PLoS ONE: RhoT1 og Smad4 er korreleret med lymfeknudemetastaser og samlet overlevelse i pancreas Cancer

Abstrakt

Kræft celle invasion og metastase er de vigtigste negative prognostiske faktorer for kræft i bugspytkirtlen. Identifikation af biomarkører i forbindelse med udfaldet af kræft i bugspytkirtlen kan give nye tilgange og mål for anticancer-terapi. Formålet med denne undersøgelse er at undersøge forholdet mellem ekspression af RhoT1, Smad4 og p16 og metastase og overlevelse hos patienter med kræft i bugspytkirtlen. Analysen viste, at de høje cytoplasmatiske ekspressionsniveauer af RhoT1, Smad4 og p16 i pancreas cancer væv havde signifikant negativ korrelation med lymfeknude metastaser (LNM) (

P

= 0,017,

P

= 0,032 ,

P

= 0,042, henholdsvis). Imidlertid blev der ikke observeret nogen signifikant sammenhæng mellem perineurale invasion (PNI) og udtryk for over tre proteiner (alle

P

0,05). Derudover viste overlevelsesanalyse at de lave ekspressionsniveauer af RhoT1 og Smad4 markant var associeret med dårligere overlevelse (

P

= 0,034,

P

= 0,047, henholdsvis). Som konklusion viste disse resultater, at de lave ekspressionsniveauer af RhoT1 og Smad4 signifikant var forbundet med LNM og kortere overlevelse. RhoT1 kan betragtes som en potentiel hidtil ukendt markør til at forudsige resultatet af patienter med kræft i bugspytkirtlen

Henvisning:. Jiang H, Han C, Geng S, Sheng H, Shen X, Zhang X et al. (2012) RhoT1 og Smad4 er korreleret med lymfeknudemetastaser og samlet overlevelse i kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 7 (7): e42234. doi: 10,1371 /journal.pone.0042234

Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: December 2, 2011; Accepteret: 5 jul 2012; Udgivet: 31 Jul 2012

Copyright: © Jiang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. HJ er støttet af Key Disciplin Construction Project af Pudong Health Bureau of Shanghai, Kina (Grant No: PWZxkq2010-05). HG er støttet af China National 863 Project Foundation for Cancer Genomics (Bugspytkirtel Genomics) (Grant No: 1006AA02A302), hhv. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. HS, XS, XZ, SZ, og HG er ansat af National Engineering Center for biochip på Shanghai. Der er ingen rådgivning, patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er den fremherskende form for kræft i bugspytkirtlen, der rangerer fjerde i kræftrelaterede dødsårsager [1]. Det blev anslået, at 43140 amerikanere blev diagnosticeret og 36800 patienter døde af kræft i bugspytkirtlen i USA i 2010 [2]. Trods omfattende kliniske og videnskabelige indsats, har prognosen for denne usædvanlig dødelige sygdom ikke forbedret betydeligt i de seneste årtier [2], [3]. Den mediane overlevelse efter diagnosen er 3-6 måneder uden behandling, og resectional kirurgi og adjuverende stigning behandling median overlevelse på omkring 23 måneder [4].

Talrige undersøgelser har fundet, at RAS regulerer vækst og metastase af kræft i bugspytkirtlen celler. Rho-familien af ​​GTPaser er en underfamilie af Ras-superfamilien. Rho GTPaser er blevet rapporteret til at bidrage til de fleste trin for kræft initiering og progression, herunder erhvervelse af ubegrænset spredning potentiale, overlevelse og unddragelse fra apoptose, væv invasion og etablering af metastaser [5], [6], [7], [8 ], [9], [10], [11], [12]. Rho-familien af ​​GTPaser indeholder 20 medlemmer. Det meste af det, vi ved om den rolle, Rho GTPaser i cancercelleinvasion kommer fra studier af det prototypiske medlemmer RhoA, RhoB og RhoC, Rac1 og cdc42. Men lidt om roller andre mindre karakteriserede familiemedlemmer i kræft. Nogle tidligere undersøgelser har vist, at RhoA og RhoC ekspression ofte øges i humane cancere, mens RhoB ofte nedreguleres. RhoT1 tilhører den mitokondrielle Rho GTPase familien [13]. Dog er RhoT1 protein klassificeret som atypiske GTPaser, fordi det ikke er reguleret som de andre klassiske GTPaser [14], [15]. Indtil videre lidt er kendt om den rolle, RhoT1 i kræft progression. I en tidligere undersøgelse, har vi identificeret i alt 1276 gener, der udtrykkes forskelligt i PDAC. Blandt disse er 691 gener opreguleres og 585 gener er nede-regulerede gener, herunder RhoT1, Smad4 og p16 [16]. Derfor er vi interesseret i at vide, om RhoT1 er ligeledes involveret i udviklingen af ​​kræft.

