-1 celler

Derefter bestemte vi, om Nar kan inhibere TGF-β-induceret EMT, som også forbinder med cellulære motilitet. Som forventet morfologiske ændringer, herunder reducerede celle-celle-kontakt og krydset, den skabte fiber og nåletyper falske ben, blev observeret efter at cellerne blev behandlet med TGF-β1 i 30 timer (figur 3E), hvilket indikerer EMT forekomst. Derudover en sårhelende assayet blev udført, viste det resultat, at behandling af panC-1 celler ved TGF-β1 i 36 timer førte til ca. 80% sårlukning (fig 3AJ) sammenlignet med de ubehandlede celler (Figur 3AG), hvilket indikerer, at TGF-β1 markant accelereret EMT-processen. Men behandling med 50 pM eller 100 uM Nar i 36 h eller 72 timer hæmmede markant de TGF-p1-induceret celle morfologiske ændringer og sårlukning (Figur 3Akl

vs

j; Figur 3Aqr

vs

s). Desuden i fravær af TGF-β1, behandling med 50 pM eller 100 uM Nar i 72 h også signifikant forhindret omkring 60% sår celler lukning (Figur 3Ano

v.s.

M). Vore data viser, at endogen eller exogen TGF-β1 effektivt forøger migrationen panC-1 celler, men Nar kan vende denne proces. Lignende resultater blev også observeret i aspC-1-celler (data ikke vist).

(A) Sårheling assay Panc-1-celler dyrket til 80% konfluens. Monolagene blev indridset med en pipettespids i det centrale område af kulturen. TGF-β1 og Nar blev tilsat som viste tider. Fotografier blev taget under anvendelse af fasekontrastmikroskopi (forstørrelse på x 100) umiddelbart efter incision og efter 36 timer og 72 timer af behandlingen. (B og C) Transwell invasion assay (B for aspC-1 celler og C i panC-1cells). I Matrigelcoatede celledyrkningsinsert blev celler behandlet som beskrevet i Materialer og metoder. De celler, der havde invaderet til den nedre overflade af filteret blev farvet med krystalviolet og fotograferet. (D) Transwell migration assays. I ikke-Matrigelcoatede celledyrkningsinsert, at kvantificere migration blev de farvede celler lyseret i DMSO og deres absorbans blev målt. (E) Cell blev behandlet med 5 ng /ml TGF-β1 i 30 timer blev fænomenet EMT observeret af celle morfologiske ændringer. Disse forsøg blev udført tredobbelt. * P 0,05; ** P 0,01; *** P. 0,005

Desuden har vi undersøgt virkningerne af Nar på TGF-β1-induceret invasion og migration i aspC-1 og panC-1 celler ved hjælp Transwell analyser. Resultaterne viste, at TGF-β1 behandling markant forbedret evne aspC-1 (figur 3Bd

vs

a) og panC-1-celler (figur 3Cj

vs

g) krydser basalmembranmatrix . Panc-1 celler udviste mere aggressiv invasiv aktivitet end ASPC-1 celler reagerer på TGF-β1 stimulation (figur 3Cj

v.s.

Figur 3BD). Interessant, 50 uM Nar hæmmede i væsentlig grad den invasive evne aspC-1 (figur 3BB

vs

a) og panC-1-celler (fig. 3C h.

vs

g) i fravær eller tilstedeværelsen af ​​TGF-β1 (figur 3B e

vs

d;. Figur 3Ck

vs

j), 100 uM Nar viste mere markant hæmmende effekt end 50 uM Nar disse to celle linjer (Figur 3BC

vs

bf

vs

e Figur 3CI

vs

hl

vs

k). I Transwell migrere assay, at kvantificere de migrerede celler, vi opløste cellerne og derefter farvet med krystalviolet i DMSO. Absorbans blev målt ved 490 nm under anvendelse af en pladelæser. Lignende resultater blev også opnået (figur 3D). Tilsammen tilbyder vi stærke beviser, at Nar stærkt kan hæmme både basal og eksogene TGF-β1-induceret migration og invasion i ASPC-1 og panC-1 celler.

