Abstrakt
Artonin E er en prenyleret flavonoid isoleret fra stammen bark af
Artocarpus elasticus
Reinw. (Moraceae). Denne undersøgelse havde til formål at undersøge de apoptotiske mekanismer fremkaldt af artonin E i et metastatisk human kræft i æggestokkene cellelinje SKOV-3
in vitro
. MTT assay klonogene assay, acridinorange og propidiumiodid dobbelt farvning, cellecyklus og annexin V analyser blev udført for at undersøge tilstanden af artonin E-induceret celledød på forskellige tidspunkter. DNA laddering, aktivering af caspase-3, -8 og -9, multi-parametrisk cytotoksicitet-3analysis ved højinformativ screening, måling af reaktiv ilt generation arter, og Western blot blev anvendt til at undersøge de involverede veje i apoptose. MTT Resultaterne viste, at artonin E inhiberede væksten af SKOV-3-celler, med IC
50 værdier på 6,5 ± 0,5 pg /ml efter 72 timer behandling og viste mindre toksicitet mod en normal human ovarie celle lineT1074, med IC
50 værdi på 32,5 ± 0,5 ug /ml. Resultaterne viste, at artonin E apoptose og cellecyklusstandsning ved S-fasen. Denne forbindelse fremmes også aktiveringen af caspase-3, -8 og -9. Yderligere undersøgelse af udtømning af mitokondrielle membran potentiale og frigivelse af cytochrom
c
afslørede, at artonin E behandling induceret apoptose via regulering af ekspressionen af pro-overlevelse og pro-apoptotiske Bcl-2 familiemedlemmer. Ekspressionsniveauerne af survivin og HSP70 proteiner blev også nedreguleret i SKOV-3-celler behandlet med artonin E. Vi foreslår, at artonin E inducerede en antiproliferativ virkning, der førte til S-fase cellecyklusstop og apoptose gennem dysregulering af mitokondrielle veje, især pro – og anti-apoptose signalveje
Henvisning: Rahman MA, Ramli F, Karimian H, Dehghan F, Nordin N, Mohd Ali H, et al.. (2016) Artonin E fremkalder apoptose via mitokondrie Dysregulering i SKOV-3 æggestokkene cancerceller. PLoS ONE 11 (3): e0151466. doi: 10,1371 /journal.pone.0151466
Redaktør: Irina V. Lebedeva, Columbia University, UNITED STATES
Modtaget: Februar 5, 2015; Accepteret: 29 februar 2016; Udgivet: 28 mar 2016
Copyright: © 2016 Rahman et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inkluderet i papiret
Finansiering:. forfatterne takker Universitet Malaya for at levere de forskningsbevillinger under UMRG projekt (RG077- 12BIO), Institut for Forskning Ledelse og overvågning Research Grant (PG162-2014B) og Ministeriet for videregående Uddannelser Malaysia under High Impact Research Grant (UM-Mohe UM.C /625/1 /HIR /MOHE /SC /09) for deres økonomiske støtte til at udføre denne forskning.
Konkurrerende interesser :. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
kræft i æggestokkene betragtes som den mest dødbringende gynækologisk malignitet [1]. På verdensplan er mere end 230.000 nye tilfælde af kræft i æggestokkene rapporteres hvert år, med ca. 140.153 dødsfald årligt [2]. Epidemiologiske undersøgelser viste, at frekvensen af kræft i æggestokkene er højest i de vestlige og udviklingslande industrialiserede lande. I 2012 blev næsten 22.280 nye tilfælde af ovariecancer diagnosticeret i USA, med omkring 15.520 forventede dødsfald [3]. I Malaysia, især i Peninsular Malaysia, kræft i æggestokkene er den fjerde mest almindelige kræftform blandt kvinder, der udgør 5% af alle kvindelige kræfttilfælde [4].