Desuden har tidligere undersøgelser rapporteret, at mutation af Smad4 er identificeret i ca. 50% af pancreas adenocarcinomer [17]. En række undersøgelser har vist, at tabet af Smad4 observeres generelt i pancreas carcinogenese, og inaktivering af Smad4 er forbundet med dårlig prognose i pancreascancer [18], [19]. Ligeledes er det blevet påvist, at tab af p16-ekspression observeres i de fleste pankreastumor [20], [21], og udgør en central begivenhed i flertrinsprocessen af ​​pancreas ductus celletransformation. Men betydningen af ​​p16 og Smad4 inaktivering for komplekse og vævsspecifikke aspekter af kræft i bugspytkirtlen progression, såsom angiogenese og metastase, er mindre forstået [22]., Der er også relativt få undersøgelser, der har undersøgt den mulige rolle af Smad4 og p16 i udviklingen af ​​LNM og PNI i bugspytkirtelkræft.

Kræft celle invasion og metastase er kritiske trin i bugspytkirtelkræft progression, og er de hovedårsagerne til ringe overlevelse i bugspytkirtelkræft. Forudsigelse invasion og metastase for patienter med kræft i bugspytkirtlen kan give vigtige indblik i kræft i bugspytkirtlen progression og prognose. Identifikation af biomarkører i forbindelse med resultatet af kræft i bugspytkirtlen kan give nye tilgange og mål for anticancer-terapi. Derfor har vi gennemført denne undersøgelse at undersøge ekspressionen af ​​RhoT1, Smad4 og p16 i bugspytkirtelkræft, og at analysere, om udtrykket mønstre af RhoT1, Smad4 og p16 er korreleret med metastatisk potentiale og er prædiktive for kliniske resultater hos patienter med pancreas kræft.

Resultater

Patient Kendetegn

Som vist i tabel 1, prøven bestod af 162 patienter med en diagnose af kræft i bugspytkirtlen (102 mænd og 60 kvinder). Den gennemsnitlige alder ved diagnose var 59 år gammel (interval 34-85 årige). Den mediane tumorstørrelse var 4 cm (spændvidde 0,5 til 14 cm). De fleste tumorer (117/162, 72%) var godt differentieret, 8 (8%) var moderat differentieret, og 31 (19%) var dårligt differentieret. 80 (49,4%) tumorer blev kategoriseret som amerikansk fælles udvalg om kræft (AJCC) fase I, 80 som (49,4%) fase II, ingen så stadie III, og 2 (1,2%) som trin IV. 83 (51,2%) af 162 patienter havde PNI. 65 (40,1%) af 162 patienter havde LNM, Median antal lymfeknuder (LN) undersøgte var 7. Den mediane antal LN vurderes i de node-positive patienter blev 10 sammenlignet med en median på 6 lymfeknuder i lymfeknude negative patienter (

P

= 0,007).

Foreninger mellem de forskellige klinisk-patologisk faktorer og tilstedeværelsen af ​​LNM og PNI

Foreninger mellem de forskellige klinisk-patologiske faktorer og tilstedeværelse af LNM og PNI blev analyseret for at identificere de risikofaktorer LNM og PNI (tabel 2). Disse faktorer omfattede: køn, alder ( 60 år eller ≧ 60 år), placering af tumor (hoved eller krop og bag), lange diameter tumor ( 4,0 cm eller ≧ 4,0 cm), tumor differentiering (dårlig eller moderat /godt). Placering af tumor var signifikant associeret med LNM (

P

= 0,03). Der var ingen signifikant sammenhæng mellem LNM og alder, køn, lang diameter på tumor og tumor differentiering (

P

0,05 for hver). Desuden blev der ikke observeret nogen signifikant sammenhæng mellem PNI og alder, køn, placering af tumor, lange diameter tumor og tumor differentiering (alle

P

0,05).

