Abstrakt
PIK3CA
opregulering, forstærkning og mutation er blevet meget omtalt i æggestokkene og andre tumorer, som kraftigt tyder på, at
PIK3CA
er en lovende terapeutisk mål. Men til dato mekanismerne bag
PIK3CA
regulering og aktivering
in vivo
er stadig uklart. Under tumorigenese, kan vært-tumor-interaktioner spiller en kritisk rolle i at redigere tumoren. Her rapporterer vi en ny mekanisme, gennem hvilken tumor mikromiljø aktiverer
PIK3CA
onkogen. Vi viser, at
PIK3CA
opregulering sker i ikke-prolifererende tumor regioner
in vivo
. Vi identificeret og karakteriseret den
PIK3CA
5 ‘opstrøms transkriptionel regulatorisk region og bekræftede, at
PIK3CA
er transkriptionelt reguleret gennem NF-KB-vejen. Disse resultater giver en ny mekanisme, gennem hvilken tumormikromiljøet direkte aktiverer onkogene veje i tumorceller
Henvisning:. Yang N, Huang J, Greshock J, Liang S, Barchetti A, Hasegawa K, et al. (2008) Transkriptionel forordning af
PIK3CA
Oncogene af NF-KB i kræft i æggestokkene mikromiljø. PLoS ONE 3 (3): e1758. doi: 10,1371 /journal.pone.0001758
Academic Redaktør: Edathara Abraham, University of Arkansas, USA
Modtaget: Januar 15, 2008; Accepteret: 7 Feb 2008; Udgivet: 12 marts 2008
Copyright: © 2008 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NCI P01-CA83638 SPORE i kræft i æggestokkene (Career Development Award, LZ); Den æggestokkene Cancer Research Fund (GC og LZ); Mary Kay Ash Charitable Foundation (LZ) og American Cancer Society (LZ). AG blev delvist understøttet af en predoctoral fællesskab fra den græske undervisningsministerium (Program HERACLITOS, EPEAEK). DK blev delvist støttet af Den Italienske Association for Cancer Research (AIRC)
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Phosphatidylinositol-3 ‘kinase (PI-3-kinase) er en intracellulær transducer med lipid substratspecificitet impliceret i en lang række cancerassocierede signaleringsveje involveret i tumor celle metabolisme, overlevelse og proliferation [1], [2], [3], [4 ], [5], [6], [7]. Den er rekrutteret og aktiveres af flere receptortyrosinkinaser og genererer sekundære budbringere via phosphorylering af membran inositollipider på D3 holdning [3], [8]. PI-3-kinase blev først anerkendt som formodede onkogen grund af dets evne til at binde polyoma middle T-antigen [9], [10]. Molekylær kloning af PI-3 kinaser afslørede en stor og kompleks familie, der indeholder tre klasser af multiple underenheder og isoformer [3], [8]. Men hvordan hver underenhed præcist bidrager til fremskridt og vedligeholdelse af kræft er stort set ukendt [3], [5].
PIK3CA
genet koder den katalytiske subunit p110-alfa, en af de tre katalytiske underenhedsproteiner af klasse IA PI-3 kinaser, der normalt aktiveres af vækstfaktor receptortyrosinkinaser.
PIK3CA
blev identificeret som en aviær retrovirus-kodet onkogen, der forvandler kyllingefosterfibroblaster [11]. Talrige nylige undersøgelser viser, at
PIK3CA
og nedstrøms veje er ofte rettet af genomisk forstærkning, mutation eller overekspression i solide tumorer, herunder ovariecancer [12], [13], [14], [15], [16] [17], [18], [19], [20]. Tidligere undersøgelser vedrørende funktionen af
PIK3CA
har overvejende fokuseret på regulatoriske kredsløbssystemer inden kræftcellen.
In vitro
,
PIK3CA
spiller en kritisk rolle i celle overlevelse og spredning [1], [2], [3], [4], [5], [7]. Men til dato er det stadig uvist, om
PIK3CA
antager forskellige roller afhængigt af tilstanden og /eller den sammenhæng, hvori tumoren cellen er fundet. Desuden er det fortsat uklart, hvordan sådanne roller
PIK3CA
kan påvirkes af det miljø tumor.