Næsten 75% af æggestokkene kræftpatienter til stede med metastaser sygdom ud ovariet grund af kræft placering [5, 6]. Ingen screeningstest er i øjeblikket tilgængelige for tidlig påvisning af kræft i æggestokkene. Derfor efter cytoreduktive kirurgi, har kemoterapi været den vigtigste tilgang af ovariecancer behandling. De fleste af de nuværende terapeutiske procedurer for patienter med ovariecancer er baseret på platin-afledte lægemidler i forbindelse med paclitaxel [7, 8]. Cisplatin og carboplatin er de mest potente platin-afledte kemoterapi lægemidler, der anvendes til behandling af ovariecancer. Selvom kemoterapi og cytoreduktive kirurgi er tilgængelige til at behandle kræft i æggestokkene, disse tilgange er betydeligt ineffektive og meget giftig med lave overlevelsesrater. Desuden er udviklingen af resistens, der opstår med tiden gør behandlingen af ovariecancer mere udfordrende. Toksicitet og modstandsdygtighed over for nuværende kemoterapeutiske lægemidler har tilskyndet forskere til at udforske nye lægemiddelkandidater fra naturlige produkter, der fokuserer på apoptose som den fysiologiske proces, som tilbyder en kraftfuld, ikke-brændbar tilgang at udvise lidt skade celler fra væv dermed sikre vævshomeostase [9]. I betragtning af at kræftcellerne har udviklet sig flere veje til at modstå induktion af apoptose, der udnytter naturlige produkter, der kan have evnen til at undertrykke, dræbe, blok, og vende tumorigenese proces kan tilvejebringe nye muligheder for udvikling af kræft lægemiddel, især til behandling af kræft i æggestokkene [ ,,,0],10].
slægten
Artocarpus
(Moraceae) omfatter næsten 55 arter, som er vidt udbredt i hele tropiske og subtropiske områder, herunder Malaysia, Indonesien, Ny Guinea, og det sydlige Stillehav [11 ]. Visse arter af denne slægt giver afgørende, lækker mad, såsom
Artocarpus chempeden
(Chempedak),
A
.
heterophyllus
(jackfrugter), og
A
.
altilis
(brødfrugt) Mange medlemmer indregnes at have medicinske værdi i behandlingen af en række sygdomme, herunder malaria, inflammation, mavesår og diarré [12, 13]. Især
Artocarpus elasticus
Reinw. Ex Blume er en væsentlig kilde til flavorful fødevarer, tømmer, og traditionel folkemedicin for mange sygdomme.
Artonin E er et kendt prenyleret flavonoid. Denne forbindelse findes i flere
Artocarpus
planter, såsom
A
.
elasticus
,
A
.
nobilis
[14],
A
.
gomezianus
[15], og
A
.
communis
[16]. Tidligere undersøgelser af virkningen af artonin E mod udvalgte cancercellelinier, herunder MCF-7 (brystadenocarcinom), HCT-8 (ileocecal), MDA-MB-231 (brystadenocarcinom), KB (human oral epidermoid carcinoma), vero celle line, og P388 (leukæmi) cellelinier, viste interessante antiproliferative resultater [11, 17, 18]. Denne forbindelse udviste også kraftige radikaler egenskaber mod DPPH radikal [19] og viste sig at være en kraftig arachidonat 5-lipoxygenase-inhibitor med en IC
50 værdi på 0.36μM [20]. Desuden artonin E forbedrer anoikis (løselig-induceret apoptose) i H460 celler (lungekræft) i en dosisafhængig måde [21]. Denne forbindelse sensibiliserede også cellerne ved nedregulering af anti-apoptotiske myeoloid leukæmicelle-sekvens-1 (MCL1) protein [21]. For nylig artonin E udviste lovende anti-migration og anti-invasion egenskaber i humane lungecancerceller H460 [15]. Så vidt vi ved, har mekanismen i artonin E som et anticancer og apoptose-inducerende middel i humane ovariecancerceller ikke blevet belyst. Således er den foreliggende undersøgelse havde til formål at undersøge de apoptose-inducerende egenskaber artonin E i humane ovariecancerceller og de mulige mekanismer.