Nar hæmmer processen med epitelial til mesenkymale overgang ( EMT) ved at reducere ekspression af mesenchymale markører

for at teste, om Nar regulerer produktionen af ​​ekstracellulær matrix og ekspressionen af ​​EMT markørgener i aspC-1 og panC-1-celler i nærvær eller fravær af TGF-β1, real-time RT-PCR-analyse blev udført. Primerne ifølge mesenkymale markører blev vist i tabel 1. Totalt RNA blev isoleret fra cellerne behandlet med vehikel eller 5 ng /ml TGF-β1 eller 5 ng /ml TGF-β1 plus Nar (50 uM, 100 uM). Celler behandlet med 5 ng /ml TGF-β1 i 24 timer førte til betydelig stigning i EMT markers mRNA’er, såsom vimentin, N-cadherin, MMP2 og MMP9. I mellemtiden fandt vi, at niveauerne af TGF-β1-inducerede EMT markører mRNA blev væsentligt reduceret i de Nar-behandlede celler (figur 4A, B, C F). Båndene blev kvantificeret ved scanning densitometri under anvendelse af en Bio-Rad-model 620Video densitometer med en 1-D Analyst software til Macintosh. Disse data viste, at Nar tydeligvis faldt udtrykkene for vimentin, N-cadherin, MMP2 og MMP9 proteiner og forbedret E-cadherin ekspression med eller uden TGF-β1 behandling (figur 4G H). Desuden har vi opdaget også en bånd af 68 kDa, en aktiv form MMP2, og et bånd af 72 kDa, forløberen for MMP2. Vores resultater viste, at Nar kunne hæmme TGF-β1-inducerede EMT i aspC-1 og panC-1-celler.

(A-D) Ekspression af mesenchymale markører af processen med EMT i mRNA-niveauet blev målt ved QRT -PCR. AspC-1-celler og panC-1 celler blev forbehandlet med 50 uM eller 100 uM Nar i 24 timer efterfulgt af fravær eller nærvær af TGF-β1 i yderligere 24 timer (A: vimentin, B: N-cadherin, C: MMP2, D: MMP9).

# p 0,05,

## p. 0,01

v.s

Control.

* p 0,05, ** p. 0,01

v.s

5 ng /ml TGF-β1 alene. (E og F). Proteinet ekspression af EMT markører blev målt ved Western blot (F for aspC-1-celler og G i panC-1 celler). (G og H) Værdi af densitometrisk scanning blev anvendt til at kvantificere ændringerne af mesenchymale markører (H for aspC-1-celler, I for panC-1 celler). Data, var middel ± SD fra tre uafhængige forsøg.

Nar udøver sin virkning på TGF-β1 signalvej ved at regulere Smad3

I klassiske Smad-afhængige veje, TGF β-induceret aktivering af receptor-komplekset fører til phosphorylering af Smad2 og Smad3 i samarbejde med Smad4 som TGF-β-induceret transskription regulatorer. I modsætning hertil Smad6 og Smad7 hæmmer aktivering af receptoren-regulerede Smads [27], [28], [29]. I den foreliggende undersøgelse, udførte vi RT-PCR for at undersøge genekspression involveret i reguleringen af ​​TGF-β-signalering. AspC-1 og Panc-1-celler blev forbehandlet med 50 uM eller 100 uM Nar i 24 timer, efterfulgt af behandling med eller uden TGF-β1 i yderligere 24 timer. MRNA-niveauer af TβRI, TβRII, Smad2, Smad3, Smad4, og Smad7 blev overvåget ved RT-PCR og kvantificeres. Resultaterne viste, at Nar havde nogen indflydelse på mRNA-niveauer af TβRI, TβRII og Smad2, selv ved høje koncentrationer (100 um) (figur S1). Imidlertid behandles med TGF-β1, Nar markant nedreguleres mRNA-niveauet af Smad3 (figur 5A C. bane 5, 6

v.s

2). I fravær af TGF-β1, 50 uM Nar havde kun en relativt lille indflydelse på Smad3 mRNA og protein niveau (figur 5A C. bane 3, 4

vs

1), men 100 uM Nar tydeligvis faldet Smad3 proteinniveau (figur 5Fab. bane 6

vs

1). Disse observationer indikerede, at Nar nedregulerer Smad3 proteinniveauet uafhængig af TGF-β1. I TGF-β-signalvejen, phosphorylering af Smad3 ved TβRII er et vigtigt skridt i signaltransduktion. Så vi yderligere undersøgt, om Nar kan hæmme TGF-β1 inducerede phosphorylering af Smad3. Vi fandt TGF-β1 inducerede en signifikant stigning i niveauet af phospho-Smad3 mens Nar markant reduceret TGF-β1-inducerede Smad3 phosphorylering, hvilken effekt kan være relateret til den formindskede Smad3 proteinniveauet induceret af Nar. Desuden er denne inhiberende virkning af Nar var parallelt med dets doseringer anvendes til behandling af aspC-1 og panC-1 celler. (Figur 5F A b)