Dynamiske interaktioner mellem genetisk deregulering i tumorceller og reaktive molekylære og cellulære forandringer i værtsceller befolker tumoren mikromiljø spille en afgørende rolle i at fremme malign transformation og tumorprogression og vækst [21], [22]. Efter købet af kritiske genetiske ændringer, er tumorceller udsat for metabolisk /iskæmisk stress og redigere den omgivende mikromiljø. Til gengæld værtsceller tjener til at redigere tumoren, fremme udvælgelsen af tumorceller, der nyder godt tumormikromiljøet påvirkninger. Medfødte og adaptive immunrespons mekanismer til tumorer kulminerede i inflammation har fået stor opmærksomhed i denne sammenhæng, da betændelse har vist sig at fremme kræft vækst og progression [23], [24], [25]. Tumor-associerede leukocytter producere mange proangiogene faktorer fremmer tumorvaskularisering [26], [27], [28], [29]. Endvidere nuklear faktor kappa-B (NF-KB), en kritisk transkriptionel regulator af inflammation, er blevet vist, at spille en kritisk rolle i inflammation-drevet carcinogenese og fremme tumorvækst og progression [25], [30], [31 ], [32], [33], [34], [35]. Det er således blevet postuleret, at kontinuerlig og dynamisk krydstale mellem tumorceller og værtsceller sikrer overlevelsen af tumorceller og opretholder tumorvækst [21], [22]. De gensidige virkninger af tumor-vært interaktioner er karakteriseret med hensyn til angiogenese. Men hvordan tumor-vært interaktioner påvirker direkte tumorceller forbliver delvist ubestemt.
Epithelial ovariecancer (EOC), den mest almindelige æggestokkene malignitet, fortsætter med at være den førende dødsårsag blandt gynækologiske maligniteter [36]. Manglen på forebyggende strategier, tidlig diagnostiske metoder og effektive behandlinger til at behandle tilbagevendende ovarietumorer skaber et presserende behov for at forstå dens patogenese og identificere molekylære mål for både diagnose og behandling af EOC på forskellige stadier af sygdomsprogression [20], [37] , [38], [39], [40], [41]. I denne undersøgelse undersøgte vi ekspressionen af
PIK3CA in vivo
og dets forhold til tumor mikromiljø i human kræft i æggestokkene. Identifikation og karakterisering af
PIK3CA
5’transkriptionelle regulatoriske region (TRR) sammen med funktionelle validering eksperimenter bekræftede, at
PIK3CA
er transkriptionelt reguleret af mikromiljø, gennem inflammation og NF-KB. Disse resultater giver en ny mekanisme, gennem hvilken tumor mikromiljø direkte aktiverer onkogene veje i tumorceller og fremmer tumorvækst.
Materialer og metoder
Patienter og Prøver
De prøver, der anvendes i denne undersøgelse blev indsamlet ved University of Pennsylvania og University of Turin, Italien [42]. Væv blev opnået efter patienternes skriftlige samtykke under en generel væv samling protokol godkendt af institutionens Institutional Review Board (IRB) fra University of Pennsylvania og universitetet i Torino. Alle tumorer var fra primære steder, og blev indsamlet på tidspunktet for debulking kirurgi fra tidligere ubehandlede patienter med stadium III og IV kræft i æggestokkene. Prøver blev lynfrosset straks og opbevares ved -80 ° C. Prøver blev indsamlet under lokal Institutional Review Board godkendelse og behandles i henhold til procedurer, der er godkendt af HIPAA handling.
Cell Culture
Celler blev dyrket i DMEM-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, Invitrogen). I nogle eksperimenter blev celler inkuberet i medier beriget med rekombinant human TNF-α (50 eller 100 ng /ml, BD Bioscience, San Jose, CA) i forskellige tidsrum som angivet.
Total RNA Isolation og Quantitative Real- time RT-PCR
Totalt RNA blev isoleret fra 100 til 500 mg frosset væv eller 1 × 10
6 dyrkede celler med TRIzol-reagens (Invitrogen). Efter behandling med RNase-fri DNase (Invitrogen), totalt RNA revers-transkriberet under anvendelse af Superscript First-Strand Synthesis Kit til RT-PCR (Invitrogen) under betingelser, der er defineret af leverandøren. cDNA blev kvantificeret ved real-time PCR på ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Menneskelig
PIK3CA
forward primer: TCA AAG GAT TGG GCA CTT TT, og revers primer: GCC TCG ACT TGC CTA TTC AG. PCR blev udført under anvendelse Sybr Green PCR Core reagenser (Applied Biosystems, Foster City, CA) ifølge producentens instruktioner. PCR-amplifikation af housekeeping-genet GAPDH blev udført for hver prøve som kontrol for prøve lastning og tillade normalisering blandt prøverne. En standardkurve blev konstrueret med PCR-II TOPO kloningsvektor (Invitrogen) indeholdende den samme indsatte fragment og amplificeret ved real-time PCR.