Expression af RhoT1, Smad4 og P16 i kræft i bugspytkirtlen væv og Paracancerous Væv

RhoT1 og p16 farvning blev lokaliseret til cytoplasmaet (figur 1). Selv blev Smad4 hovedsagelig udtrykkes i cytoplasmaet (figur 1), blev nogle Smad4 set i kernen. De cytoplasmatiske ekspressionsniveauer af RhoT1, Smad4 og P16 var lavere i kræft væv end paracancerous væv (

P

0,0001,

P

0,0001,

P

= 0,002 , henholdsvis). Der var en stærk sammenhæng mellem cytoplasmatisk og nuklear Smad4 udtryk (Spearman korrelationskoefficient = 0,321;

P

0,0001). Imidlertid blev der ikke signifikant forskel observeret i nuklear Smad4 udtryk mellem kræft væv og paracancerous væv (

P

0,05).

Paneler D, E og F viser henholdsvis positivt udtryk for RhoT1, Smad4 og p16 i paracancerous væv. Alle billeder blev taget ved 200 × forstørrelse.

Foreninger mellem ekspressionsniveauerne af RhoT1, Smad4 og P16, og de klinisk-patologisk funktioner

Analysen viste, at høj cytoplasmatisk udtryk niveau RhoT1 var signifikant negativ korrelation med LNM i kræft væv (

P

= 0,003). Forskellen fortsat betydelig, selv efter justering for alder, køn, kræft placering og lang diameter på tumor (

P

= 0,017). Ligeledes cytoplasmatisk ekspressionsniveauer af Smad4 og p16 i kræft væv blev også negativt korreleret med LNM (

P

= 0,032,

P

= 0,042, henholdsvis). Der var imidlertid ingen signifikante associationer mellem PNI og ekspressionsniveauerne af tre proteiner (alle

P

0,05; tabel 3). Da blev observeret nogen signifikant forskel mellem kræft væv og paracancerous væv, blev nukleare udtryk for Smad4 slået ud yderligere teste samarbejde med de klinisk-patologiske træk. Logistisk regressionsanalyse viste, at den cytoplasmatiske udtryk niveau RhoT1 i kræft væv fungeret som en selvstændig risikofaktor for LNM (

P =

0,042). Men ifølge analysen, de cytoplasmatiske ekspressionsniveauerne af Smad4 og p16 kunne ikke anvendes som selvstændige risikofaktorer for LNM (

P

0,05). Derudover viste resultaterne, at der ikke signifikant sammenhæng blev observeret mellem de cytoplasmatiske ekspressionsniveauer af RhoT1, Smad4, p16 og klinisk-patologiske træk, der herunder alder, køn, tumor placering, størrelse, tumor differentiering, og AJCC etape (alle

P

0,05;. tabel 4)

Derudover blev ROC kurver etableret for at vurdere den potentielle diagnostiske værdi af disse proteiner til at forudsige mellem prøver med LNM og prøver uden LNM. Analysen opdagede, at arealet under ROC-kurven (AUC) for RhoT1 var 0,629 [95%

konfidensinterval Hotel (

CI

) 0,541 til 0,718], AUC for Smad4 var 0,551 (95 %

CI

0461-,640) og AUC for p16 var 0.480 (95% konfidensinterval 0,388-0,572). Den statistiske analyse viste, at kun AUC hos RhoT1 var signifikant større end 0,5 (

P =

0,005). Ved afskæring på 75% (relative ekspression positiv-rate), følsomheden af ​​RhoT1 var 69,2% og specificiteten var 55,7% (Figur 2-A).

Arealet under ROC-kurven (AUC) for RhoT1 , Smad4 og p16 var 0,629, 0,551, og 0,480 henholdsvis. B Viser ROC kurve analyse af ekspressionen af ​​RhoT1, Smad4 og p16 for samlet overlevelse (

n =

70). De AUC-værdierne for tre proteiner var 0,667, 0,643, og 0,469 henholdsvis.