Celler blev behandlet med 50 pM og 100 pM Nar eller 10 uM og 20 uM SB431542 i 24 timer før med eller uden 5 ng /ml TGF-β1 tilsætning i 24 timer inkubation i RT-PCR eller 36 timer inkubation i western blot. (A og B, E) mRNA-niveauet af TβRI, TβRII, Smad2, Smad3 og Smad7 blev bestemt ved RT-PCR (A for aspC-1 celler behandlet med Nar, B for panC-1 celler behandlet med Nar, E for Panc -1 celler behandlet ved SB431542, resultatet var tilsvarende for aspC-1-celler, data ikke vist). (C og D) Værdien af ​​densitometrisk scanning blev anvendt til at kvantificere ændringerne i mRNA Smad3 og Smad7 (C i aspC-1 celler og D for panC-1 celler behandlet med Nar). (F og G) Niveauet af p-Smad3 blev målt ved Western blot. (F. a for aspC-1 celler og F. B for panC-1 celler behandlet med Nar, G i panC-1 celler behandlet med SB431542, Resultatet var tilsvarende for aspC-1-celler, data ikke vist). Data, var middel ± SD for tre individuelle eksperimenter.

For yderligere at demonstrere rolle nedregulering af Smad3 på den hæmmende virkning af Nar på TGF-β1-medieret fænotype såsom migration, vi undersøger, om eksogen overekspression af Smad3 kan vende hæmmende virkning af Nar. Vi konstruerede GFP-Smad3 ekspressionsvektor under anvendelse fuldlængde human Smad3 fragment fra pCMV5B-Smad3 vektoren [38] ligeret ind i GFP-C1-konstruktion (Clonetech). Derefter undersøgte vi virkningen af ​​Nar for migration af panC-1 celler transficeret med GFP-Smad3 og GFP-C1 kontrol plasmid. Resultaterne viste, at både Smad3 mRNA og protein-niveauer blev øget væsentligt i de GFP-Smad3-transficerede celler sammenlign GFP-C1- transficerede celler (figur 6C B) viste, at 100 pM Nar naturligvis inhiberede TGF-β1-inducerede migration i GFP-C1-transficerede celler (p 0,01), mens exogent overekspression af Smad3 betydeligt svækkede den inhibitoriske virkning af Nar på TGF-β1-induceret migration. Disse data indikerer, at Nar specielt kan inhibere den endogene ekspression af Smad3 og efterfølgende reducerer phosphoryleringen af ​​Smad3 derved nedregulerer TGF-β1-inducerede signal transduktion.

(A) Transwell migration assay, i ikke-Matrigel- overtrukket celledyrkningsinsert, Panc-1 celler blev transficeret med GFP-Smad3 eller GFP-C1-plasmidet i 6 timer, derefter vasket, ændret for at fuldføre DMEM med 0,1% DMSO, 100 uM Nar i 24 timer, derefter udsættelse for 5 ng /ml TGF-β1 eller kombinationen af ​​5 ng /ml TGF-β1 og 100 uM Nar for næste 24 timer. Som beskrevet i Materialer og metoder. De celler, der havde invaderet til den nedre overflade af filteret blev farvet med krystalviolet og fotograferet. (B) Transwell migration assays. I ikke-Matrigelcoatede celledyrkningsinsert, at kvantificere migration blev de farvede celler lyseret i DMSO og deres absorbans blev målt. Disse forsøg blev udført tredobbelt. * P 0,05; ** P 0,01. *** P 0,005. (C) og (D) Panc-1-celler blev transficeret med GFP-Smad3 eller GFP-C1-plasmidet i 6 timer, derefter vasket, ændret til komplet medium, 100 uM Nar i 24 timer, derefter udsættelse for 5 ng /ml TGF β1 eller kombinationen af ​​5 ng /ml TGF-β1 og 100 uM Nar for næste 24 timer for QRT-PCR (C) eller western blot (D).