Materialer og Metoder
Plantemateriale
de stamceller bark af
En
.
elasticus
blev indsamlet fra Ulu Langat, Selangor, Malaysia i 2010. Indsamlingen af plantematerialet ikke kræver tilladelse fra enhver lokal myndighed, fordi anlægget ikke er en truet art. Prøverne blev identificeret af Dr. Rusea Go fra Biologisk Institut, Det Naturvidenskabelige Fakultet, University Putra Malaysia. En voucher eksemplar (S94408) blev deponeret på afdelingen herbarium [22].
Plant udvinding
Den tørrede bark af
A
.
elasticus
(1,5 kg) blev pulveriseret og derefter ekstraheret ved stuetemperatur under anvendelse af hexan, EtOAc, og methanol som opløsningsmidler. De overdrevne opløsningsmidler blev koncentreret under anvendelse af en rotationsfordamper til opnåelse af 1,55 g, 40,22 g og 30,52 g mørkebrun halvfast ekstrakt hhv. EtOAc rå ekstrakt (38,22 g) blev overtrukket med silicagel og fraktioneres under anvendelse af vakuum-væskekromatografi. Søjlen blev elueret med blandinger af hexan, hexan /CHC
3, til CHC
3 /EtOAc, EtOAc /MeOH, og MeOH giver 60 fraktioner på 200 ml hver. Lignende fraktioner blev kombineret baseret på TLC-profil. Krystallisation af fraktioner 26-36 gav 2,3 g (0,06%) gult pulver. Forbindelsen blev derefter omkrystalliseret i hexan og acetone til opnåelse artonin E med smeltepunkt (smp) på 232-233 ° C [23] og m.p.of 231-232 ° C. Methanolekstraktet blev fraktioneret under anvendelse af vakuum-søjlechromatografi (svarende til vakuum søjlekromatografi) for at fremstille et andet parti af artonin E-produktet (0,6 g, et gult fast stof).
Isolering af artonin E
Artonin E blev isoleret som et gult pulver (3 g), smp 232-233 ° C [23] smp 231-232 ° C, fra methanol og ethylacetat bark ekstrakter af
A
.
elasticus
. De isolater blev udsat for identifikation og yderligere analyse, og gav følgende resultater: IR
v
max cm
-1 af 3417 (OH), 2979 (mættet CH), 1644 (C = O), 1462 og 1354; UV λ
max nm, (log ε) af 351 (0,35), 268 (1,29), 209 (1,01);
1 H-NMR (400 MHz, acetone
-d
6
) af δ 13,19 (
s
, 1H, OH-5), 6,82 (
s
, 1H, H-6 ‘), 6,57 (
d
,
J
= 11 Hz, 1 H, H-14), 6,54 (
s
, 1H, H-3 ‘), 5,62 (
d
,
J
= 10,1 Hz, 1H, H-15), 5,08 (
t
,
J
= 6,3 Hz, 2H, H-10), 3,1 (
d
,
J
= 7.36Hz, 2H, H-9), 1,52 (
s
, 3H, H-13), 1,41 (
s
, 3H, H-12), 1,39 (
s
, 3H, H-17), og 1,39 (
s
, 3H, H-18); APT-NMR (100 MHz, acetone
-d
6
) af δ 182,4 (C = O), 161,8 (C-2), 161,4 (C-7), 159,1 (C-5), 152,4 (C-8a), 148,9 (C-2 ‘), 148,6 (C-4’), 138,2 (C-5 ‘), 131,5 (C-11), 127,2 (C-15 ), 121,6 (C-10), 120,8 (C-3), 116,2 (C-6 ‘), 114,6 (C-14), 110,5 (C-1’), 104,7 (C-4a), 103,8 (C- 3 ‘), 100,7 (C-6), 98,8 (C-8), 77,9 (C-16), 29,1 (C-18), 29,1 (C-17), 27,4 (C-13), 23,7 (C- 9), og 16,8 (C-12); EIMS
m /z
(% intensitet) af 436 (M
+, 45), 421 (100), 393 (24), 203 (66), 182 (22), og 69 (15 ). Baseret på ovennævnte fysiske og spektrale data, blev forbindelsen identificeret som en kendt flavon navngivet artonin E (figur 1) [23].