Tissue Microarray
Vævet microarray blev konstrueret som beskrevet tidligere [43], [44]. Kort fortalt blev tumorer indlejret i paraffin og 5-um snit blev farvet med hematoxylin-eosin for at vælge repræsentative regioner for biopsier. Fire centrale vævsbiopsier blev opnået fra hver prøve. Tilstedeværelsen af tumorvæv på de grupperede prøver blev kontrolleret på hæmatoxylin-eosin farvede sektion.
Immunhistokemi (IHC) og Image Analysis
IHC blev udført under anvendelse af Vectastain ABC Kit, som beskrevet af producenten (Vector, Burlingame, CA). Vi anvendte de følgende primære antistoffer (alle fra BD Pharmingen medmindre andet er anført): kanin anti-human Ki67 (1:200, DAKO, Carpinteria, CA); kanin-anti-human cytokeratin (1:200, DAKO); kanin anti-human p65 (1:400, Santa Cruz, Santa Cruz, CA); muse-anti-humant p110α (1:250 eller 1:50); rotte-anti-muse CD31 (1:200); muse-anti-humant HIF1Α (1:200); muse-anti-humant c-Jun (1:200); rotte-anti-muse CD11 (1:200). Antistoffer blev inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C. Immunreaktionen blev visualiseret med 3,3′-diaminobenzidin (Vector). Dobbelt immunfluorescensfarvning blev udført som tidligere beskrevet [45]. Kort beskrevet blev snit sekventielt inkuberet i 5% normalt serum; primære antistoffer i 2 timer; og fluorescerende mærkede sekundære antistoffer (Vector) i 30 min. Snit blev modfarvet med DAPI før der inspiceres under fluorescensmikroskop. Billeder blev indsamlet gennem Cool SNAP Pro farve digitalkamera (Media Kybernetik, Silver Spring, MD) og farvning indeks blev analyseret ved hjælp af Image-Pro Plus 4.1 software (Media Cybernetics).
TUNEL Assay
Den ApopTag peroxidase in situ detektion kit (Intergen) blev anvendt til at visualisere apoptotiske celler
in vivo
in vitro
. Proceduren blev udført ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt blev tumor- vævssnit fikseret med 1% paraformaldehyd i PBS, efterfulgt af kold ethanol og eddikesyre post-fiksering. Efter inkubering med rester af digoxigenin nukleotid og terminal deoxynukleotidtransferase i en time ved 37 ° C blev celler inkuberet med FITC-mærket anti-digoxigenin antistof.
Plasmider
Musen
PIK3CA
cDNA blev generøst tilvejebragt af Dr. Roberts (Harvard University). Pattedyrsekspression pCDNA3 var fra Invitrogen. For at konstruere luciferase reporter plasmider, 5’TRRs af den humane og muse
PIK3CA
blev amplificeret fra BAC eller genomisk DNA ved anvendelse af Expand High Fidelity PCR System (Roche, Indianapolis, IN) og indsat opstrøms for luciferasegenet i pGL3 -Basic vektor (Promega, Madison, WI). Sekvenser af 5’TRR i alle disse reporter konstruktioner blev verificeret ved DNA-sekventering.
5 ‘Rapid Amplification of cDNA Ends (5’RACE)
Total RNA blev ekstraheret med RNeasy Mini RNA kit (Qiagen, Valencia CA) og 5′-RACE-system (Invitrogen) anvendt. 5′-RACE PCR-produktet blev indsat i TA kloningssystemet (Invitrogen).
plasmidtransfektion
Celler blev podet i plader med 6 brønde ved 3 × 10
5 celler /brønd og dyrket natten over til ~ 40% sammenflydning før transfektion. Alle plasmider blev transficeret med FuGENE6 transfektionsreagens (Roche) ifølge producentens instruktioner. At vælge neomycin-resistente celler, blev 400 ug /ml neomycin (Invitrogen) anvendt. For shRNA eksperimenter blev celler transficeret med siRNA udtrykkende pLTsuppressor1.0. In vitro-forsøg viste, at undertrykkelse af
PIK3CA
mRNA varet i op til 30 dage. Alle transfektionsforsøg blev udført tre gange og gentaget mindst to gange med forskellige DNA-isolater.