på den anden side, SB 431.542, en velkendt specifik inhibitor af TβRI, er blevet vist at inhibere phosphorylering af Smad2 /Smad3 [30]. I vores undersøgelse, SB-431.542 ikke påvirke mRNA ekspression af Smad3 og Smad7 (figur 5E), men reducerede phosphorylering af Smad3 i Panc-1-celler (figur 5G). Den tilsvarende resultat blev også observeret i aspC-1-celler (data ikke vist). Vore data antyder, at Nar har en anden mekanisme end SB-431.542 til inhibering TGF-β-medierede biologiske virkninger. Tilsammen vores resultater tyder på, at Nar udøver sin virkning på TGF-β1 signalvej hovedsagelig gennem nedregulere Smad3.

Diskussion

EMT fremmer tumor celler migration og invasive fra oprindelsesstedet og diffusion til fjerne væv og organer, og også medierer tumorceller udvikler resistens over for kemoterapeutiske lægemidler. Denne proces er udløst af både den autokrine og parakrine TGF-p-signaler. Flere undersøgelser har vist, at TGF-P alene eller i kombination med andre vækstfaktorer, såsom EGF spiller afgørende roller ved mediering EMT i mange maligne tumorer, herunder pancreascancer [31], [32]. Således regulerer TGF-β signalvej er effektiv strategi til at kontrollere udviklingen af ​​kræft.

I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at Nar forøget følsomhed af bugspytkirtelkræftceller i Gem i nærvær eller fravær af TGF-β1. TGF-β1 væsentligt forbedret modstandsdygtighed over aspC-1-celler til perle men Nar helt tilbageførte TGF-β1-induceret resistens, hvilket antyder, at Nar kan blokere TGF-β1 mediere signaltransduktion. Dette fund var også i en god aftale med vores tidligere rapporter om, at Nar har evner til at hæmme TGF-β1 sekretion og reducere bindende sandsynlighed for TGF-β1 til dens specifikke receptor TβRII [22], [23]. En af vores tidligere undersøgelser viste, at Nar forøget anti-tumor effekt af doxorubicin til A549 og MCF-7 caner celler ved selektivt modulerende medikament efflux-pathways [25]. Andre forskere fandt også, at Nar udviste høje antineoplasic aktiviteter mod klassisk MDR sublinje afledt af gastrisk (EPG85-257), pancreas (EPP85-181), og colon (HT-29) carcinomer cancercellelinier samt andre afledte multiresistente cellelinier [33]. Disse data antyder, at der kan være en sammenhæng mellem TGF-β1 signalvej og multilægemiddelresistens veje, der skal undersøges i fremtiden.

Desuden Nar signifikant hæmmet TGF-β1-inducerede EMT ved at reducere ekspressionen af vimentin, N-cadherin, MMP2 og MMP9 i både mRNA og protein niveauer. Vi undersøgte derefter TGF-β /Smads signalvej gener ekspression i aspC-1 og panC-1cells, og fandt, at Nar specifikt nedreguleret Smad3 ekspression i disse to cellelinjer og exogene ekspression af Smad3 effektivt kunne omgå den inhibitoriske virkning af Nar på TGF-β1-induceret EMT fænotype såsom migration. Andre forskere rapporterede, at Smad ubiquitinering regulatoriske faktorer (Smurfs) induceret Smad3 ubiquitinering for proteasomalaktivitet nedbrydning resulterer i at forstyrre dannelsen af ​​Smad3 komplekserne at slukke TGF-β signalering transduktion [34]. I vores undersøgelse, kan virkningerne af Nar faldende Smad3 proteinniveauet være uafhængig af TGF-β1, hvilket præcise mekanisme er stadig uklar. Vores resultater tyder dog klart, at Nar forhindrer EMT proces af tumorceller ved nedregulere TGF-β /Smad3 signalering transduktion. Dette fund giver en fornuftig forklaring hvorfor Nar har gunstige anti-tumor metastatisk effekt in vivo med let toksicitet til tumorceller in vitro [22], [35]. SB-431.542 [36], en lille molekylær hæmmer af TβIR, var blevet vist at inhibere TGF-β-induceret EMT ved at regulere phosphorylering af Smad2 /3 i tumorceller, hvilket er i overensstemmelse med vores resultater. Forskellen mellem Nar og SB-431.542 i reguleringen af ​​TGF-β /Smads signal sti antyder, at de kan have forskellige biofunctions.