Cell kultur
Metastatisk æggestokkene adenocarcinom (Skov- 3) og normale ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO) cellelinier blev oprindeligt opnået fra American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). SKOV-3-celler blev dyrket i McCoys 5A-medium og CHO-celler blev dyrket i F12K-medium. Et humant periodontal ligament fibroblast cellelinje blev erhvervet fra Lonza, USA og vedligeholdes i stroma celle basalt medium [24]. T1074 (normal udødeliggjort menneskelige æggestokkene overflade epitel celle linje) blev oprindeligt indkøbt fra Applied biologisk materiale (ABM
®) Canada og dyrket i Prigrow en medium [25, 26].
Cell levedygtighed assay
De hæmmende virkninger af artonin E og to positive kontroller paclitaxel og carboplatin blev undersøgt af MTT-analysen. Celler ved en densitet på 5 x 10
3cells /brønd blev anbragt i en 96-brønds plade og efterladt i 24 timer for at vedhæfte. De vedhæftede celler blev udsat for artonin E, paclitaxel og carboplatin ved forskellige koncentrationer og inkuberet i 24, 48 og 72 timer. Efterfølgende 20 pi af 5 mg /ml MTT-opløsning blev tilsat efter lægemiddelbehandling og den resulterende blanding blev inkuberet i 4 timer til dannelse af violet formazan. Bagefter blev 100 pi dimethylsulfoxid (DMSO) overført til hver brønd for at opløse den lilla formazan, og resultaterne blev målt ved anvendelse af en mikropladelæser (Tecan Infinite M 200 PRO, Männedorf, Schweiz) ved en absorbans på 570 nm. De halve-maksimal koncentrationer, der forårsagede cellevækst hæmning (IC
50 værdier) blev opnået fra kurven MTT vækst levedygtighed.
Morfologisk undersøgelse med en almindelig omvendt mikroskop
SKOV-3 celler blev anbragt i en 6-brønds plade og efterladt i 24 timer for at vedhæfte. IC
50 af artonin E ved 48 timer efter behandling (8 ug /ml) baseret på resultaterne af MTT celleviabilitetstest blev anvendt til behandling af cellerne gennem eksperimenter, bortset fra den klonogene assay. De vedhæftede celler blev behandlet med artonin E i 24, 48 og 72 timer og observeret under et normalt omvendt mikroskop ved 200 x forstørrelse. De cellulære morfologiske ændringer blev vurderet og sammenlignet med de ubehandlede levedygtige celler.
Klonogen assay
SKOV-3-celler blev trypsiniseret, centrifugeret, og suppleret med frisk medier. Cellerne blev straks talt og podet (300 celler /plade) i en 60 mm petriskål, og efterladt natten over for at vedhæfte. De vedhæftede celler blev behandlet med 0, 1, 5, 10, 15 og 20 ug /ml artonin E i 24 timer. Efter inkubation blev de behandlede medier fjernet og frisk medium blev tilsat. Cellerne blev inkuberet i tre uger til at danne kolonier. Overlevende kolonier blev fikseret med 90% ethanol og farvet med krystalviolet.
Morfologisk vurdering af apoptotiske celler ved acridinorange og propidiumiodid dobbelt farvning
Virkningen af artonin E til induktion celledød i SKOV -3-celler blev bestemt ved anvendelse acridinorange (AO) og propidiumiodid (PI) dobbelt farvning. SKOV-3-celler blev udpladet med 5 x 10
5cells i en T75cm
2 kolbe og inkuberet natten over for at tillade fastgørelse. Cellerne blev derefter eksponeret for 8 pg /ml artonin E i 24, 48 og 72 timer. Efter inkubation blev de behandlede celler vasket med PBS, og derefter trypsiniseret og centrifugeret ved 1.500 rpm i 5 min. Cellerne blev derefter resuspenderet i kold PBS og centrifugeret to gange for at opnå friske rene pellets. De friske pellets blev blandet med et tilsvarende volumen af fluorescerende farvestof farvningsopløsning (1: 1), der omfatter 10 ug /ml AO og 10 ug /ml PI (opløst i PBS). Den frisk farves cellesuspension blev dryppet på et objektglas og observeret under et UV-fluorescensmikroskop (Leica fastgjort med Q-Flora Software) inden for 30 min, før fading af fluorescensen. De morfologiske kriterier, der anvendes til klassificering af sunde, apoptotiske og nekrotiske celler er som følger: (i) levedygtige celler viser en grøn kerne med runde intakt struktur; (Ii) tidlig apoptose viser en tæt lys-grøn kerne med chromatinkondensation; (Iii) sen apoptose udviser en tæt appelsin område på grund af kondensering af kromatin; og (iv) sekundær nekrose viser en orange /rød intakt kerne [27].