Luciferase Reporter Assay
Celler blev podet i plader med 6 brønde ved 3 x 105 celler /brønd og dyrket natten over til 40% konfluens forud for transfektion. For at teste promotoraktivitet af
PIK3CA
, i alt 0,5 ug reporterkonstruktion og 0,01 ug pRL-TK intern kontrol (Promega) blev anvendt til hver transfektion. Alle transfektionsforsøg blev udført tre gange og gentaget mindst to gange med forskellige DNA-isolater. Otteogfyrre timer efter transfektion, blev luciferase analyse udført på Luminoskan Ascent (Thermo-Labsystems, Waltham, MA) under anvendelse af Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) i overensstemmelse med producentens anvisninger. For co-transfektionsforsøg, 1 ug hver pCMV-kBa eller pCMV-IκBαM plasmidet (CloneTech, Mountain View, CA) blev anvendt.
elektroforetiske mobilitet (EMSA)
Nuklear ekstrakt af celler blev fremstillet under anvendelse af NE-PER Nuclear og cytoplasmiske Ekstraktion Reagenser plus Halt Protease Inhibitor Cocktail Kit (Pierce, Rockford, IL) ifølge producentens protokoller og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Rekombinant NFKB (p50) blev bestilt fra Promega. 5′-Biotin-mærkede DNA oligo’er indeholdende vild-type human
PIK3CA
NFKB-bindingssted (GACGTGGGGGATTTTTCGCGTA), muterede humane
PIK3CA
NFKB-bindingssted (GACGTGGGCGATTTTTCGCGTA), scramble human
PIK3CA
NFKB-bindingssted (TCAGATAGACGAGACTTGAGTC), vildtype kontrol NFKB-bindingssted (AGTTGAGGGGACTTTCCCAGG) [35], muterede kontrol NFKB-bindingssted (AGTTGAGGCGACTTTCCCAGG) blev syntetiseret og de to komplementære oligoer blev annealet til opnåelse af dobbeltstrengede probe. EMSA blev udført under anvendelse LightShift Chemiluminescent EMSA Kit (Pierce). Den kerneekstrakt (eller p50) og 30 fmol af mærket probe blev inkuberet i 10 × bindingspuffer plus 1 ug poly (dI-dC) i 20 pi reaktion systemet ved stuetemperatur i 20 minutter. Hele 20 pi bindingsreaktion blev sat på en 7,5% polyacrylamidgel og kørt ved stuetemperatur i 0,25 × TBE ved 110 V i 1-1,5 timer. Den elektroforesebehandlet Bindingsreaktionen blev derefter overført til Brightstar-Plus positivt ladet nylonmembran (Ambion, Austin, TX) i Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell (Bio-Rad, Hercules, CA) ved 15 V i 30 minutter og indlæg -linked i UV Stratalinker 1800 (Stratagene, La Jolla, CA) ved auto cross-link niveau i 1 min. Påvisning af biotin-mærket DNA-probe blev udført strengt at følge fabrikantens protokol.
chromatin immunoprecipitation (chip)
chip assay til påvisning p65 bindende for human
PIK3CA
promotoren blev udført under anvendelse af Upstate chip assay kit (Upstate, Charlottesville, VA) ifølge producentens instruktion. Forskydningspåvirkede DNA blev inkuberet ved 4 ° C natten over med 2 ug immunpræcipitering kanin polyklonalt IgG antistof mod p65 (Santa Cruz) eller 2 ug normalt kanin kontrol IgG. Input og chromatin-immunpræcipiteret DNA blev anvendt som PCR template til detektion af p65 bindende for promotoren (med primere 5′-GCACCAAGACACTACCTTGAATC-3 ‘og 5′-CTCTGCAGTCCTTTGACTCACTT-3′) eller på GAPDH promotoren (med primerne 5’-GACACCATGGGGAAGGTGAA -3 ‘og 5′-GAGTAGGGACCTCCTGTTTC-3’) ved hjælp af PCR Core kittet (Roche).