Survival Analysis

overlevelse Analysen viste, at overlevelsesraten efter 5 år var 28,6%, median overlevelse var 14 måneder. Analysen af ​​overlevelse viste LNM, tumor differentiering og fase (I

v

II) som værende negativt signifikante prædiktorer for bugspytkirtelkræft OS (

P =

0,01,

P =

0,003,

P =

0,036 henholdsvis), og patienter med en Lymfeknude ratio (LNR) 0 til 50% havde en længere median overlevelse (11 måneder) sammenlignet med patienter, der havde en LNR ≧ 50% (8 måneder) (

P

= 0,035) (data ikke vist). I modsætning hertil har evalueringen af ​​OS efter alder, gruppe, køn, tumor placering, tumorstørrelse, og PNI ikke angive nogen signifikante forskelle (

P

0,05 for alle). To patienter med stadie IV blev udelukket fra overlevelsesanalyse fordi prøvens størrelse var for lille.

Desuden 5-årige overlevelsesrater var 23,4%, 27,1% og 50%, 48,5% hos patienter med lavt -expression og høj ekspression af RhoT1 og Smad4 hhv. Patienter med højt cytoplasmatiske ekspressionsniveauer af RhoT1 og Smad4 opnået bedre overlevelse end patienter med lav-ekspressionsniveauer af RhoT1 og Smad4 (

P =

0,034,

P =

0,047 henholdsvis, figur 3) . Der var imidlertid ingen statistisk signifikant sammenhæng i OS mellem patienter med høj eller lav ekspression af p16 (

P =

0,148). De AUC-værdierne for RhoT1, Smad4 og P16 var 0,667 (95%

CI

0,532-0,802), 0,643 (95%

CI

0,509-0,777), og 0,469 (95%

CI

0,328-0,610) hhv. Derudover viste analysen, at AUC hos RhoT1 var signifikant større end 0,5 (

P =

0,022). Imidlertid blev der ikke observeret nogen signifikant forskel mellem områder af Smad4 og p16 i ROC-analyse (

P =

0,051,

P =

0,674 henholdsvis) (Figur 2-B).

høj ekspressionsniveauer af RhoT1 og Smad4 korreleret med bedre overlevelse (

P

= 0,034,

P =

0,047 henholdsvis; log rank test), blev der ikke observeret nogen signifikant sammenhæng mellem ekspressionsniveauet af p16 og samlet overlevelse (

P

0,05).

tabel 5 viser resultaterne af univariate Cox proportionel risiko analyse for de store clinicopathologic funktioner og for cytoplasmatisk udtryk for RhoT1 , Smad4 og p16 i bugspytkirtelkræft væv. Analysen viste, at variable med en stigning i risikoen for død inkluderet dårlig differentiering [

hazard ratio

(

HR

), 2,484; 95%

CI

, 1,329-4,642;

P =

0,004], Højere stadie (

HR

, 1,82; 95%

CI

, 1,01-3,28;

P =

0,044) og LNM (

HR

, 2,09; 95%

CI

, 1,16-3,77;

P =

0,014) og den lave ekspression af RhoT1 (

HR

, 1,92; 95%

CI

, 1,02-3,61;

P =

0,042). Multivariat analyse af Cox regression og korrektion for alle histopatologiske funktioner og RhoT1 udtryk viste, at tumor differentiering var en uafhængig prognostisk faktor (

P =

0,01), mens tumor stadie, LNM og RhoT1 udtryk ikke var statistisk signifikant (

P =

0,623,

P =

0,101,

P =

0,3 henholdsvis) (tabel 5).

diskussion

Igangværende undersøgelser har rapporteret, at molekylære markører kan give vigtige oplysninger til forståelse kræft i bugspytkirtlen progression bedre. Sammenligning af protein udtryk for kræft prøver med forskellige invasion og metastase status kan give et fingerpeg for nye metastase-associerede faktorer. I nærværende undersøgelse fandt vi, at der var væsentlige forskelle i den cytoplasmatiske udtryk for RhoT1, Smad4 og p16 mellem kræft og paracancerous væv. Disse resultater antydede, at RhoT1, Smad4 og p16 var involveret i udviklingen af ​​kræft i bugspytkirtlen. Endvidere blev lave cytoplasmatiske udtryk for RhoT1 og Smad4 forbundet med LNM og værre overlevelse hos patienter med kræft i bugspytkirtlen.