Annexin V assay
En Annexin V assay blev udført ved hjælp af en BD Pharmingen
TM Annexin V-FITC Apoptose Detection Kit (ApoAlert Annexin V, Clontech, Californien, USA). Cellerne blev anbragt i en 6-brønds plade og efterladt natten over for at vedhæfte. Celler blev derefter behandlet med 8 ug /ml artonin E i 24, 48 og 72 timer. De behandlede celler blev trypsinbehandlet og centrifugeret ved 1.500 rpm i 10 min for at fjerne resterende medier. Efterfølgende 1X bindingsbuffer blev tilsat til skylle de friske pellets før deres resuspension i 200 pi bindingspuffer. Cellerne blev derefter blandet med 5 pi Annexin V og 10 pi PI og inkuberet i 15 minutter i mørke ved stuetemperatur. De fremstillede celler blev straks analyseret under anvendelse af flow-cytometrisk analyse (FACS Canto 11 Becton-Dickson). Derefter blev 300 pi bindingsbuffer tilsat til hver prøve for at justere reaktionsvolumen til mindst 500 pi for flowcytometrisk analyse. Cellerne behandlet med DMSO (0,1%, v /v) blev anvendt som kontrol.
Cellecyklusanalyse
SKOV-3-celler i en koncentration på 5 x 10
5-celler var udpladet i en T75cm
2 kolbe og inkuberet natten over for at tillade fastgørelse. De vedhæftede celler blev behandlet med 8 ug /ml artonin E på forskellige tidspunkter. Efter behandling blev cellerne trypsiniseret og centrifugeret ved 1.500 rpm i 10 min. De friske pellets blev vasket to gange med PBS, fikseret med 500 pi 70% kold ethanol og inkuberet ved -20 ° C natten over. Det resterende ethanol blev derefter fjernet, og cellerne blev resuspenderet i PBS indeholdende 20 pi RNase A (10 ug /ml) og 2 pi PI (2,5 ug /ml). Den resulterende blanding blev inkuberet i 30 min ved 37 ° C i mørke. Prøver blev straks analyseret ved anvendelse af FACS Canto 11 Becton-Dickinson flowcytometri. For hver prøve blev 10.000 celler målt. ModFit LT-software (Verity Software House, Topsham, ME) blev anvendt til at analysere procentdelen af celler i forskellige faser.
Påvisning af reaktive generation ilt arter
2 ‘, 7’-Dichlorofluorescin diacetat (DCFH-DA) blev anvendt til at undersøge produktion af intracellulære reaktive oxygenarter i SKOV-3-celler behandlet med artonin E. SKOV-3-celler blev podet i 96-brønds sort plade og inkuberet natten vedhæfte. Cellerne blev derefter behandlet med 8 ug /ml artonin E i 24, 48 og 72 timer. Hanks balancerede saltopløsning uden serum blev anvendt til at vaske cellerne. Derefter blev 100 pi DCFH-DA-opløsning tilsat til hver designeret brønd, og pladen blev inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter. Resultaterne blev analyseret ved hjælp af en fluorescens-mikropladelæser (Tecan Infinite M 200 PRO, Männedorf, Schweiz) ved 485 nm excitation og 520 nm emission.