Bioinformatik
En søgning efter potentielle transskription faktor bindende sites på mennesker og mus
PIK3CA
5’TRRs blev udført ved hjælp af programmet Mat Inspector V2.2 på https://www.genomatix.de/online_help/help_matinspector/matinspector_help.html [46].
Statistik
Statistisk analyse blev udført under anvendelse af SPSS statistik softwarepakke (SPSS). Alle resultater blev udtrykt som middelværdi ± SD, og p 0,05 blev anvendt til signifikans
Resultater
PIK3CA
er opreguleret i ikke-prolifererende regioner i ovariecancer
for at afsløre rumlige aspekter af
PIK3CA
regulering i tumor
in vivo
, vi først undersøgte udtryk for p110α i humane kræft i æggestokkene prøver. Interessant nok blev stærk p110α ekspression hovedsagelig påvist i grupper af ikke-prolifererende, Ki67- tumorceller (figur 1 A til C). I disse celler blev p110α translokeres til cellemembranen (figur 1 C). I modsætning hertil Ki67 + regioner udviste lav ekspression af p110α, som hovedsagelig blev placeret i cytoplasmaet, mens kun få Ki67 + -celler udviste p110α på cellemembranen (figur 1 B). Væv microarray blev anvendt til yderligere at validere dette resultat i human ovariecancer. I 18 af 30 (60%) tumorer, stærke p110α ekspression (og membran lokalisering) blev påvist primært i Ki67- tumor regioner, mens der i de andre tumorer stærk membran p110α ekspression blev enten detekteret både i både Ki67- og Ki67 + tumorceller (5 /30, 16,7%); hovedsagelig i Ki67 + tumorceller (3 /30,10.0%); eller det var målbart. (4/30; 13,3%)
A til C. Dobbelt immunfarvning af p110α (grøn, FITC) og Ki67 (rød, Texas Red) i human kræft i æggestokkene B. Høj forstørrelse af en regionen fra A med lav ekspression af p110α. p110α udtrykkes i lave niveauer og lokaliserer til cytoplasmaet af Ki67-positive tumorceller. C. Stor forstørrelse af en region fra A med høj ekspression af p110α. p110α udtrykkes i høje niveauer og lokaliserer til plasmamembranen i Ki67-negative tumorceller. D og E. immunhistokemisk lokalisering af Ki67 muliggør klar identifikation af områder af prolifererende og områder af ikke-prolifererende tumorceller
in vivo
i 2008 æggestokkene xenotransplantattumorer. E. Stor forstørrelse af området fra D viser grænsen mellem en prolifererende og en ikke-prolifererende region. F til H. Stærk udtryk og cellemembran lokalisering af p110α kun findes i Ki67-negative områder. F. Afsnit støder op til D, farvet med antistof mod humant p110α (1: 250 fortynding). G. Stor forstørrelse af området blandt F viser grænsen mellem prolifererende og ikke-prolifererende region. H. Stor forstørrelse af området fra G viser membran lokalisering af p110α i non-prolifererende region. I. immunfarvning af humane cytokeratin identificerer tumorceller i prolifererende og ikke-prolifererende områder i 2008-xenograft model. Linjen spor grænsen mellem de to områder, som defineret af Ki67 farvning i tilstødende sektion (se J). Både prolifererende og ikke-prolifererende regioner er positive for human cytokeratin (FITC, grønne), hvilket indikerer tumorceller. Cellekerner blev modfarvet med DAPI. J til L. Dobbelt p110α og Ki67-immunfarvning kort
PIK3CA
aktivering i prolifererende eller ikke-prolifererende områder i 2008 xenotransplantattumorer. J. Ki67 (rød, Texas Red) og p110α (FITC, grønne) udviser gensidig udtryk. K og L. Høj forstørrelse på prolifererende region (I) og ikke-prolifererende region (H) fra J.