Som konklusion, Nar undertrykker migration, invasion og perle modstand bugspytkirtelkræftceller ved at hæmme TGF-β /Smad3-medieret EMT. Disse resultater viser, at Nar kan tjene som en ny potentiel middel til forhindring tumorudvikling og metastase til kliniske anvendelser.

Materialer og metoder Salg

Materialer

Naringenin (Nar) blev købt fra Shanxi Huike Botanisk Development Co (Kina). SB-431.542 blev leveret af Sigma-Aldrich Co. (Tyskland), blev de opbevaret som en stamopløsning i dimethylsulfoxid (DMSO), som blev anvendt efter fortynding med medium til hvert assay. Koncentrationen af ​​DMSO oversteg ikke 0,05% i nogen assay. Cytokin rekombinant human TGF-β1 blev anskaffet fra R & D systemet (Minneapolis, MN, USA) og rekonstitueret i 10 mM citronsyre indeholdende et bærerprotein (0,1% BSA), pH 3,0 til en koncentration på 2 mg /ml. Gemicitabin (perle) blev leveret af Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Co.LTD (kina). Trizol reagens og SuperScript III Platinum To Step QRT-PCR Kit med SYBR Green blev opnået fra Invitrogen ™ (USA). BCA ™ protein Assy Kit var fra Thermo videnskabelig (USA). Sepectra ™ Multicolor Broad Range protein Stige og DL1000bp, DL500bp DNA Ladder markører blev opnået fra TaKaRa Biotechnology Co (Dalian, Kina).

proteasehæmmer og phosphataseinhibitor cocktail 3 blev købt fra Sigma-Aldrich Co. (Tyskland) .Vimentin primært antistof (monoklonalt muse-IgG Sc-32322) blev tilvejebragt af Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA), Cell lyseringsbuffer og Phospho-Smad3 (Rabbit mAb IgG Ser423 /425), E-cadherin (Rabbit mAb), N-cadherin (Rabbit mAb), GAPDH (Rabbit mAb) primært antistof og det andet antistof (anti-kanin-IgG, HRP-bundet antistof og anti-muse-IgG, HRP-bundet antistof) blev købt fra Cell Signaling Technology Inc. (USA). MMP2 antistof (ab80737, mus monoklonalt IgG), MMP9 antistof (ab76003, Kanin monoklonalt IgG) blev købt fra Abcam (Hong Kong). Alle andre reagenser var analytisk rent.

Cellekultur

aspC-1 og Panc-1-celler blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Cellekulturmedium og oksefosterserum blev indkøbt fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Dyrkningskolber og retter var fra Corning (Corning, NY). Celler blev dyrket i RPMI 1640 eller DMEM-medium suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum, penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 U /ml) og dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2. Celler blev subdyrket hver 3-4 d. I hvert assay lægemidlerne blev fortyndet med X-VIVO 15 kemisk defineret serum-frit medium (Lonza, Schweiz)