Multiparametric Cytotoksicitet 3 højt indhold screening
Cellomics Multiparameter cytotoksicitet 3 kit (Thermo Scientific
TM, Pittsburgh, PA, USA) blev anvendt til at udføre samtidig påvisning af de afgørende apoptotiske begivenheder i Skov-3-celler behandlet med artonin E. Kort fortalt SKOV-3-celler blev podet ved en densitet på 5000 celler /brønd i en sort fladbundede plader med 96 brønde (PerkinElmer, Inc., Wellsley, MA, USA) og efterladt natten over for at vedhæfte. De vedhæftede celler blev behandlet med 8 ug /ml artonin E i 24, 48 og 72 timer. De behandlede celler blev derefter eksponeret for 50 pi levende celle farvningsopløsning i 30 min. Det overskydende medium og levende cellefarvning opløsning blev forsigtigt fjernet, og cellerne blev derefter fikseret med 16% paraformaldehyd. Efter fiksering blev cellerne eksponeret med permeabilisering puffer efterfulgt af blokerende buffer i 15 minutter ved stuetemperatur. Primær Cytochrom
C
antistoffer og sekundære DyLight 649 konjugeret gede antimuse IgG blev tilsat og fik lov til at interagere i 1 time hver. Hoechst 33342 farvestof blev anvendt til at farve kerner i SKOV-3-celler. Farvede SKOV-3 celler i plader med 96 brønde blev analyseret ved anvendelse ArrayScan højinformativ screening (HCS) system. Alle forsøg blev udført tredobbelt, og forsøg blev gentaget to gange.
cytochrom C frigivelse apoptose assay
cytochrom C frigivelse apoptose assay kit (ab65311) blev købt fra Abcam
® (Cambridge, UK ). Assayet blev udført i overensstemmelse med producentens anvisninger. Kort fortalt blev SKOV-3-celler induceret med artonin E på forskellige tidspunkter. De inducerede og ikke-inducerede celler blev opsamlet og centrifugeret ved 6,00 ×
g
i 5 minutter ved 4 ° C. Cellerne blev vasket to gange med 10 ml iskold PBS, centrifugeret og opsamlet pelleten. De friske pellets blev derefter genopslæmmet med 1,0 ml 1X cytosol ekstraktionsbuffer blanding indeholdende DTT og proteasehæmmer og inkuberet på is i 10 minutter. Celler blev derefter Dounce-homogeniseret før centrifugering ved 7.000 x
g
i 10 minutter ved 4 ° C. Supernatanten blev opsamlet og gemt som cytosoliske fraktioner. De resterende pellets blev resuspenderet i 0,1 ml mitokondrie ekstraktionsbuffer, hvirvlet i 10 sekunder og gemmes som mitokondriske fraktioner. Både cytosol og mitokondrie fraktioner blev ansøgt om proteinanalyse og fortsatte med standard Western blot procedure.
Aktivering af caspase-3, -8 og -9 assay
Kalorimetrisk assay af aktiveringen af caspaser -3, -8, og -9 blev udført under anvendelse R 120 mM NaCl, 0,5% NP-40, og 1 mM PMSF) blev anvendt til at ekstrahere det totale protein. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse af et BCA protein analysereagenskit (Bio-Rad, USA). Lige store mængder protein (40 ug) ekstrakt blev underkastet SDS-PAGE og elektroblottet på en polyvinylidenedifluoride membran (Bio-Rad). Blots blev derefter blokeret med 5% fedtfri mælk i TBS-Tween puffer 7 (0,12 M Tris-base, 1,5 M NaCl og 0,1% Tween 20) i 1 time ved stuetemperatur. Efter inkubering med det egnede primære antistof natten over ved 4 ° C blev blots vasket og derefter inkuberet med peberrod peroxidase-konjugeret sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur. Proteinbåndene blev påvist under anvendelse pico eller femto kemiluminescens (ECL-systemet) og fremkaldes med et geldokumentation UV system. De efterfølgende primære antistoffer, som omfatter dem, for β-actin (1: 10.000), Bax (1: 10.000), Bcl-2 (1: 10.000), HSP-70 (1: 10.000), survivin (1: 10.000), caspase -3 (1: 10.000), caspase -8 (1: 10.000), caspase -9 (1; 10.000) og cytochrom c (1: 200). blev købt fra Abcam, Cambridge, England