For yderligere at bekræfte dette resultat, vi undersøgte xenotransplantattumorer genereret med 2008 æggestokkræft cellelinje . Fordelen ved denne model er, at forskellige områder af prolifererende og hvilende tumorceller klart kan identificeres
in vivo
ved Ki67 farvning (Figur 1 D og E) [47]. I lighed med den reciprokke ekspression observeret i de humane prøver, blev stærk p110α ekspression påvist i tumorceller kun i Ki67-, ikke-prolifererende regioner (figur 1 F til H). I disse områder blev p110α primært lokaliseret til cellemembranen (figur 1 H). Dobbelt farvning bekræftede, at områder, der udtrykker p110α blev faktisk befolket af tumorceller, som udtrykte cytokeratin, en epitelial tumormarkør (figur 1 I til K). Med øget primært antistof-koncentration (fra 1:200 til 1:50), kunne svage p110α ekspression også påvises i Ki67 + regioner, men p110α lokaliseret diffust til cytoplasmaet i disse områder (figur 2). Således onkogen
PIK3CA
betydeligt opreguleret i ikke-prolifererende regioner i human ovariecancer
in vivo
. Disse ikke-prolifererende regioner altid mangler støtte blodkar og indeholder talrige nekrotiske /apoptotiske celler samt rige lymfocyt infiltrerer (figur 3).
A. Immunhistokemisk farvning af p110α hjælp af høj primært antistof koncentration (1:50) afslører lav ekspression af p110α diffust i cytoplasmaet af tumorceller i Ki67-positive (Ki67 +) regioner. B og C. Stor forstørrelse af ikke-prolifererende (B) og prolifererende (C) regioner fra A.
A. Dobbelt immunfarvning af CD31 (rød, Texas Red) og p110α (grøn, FITC) i 2008 xenograft model. Stærk p110α farvning hovedsageligt påvist i tumor regioner, der ligger fjernt fra kapillærer. B. Triple farvning af p110α (rød, Texas Red), Ki67 (blå, AMCA) og TUNEL (grøn, FITC) i 2008 xenograft model.
Identifikation og karakterisering af de menneskelige og murine
PIK3CA
initiativtagere
for bedre at forstå de signaler til at bidrage til opregulering af
PIK3CA
i kræft, 5 ‘opstrøms regulatoriske sekvenser af menneskelige
PIK3CA
gen var identificeret. 5′-hurtig amplifikation af cDNA ende (5′-RACE) blev anvendt til at identificere transkriptionsstartsitet (TSS) af human
PIK3CA
(figur 4A og B). En 125 bp segment af 5′-utranslaterede region (UTR) og 2,3 Kbp af TRR af human
PIK3CA
blev klonet fra humant bakterielt kunstigt kromosom (BAC, klon nummer: PR11-245C23). Vi fandt at 5’opstrøms regulatoriske region af human
PIK3CA
ligger ca. 50 Kbp opstrøms for translationsstartkodonen (figur 4A). Denne region er meget rig på GC (Figur 4B). Kortlægning RT-PCR yderligere bekræftet af TSS på
PIK3CA
, og en lille splejsning variant blev identificeret (figur 4C til E). Det murine
PIK3CA
5 ‘opstrøms regulatoriske sekvens blev også klonet ved den samme fremgangsmåde, og blev fundet at være 63,6% identitet med den humane sekvens (figur 5) og til at omfatte en lille intron.
A. Illustration af strukturen af human
PIK3CA
genet og dets 5′- opstrøms regulatorisk region. B. En region særdeles rig på GC findes i
PIK3CA
5’TRR. C. Illustration af primerne anvendt til kortlægning RT-PCR af
PIK3CA
transskriptionsstartstedet (SST). D. Resultater af kortlægning RT-PCR. Der er intet bånd mellem den fremadrettede primer F1 placeret opstrøms for SST og den reverse primer R placeret på exon 1 i
PIK3CA
. Den rigtige størrelse bånd kunne påvises mellem primer F2 eller F3 (begge placeret nedstrøms for SST) og revers primer RE En lille splejsningsvariant findes i 5’UTR af humant PIK3CA
gen, som også kan detekteres
ved kortlægning RT-PCR (primere F2 og R). F. opsummerede resultater af transkriptionsaktivitet af
PIK3CA
TRR fragmenter.
For yderligere at karakterisere transkriptionelle aktivitet af promotoren region, hele 2,3 Kbp 5 ‘TRR eller trinvist trunkerede promotorfragmenter blev subklonet sammen med en 316 eller en 150 bp-transskript region i PGL-basiske reporter vektor til at afsløre luciferaseekspression (figur 4F). Stærk transkriptionel aktivitet blev lokaliseret til -2340 til -159 bp region ved luciferaseanalyse, mens transkriptionel aktivitet faldt betydeligt efter -159 bp (figur 4F).