cellevækstinhiberingen Assay

aspC-1 og panC-1-celler blev udpladet ved en densitet på 10 × 10

3 celler eller 3 × 10

3 per brønd i 100 pi RPMI 1640 eller DMEM-medium i 96-brønds plader og dyrket i 24 t. Celler blev udsat for en række koncentrationer af Nar i 24 timer, 48 timer eller 72 timer blev levedygtigheden af ​​celler målt ved anvendelse methylthiazoletetrazolium (MTT) -metode, som tidligere beskrevet [37]. Kort beskrevet 150 pi MTT-opløsning (0,5 mg /ml i phosphatbufret saltvand [PBS]) blev tilsat til hver brønd. Pladerne blev inkuberet i 4 timer ved 37 ° C. Efter inkubering blev 150 pi DMSO (Sigma) tilsat til hver brønd i 10 minutter ved stuetemperatur. Absorbans blev målt ved 490 nm under anvendelse af en pladelæser (Thermo, Erlangen, Tyskland). Middelværdien procent af celleoverlevelse forhold til den for ubehandlede celler blev estimeret ud fra data fra tre individuelle eksperimenter. Koncentrationen af ​​lægemiddel ved hvilken celle lethaling var 50% blev beregnet ved kurvetilpasning ved anvendelse af SPSS-software (version 12.0, SPSS, Chicago, IL). For kombineret med forskellige stoffer, efter at cellerne var inkubering natten over blev mediet erstattet med frisk medium indeholdende (50 uM, 100 uM) Nar alene eller kombination med TGF-β1 (5 ng /ml) i 24 timer og derefter udsat for perle i yderligere 72 timer blev levedygtigheden af ​​celler detekteres ved MTT-assayet.

sårheling assay

bunden skete over monolaget i aspC-1 celler og panC-1 celler. Celler blev dyrket på plader med 6 brønde og sammenflydende celler i kultur (80%), blev cellemonolag omhyggeligt såret ved at skrabe med en steril plastik pipettespids. Cellerne blev vasket to gange med phosphatbufret saltvand (PBS), behandlet med 5 ng /ml TGF-β1 eller kombinationen af ​​5 ng /ml TGF-β1 og 50 eller 100 uM Nar. For hver ridse blev Fotografier taget ved 0, 36 h, 72 timer ved hjælp af et omvendt mikroskop (NIKON ECLIPSE TS100 10 × 4. Japan) i de samme områder. Hvert forsøg blev udført mindst to gange.

Matrigel invasion og migration assays

Invasion assays blev udført under anvendelse af 24-brønds BD Falcon ™ celledyrkningsinsert (8 um porestørrelse, Becton Dickinson USA). Kort beskrevet blev celler udsået i 60 mm engangs celle dyrkningsskåle (Shanghai sunab Bio-Tech Development Inc. Kina) og blev forbehandlet dem med 50 eller 100 uM Nar i 24 timer, derefter udsættelse for 5 ng /ml TGF-β1 eller kombinationen af ​​5 ng /ml TGF-β1 og 50 eller 100 uM Nar for næste 24 timer. Filteret blev coatet med 15 ul af basalmembran matrix (Vækstfaktor reduceret, phenolrødfrit, LDEV-Free, BD Biosciences). De behandlede celler blev trypsinbehandlet og resuspenderet i X-vivo 15 medium og podet med en tæthed på 3 x 10

4 celler eller 2 × 10

4 per brønd på den øverste kammer. Den nederste kammer blev fyldt med 0,6 ml x-vivo15 med 5% FBS indeholdt med prøver (kontrol, 5 ng /ml TGF-β1, 50 pM og 100 pM Nar, kombinationen af ​​5 ng /ml TGF-p1 og 50 uM eller 100 pM Nar) som en chemic lokkemiddel. Efter assay kamre blev inkuberet i 24 timer i en CO

2 inkubator, ikke-invaderende celler blev forsigtigt fjernet med en vatpind. Filtermembranen blev fikseret med koldt methanol og farvet med krystalviolet i 15 minutter. Cellerne på den øvre overflade blev forsigtigt fjernet med en vatpind, og cellerne på den nedre overflade af filtrene blev shooted under et Leica DM 2500 patologisk billede og analysesystem (Tyskland) ved 50 x forstørrelse. Alle forsøg blev gentaget tre gange. Salg

Migration assays blev udført under anvendelse af 24-brønds BD Falcon ™ celledyrkningsinsert. Kort fortalt blev fuldlængde human Smad3 cDNA amplificeret fra pCMV5B-Smad3 vektoren [38]. Smad3 fragment blev ligeret ind i GFP-C1-konstruktion (Clonetech) for GFP-C1-Smad3 (GFP-Smad3). Panc-1-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM, Gibco) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Hyclone) ved 37 ° C i en CO 5%

2. For transfektion blev Panc-1-celler inkuberet med Opti-MEM-medium (Invitogen) indeholdende GFP-C1 eller GFP-Smad3 plasmid til 6 timer, derefter vasket, ændret for at fuldføre DMEM med 0,1% DMSO, 100 uM Nar i 24 timer, derefter