Statistisk analyse
Mean datafrom mindst tre målinger for hver undersøgt prøve blev normaliseret til de ubehandlede resultater. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af SPSS-16.0 pakke og GraphPad prisme 5,0. Data blev præsenteret som middelværdi ± SD og
s. . 0
05
blev betragtet som signifikant
Resultater
Artonin E hæmmer selektivt væksten af kræft og normale celler
in vitro
antiproliferative virkninger af artonin E på forskellige cellelinier blev evalueret ved anvendelse af MTT-assayet, som vist i tabel 1. Dette forsøg blev fastsat på grundlag af evnen til NADP (H) -afhængig cellulær oxidoreduktaseenzym at reducere den gule tetrazoliumfarvestoffet til sin uopløselige lilla formazan, som afspejler andelen af levedygtige celler til stede. Blandt cellelinjerne testet, blev der observeret de laveste IC
50 værdier for SKOV-3-celler efter 24 timers behandling. IC
50 værdier af SKOV-3-celler behandlet med artonin E markant nedsat efter 48 og 72 timer behandling henholdsvis som vist i tabel 2. Derimod normale humane ovarieceller (T1074), normale humane periodontal ligament fibroblastceller , og normale CHO-celler behandlet med artonin E var mindre toksiske. IC
50 værdier af SKOV-3-celler behandlet med artonin E var lidt lavere end den, der blev behandlet med carboplatin, som er et velkendt kemoterapeutisk lægemiddel (tabel 2). Paclitaxel og carboplatin blev anvendt som positiv kontrol. Begge disse stoffer faldt levedygtighed celle i Skov-3 celler i en tidsafhængig måde (tabel 2).
Artonin E nedsætter celle overlevelse
De morfologiske ændringer i SKOV-3-celler behandlet med artonin E blev observeret under normale inverteret mikroskopi (figur 2). Den dissocierede morfologiske struktur af de behandlede celler var synlig efter 24 timers udsættelse for artonin E. Cell bleb’er blev observeret med et kraftigt fald i celleantal, hvilket indikerer, at vækstinhibering var sket. Dannelsen af apoptotiske legemer blev observeret efter en længere eksponeringstid. Derimod er de normale SKOV-3-celler forblev raske med en intakt struktur. Salg
(A) ubehandlede celler. (B) celler efter 24 timer behandling. (C) celler efter 48 timer behandling. (D) celler efter 72 timer behandling. IC: Intakt cellestruktur; DC: dissociere cellestruktur; MB: membranblæredannelse; og AB:. apoptotisk krop
Artonin E hæmmer kolonidannelse i Skov-3 celler
Klonogen assay blev udført for at undersøge den langsigtede effekt af SKOV-3 celler behandlet med artonin E . resultaterne i figur 3 viser, at artonin E inhiberer kolonidannelse på en dosis-afhængig måde. Ved 5 ug /ml artonin E, blev næsten halvdelen af kolonierne reduceret, falde brat ved en koncentration på 10 ug /ml. Ingen kolonier blev dannet efter at cellerne var blevet behandlet med 15 og 20 ug /ml artonin E, hvilket antyder, at denne forbindelse har en anti-proliferative virkninger i SKOV-3-celler.
Celler blev eksponeret for forskellige koncentrationer af artonin E i 24 timer og derefter inkuberet i tre uger til at danne kolonier. De dannede kolonier blev fikseret med ethanol og farvet med krystalviolet.