Dernæst transkriptionsfaktorbindingssites blev forudsagt på human
PIK3CA
5’TRR
i silico
af GenomatiX (https://www.genomatix.de/index.html). Bindingssteder for talrige stress-associeret transkriptionsfaktorer blev fundet, herunder NF-KB; hypoxi-inducerbar faktor (HIF); varme-shock protein (HSP); og aktivator protein 1 (AP1) (figur 6). Således kan stress signaler medieret af disse faktorer regulere
PIK3CA
udtryk i ikke-prolifererende tumorceller i områder med nedsat vaskularisering og øget lymfocyt-infiltrerende.
Expression og lokalisering af kandidat transskription faktorer
in situ
udtrykket og lokalisering af tre formodede regulatoriske faktorer, der opstod fra ovenstående
i silico
analyse, HIF1α; c-Jun, et medlem af AP1-kompleks; og p65-underenheden af NF-KB, blev screenet i 2008 xenotransplantater. Fordi funktion af disse faktorer kræver udtryk og nuklear translokation, betragtede vi stærkt udtryk og nuklear lokalisering indirekte beviser for funktionel aktivering. Stærk nukleare HIF1α udtryk blev set i blakket celle klynger i Ki67- regioner. HIF1α protein blev også påvist i Ki67 + regioner, men det hovedsageligt lokaliseret til cytoplasmaet (figur 7 A, D og G). c-Jun-protein blev strengt udtryk i grænserne mellem Ki67 + og Ki67- regioner, hvor kun nuklear farvning blev opdaget. Få spredte c-Jun-positive celler kan også påvises i Ki67 + regioner, men nuklear c-Jun sås ikke i Ki67- regioner (figur 7 B, E og H). Stærk nukleare lokalisering af NF-KB /p65 protein blev set i de Ki67- regioner og i Ki67 + områder, der støder til de Ki67- regioner (Figur 7 C, F og I). Interessant nok blev stærkest nukleare NF-KB /p65 detekteret hosliggende til områder af vævsnekrose (figur 7 F). Disse data sammen med
PIK3CA
promotor analyse tyder på, at HIF1α og NF-KB er impliceret i opregulering af
PIK3CA
i Ki67- regioner
in vivo
. I overensstemmelse med denne hypotese har hypoxi /HIF vej blevet rapporteret at regulere
PIK3CA
i cancerceller [48]. Da hypoksisk regulering af
PIK3CA
er blevet bekræftet, vi næste fokuseret på regulering af
PIK3CA
af NF-KB-vejen.
A til C. immunhistokemisk farvning af kandidat transskription faktorer HIF1α, c-Jun og NF-KB i 2008 xenotransplantater. Linien viser grænsen mellem Ki67 + p110α-lav, og Ki67- p110α-høj regioner. D til F. Høj forstørrelse fra A til C, henholdsvis viser udtryk og nuklear lokalisering af HIF1Α, c-Jun og NF-KB i 2008 xenotransplantater. G til I. Illustration af lokaliseringen af kandidat transkriptionsfaktorer HIF1α, c-Jun og NF-KB i 2008 xenograft model. Store prikker repræsenterer cytoplasmatisk lokalisering, mens små prikker repræsenterer kernelokalisering. Den linje repræsenterer grænsen mellem Ki67 + p110α-lav, og Ki67- p110α-høj regioner.
NF-KB binder sig til promotoren og opregulerer
PIK3CA
udtryk
i overensstemmelse med en vigtig rolle for NF-KB i reguleringen
PIK3CA
, fandt vi NF-KB-bindingssted konsensus sekvenser i human og mus
PIK3CA
5’TRRs (figur 8A). Den humane promotor NF-KB-bindingssted blev placeret på -807 til -786 bp. Vi testede, om NF-KB regulerer transkriptionelle aktivitet af menneskelig
PIK3CA
promotor
in vitro
. NF-KB-aktivering kræver frigivelse fra dens inhiberende underenhed kBa, som tillader NF-KB translokation til kernen [34], [35]. Forbigående tvunget ekspression af vildtype kBa eller mutant kBa (IκBαM), som begge binder NF-KB og blokere dets translokation til kernen, svækkede den transkriptionelle aktivitet af
PIK3CA
promotor, som afsløret ved luciferase assay. Fjernelse af NF-KB-bindingssted fra promotorregionen ophævede den inhibitoriske aktivitet af kBa eller IκBαM (figur 8 B og C).