Kvantificering af apoptose ved hjælp af AO-PI dobbelt farvning
AO-PI analyse blev anvendt til at undersøge ændringerne i nukleare morfologi i SKOV-3-behandlede celler. De apoptotiske celler blev vurderet på grundlag af nuklear kondens og fragmentering. I denne undersøgelse blev 200 celler fra hvert eksperiment modtog og kvantificeres tilfældigt. Resultater afslører (Figur 4), der artonin E udløste morfologiske ændringer, der vedrører apoptose så tidligt som 24 timer efter behandlingen. Kendetegnet for tidlig apoptose blev observeret med AO indskudt i fragmenteret DNA. På dette tidspunkt blev membranblæredannelse og marginering af kernen tydeligt ses. Yderligere 48 timer ved eksponering viste, at de behandlede celler havde undergået sen apoptose med den observerede blebbing og rød /orange farve. Sekundær nekrose med karakteristiske lyse røde farve blev observeret 72 timer efter behandling på grund af PI binding til DNA’et af de døde celler. Derimod er de ubehandlede celler udviste en grøn intakt nuklear struktur. En statistisk signifikant
(p. 0
05)
forskel i induktion af apoptose i de behandlede celler (figur 5) blev observeret. Desuden blev en sideløbende stigning i celledød (sekundær nekrose) observeret
(p. 0
05)
efter længere tids eksponering tid, dvs. 72 timer efter behandling (figur 5) . Disse resultater udviste tidsafhængige typiske genereret morfologiske træk forbundet med apoptose ved artonin E behandling i SKOV-3-celler.
De behandlede celler blev udsat for 8 pg /ml artonin E i 24, 48 og 72 timer . (A) ubehandlede celler. (B) celler efter 24 timer behandling. (C) celler efter 48 timer behandling. (D) celler efter 72 timer behandling. VI: levedygtige celler; BL: blebbing af cellemembranerne; LA: lateapoptosis; . Og SN: sekundær nekrose
(EA: tidlig apoptose; LA: sen apoptose, og SN: sekundær nekrose). Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SD af tre gentagelser. * Angiver signifikant forskel fra kontrollen af hver fase (
s
0,05).
Artonin E inducerer apoptose i SKOV-3 celler
Apoptose har to forskellige morfologiske og biokemiske karakteriseringer. Ændringer i morfologiske apoptotiske celler, såsom tab af plasmamembran asymmetri og fastgørelse, plasma membranblæredannelse, kondensering af cytoplasma og kernen, er altid ledsaget af flere biokemiske modifikationer [28]. Vores resultater hidtil demonstreret de typiske morfologiske træk ved apoptose i artonin E behandlede SKOV-3-celler. Dobbelt farvning Annexin V /PI flowcytometri blev ansat med henblik på at undersøge de biokemiske forandringer i artonin behandlet SKOV-3 celler. En af de tidligere biokemiske forandringer i apoptose arrangementer er en anden kinetik for phosphatidylserin (PS) eksponering på den ydre blad af plasmamembranen. Annexin V, a Ca
2 + -afhængig phospholipid-bindende protein var kendt for at vekselvirke specifikt og kraftigt med PS og kan anvendes til at detektere apoptose ved at målrette tab af plasmamembran asymmetri [29]. Den AV /PI farvning indikerer levedygtige celler på grund af PI ikke gennemtrængelig i intakt cellemembran, mens AV + /PI farvning repræsenterer de tidlige apoptotiske celler, på grund af tab af plasmamembran asymmetri og stærk affinitet AV-FITC med PS. I stedet AV + /PI + repræsenterer sent apoptotiske og AV- /PI + betegner nekrotisk fase, som skyldes at falde af plasmamembranen og integritet kernemembranen som tillader PI at passere gennem membranerne og interkalerer ind nukleinsyre. Som illustreret i figur 6, mere end 40% af cellerne i de tidlige og sene stadier af apoptose efter 24 og 48 timer efter behandling, hvilket viser tidsafhængige signifikant
(p. 0
05 )
forøgelse sammenlignet med ubehandlede celler. Derudover behandling med artonin E viste også tidsafhængige fald i levedygtige celler med samtidig stigning i nekrotiske celler. Derfor aktuelle resultater antyder, at antiproliferative og apoptose i Skov-3-behandlede celler er nært beslægtede.
[A] Kontrol (ubehandlet), [B] 24 timer behandling, [C] 48 h behandling, og [D ] 72 h behandling. [E] Histogram. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SD af tre gentagelser.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.