A. Illustration af den forudsagte NF-KB-bindingssted i human (øverst) eller murine (nederst)
PIK3CA
promoter region. B. Illustration af de konstruktioner, der omfatter luciferase knyttet til mennesket
PIK3CA
promotor med (Luc-2340/316), eller uden NF-KB-bindingssted (Luc-378/316). C. Resumé af luciferaseaktiviteter Luc-2340/316 og Luc-378/316 cotransficeret med pCMV kBa eller pCMV IκBαM. D. Gelshift assay under anvendelse æggestokkene kræftcelle nukleare ekstrakt efter TNF-α stimulation. Bane 1, NF-KB-bindingssted af vild type human
PIK3CA
promotor (wt hu
PIK3CA
NF-KB-probe) alene; bane 2 og 3, vægt- hu
PIK3CA
NF-KB-probe + kerneekstrakt; bane 4, styre NF-KB-probe + kerneekstrakt, bane 5 og 6, muterede hu
PIK3CA
NF-KB-probe + kerneekstrakt; bane 7, muteret kontrol NF-KB-probe + kerneekstrakt; baner 8 og 9, scramble hu
PIK3CA
NF-KB-sonde + nuklear ekstrakt. E. gelforskydningsassay anvendelse af rekombinant NF-KB /p50-protein. Bane 1, vægt hu
PIK3CA
NF-KB-sonde alene; bane 2 og 3, vægt hu
PIK3CA
NF-KB-sonde + p50; bane 4, muteret hu
PIK3CA
NF-KB-sonde alene; bane 5 og 6, muterede hu
PIK3CA
NF-KB-probe + p50; bane 7, kontrollere NF-KB-proben alene; baner 8 og 9, kontrollerer NF-KB-sonde + p50.
Den forudsagte NF-KB-bindende sekvens i den menneskelige
PIK3CA
promotor blev yderligere testet ved hjælp gelforskydningsassay. Kerneproteiner fra 2008 ovariecancer cellelinje behandlet med TNF-α var i stand til at flytte (binde) oligonukleotidsekvenser indeholdende den forudsagte NF-KB-bindingssted af human
PIK3CA
promotor, men var ikke i stand til at flytte enten mutant eller mock oligonukleotidsekvenser (figur 8 D). Desuden rekombinant NF-KB /p50-protein var i stand til at forskyde oligonukleotidsekvenser indeholdende den forudsagte NF-KB-bindingssteder, hvilket bekræfter deres tilstedeværelse i den menneskelige
PIK3CA
promotoren (figur 8 E). Endelig tilstedeværelsen af NF-KB-bindingssted i
PIK3CA
promotor blev bekræftet af kromosom immunopræcipitationsassay (chip).
Betændelse kan regulere
PIK3CA
udtryk via NF KB vej
Under tumorvækst, metaboliske /iskæmisk stress inducerer tumor celledød, rekruttere inflammatoriske celler, herunder makrofager. Disse release proinflammatoriske cytokiner, der aktiverer NF-KB-vejen [25], [33], [34], [35]. Vi kortlagt fordelingen af nekrose, tumor-infiltrerende makrofager og aktivering af NF-KB i 2008 xenograft model. Morfologiske nekrose blev fundet overvejende Ki67- p110α + regioner, ofte placeret i deres center (Figur 9 A). Rask infiltration af CD11b + makrofager, som producerer pro-inflammatoriske cytokiner, såsom TNF-α, blev fundet i forbindelse med områder med nekrose (figur 9 B til D).
A. H & E-farvning af 2008 tumor afslører en fremtrædende område af nekrose (N). B og C. Immunohistokemisk farvning af murin CD11 afslører makrofag infiltrere i en 2008 xenograft. CD11b + -celler infiltrere tumorer i Ki67-negative område i nærheden af nekrose. C. Stor forstørrelse fra B. D. Double immunfarvning af CD11b (grøn, FITC) og Ki67 (rød, Texas Red) afslører CD11b + makrofager hovedsageligt i ikke-prolifererende Ki67-negative område. E. chipanalyse af NF-KB-binding til den endogene
PIK3CA
promotor.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.