RhoT1 tilhører den mitokondrielle Rho GTPase familie og er først rapporteret af Fransson

et al

i 2003 [23]. Tidligere undersøgelser har vist, at Rho-GTPaser var involveret i reguleringen af ​​en bred række af cellulære processer, og spillede en vigtig rolle i carcinogenese, kræft cellemigration, invasion og metastase. For eksempel blev ekspressionen af ​​RhoA og RhoC ofte forøget i humane tumorer, over-ekspression af RhoA og RhoC i tumorer blev associeret med metastase og invasion [24]. I modsætning hertil RhoB blev ofte nedreguleret, lav ekspression af RhoB blev omvendt korreleret med tumor aggressivitet [25], [26], [27], [28]. Disse resultater indikerede, at der var forskelle i ekspressionsmønstre for Rho familiemedlemmer i human cancer. I denne undersøgelse fandt vi, at det cytoplasmatiske ekspressionsniveauet af RhoT1 i cancervæv var lavere end den, paracancerous væv, og var signifikant nedsat hos patienter med LNM sammenlignet med dem uden LNM (

P =

0,017) efter justering for alder, køn, kræft placering og lang diameter på tumor. Ligesom RhoB blev høj ekspression af RhoT1 negativt korreleret med tumor aggressivitet. Men dens nøjagtige molekylære mekanisme er stort set ukendt. Adskillige tidligere studeret har vist, at RhoT1 er impliceret i reguleringen af ​​mitokondrie homeostase og apoptose [15], [23], kan en mulig mekanisme være, at kræftcelle er resistent over for RhoT1-medieret apoptose og gør det muligt at undgå apoptotisk celledød, hvilket resulterer i initiering og progression af cancer. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse, som viser, at det cytoplasmatiske ekspression af RhoT1 er involveret i progressionen af ​​pancreascancer. Kollektivt antyder disse resultater, at RhoT1 kan være en hidtil ukendt tumorsuppressorgen af ​​kræft i bugspytkirtlen, og den lave cytoplasmiske ekspression af RhoT1 kan tjene som en potentiel prædiktor for tendensen til at metastasere. Der blev dog ikke signifikant sammenhæng mellem RhoT1 og PNI fundet i nærværende undersøgelse. Dette indikerer, at der kan være forskelle i mekanismerne mellem LNM og PNI. Yderligere undersøgelser er klart behov for at belyse den mekanisme af RhoT1 involveret i bugspytkirtelkræft.

Derudover Smad4 er en af ​​de mest almindeligt inaktiverede gener i pancreascancer, og tab af p16-ekspression observeres i de fleste pancreascancer [20 ], [21]. I denne undersøgelse fandt vi, at den lave ekspression af Smad4 var forbundet med LNM, hvilket var i overensstemmelse med resultaterne af nogle tidligere undersøgelser [29], [30], [31]. Tanaka

et al

[32] rapporterede, at tab af Smad4 proteinekspression og kromosom 18q sletning tydeligt var forbundet med metastaser. I en anden undersøgelse Tanaka

et al

fandt også, at ekspressionen af ​​Smad4 var svagere i lymfeknude positive sammenlignet med den negative gruppe (

P =

0,00075) [33]. Resultaterne indikerede, at Smad4 inaktivering var en væsentlig molekylær begivenhed i processen med LNM. Endvidere fandt vi, at lav ekspression af p16 var også korreleret med LNM, hvilket var i overensstemmelse med de følgende to undersøgelser. Zhi-jie Fu

et al

[34] rapporterede, at p16-ekspression i larynx planocellulært karcinom (LSCC) blev nedreguleret med cervikal LNM (

P

0,05), at down- udtryk for p16 kan være en vigtig indikator for livmoderhalskræft LNM hos patienter i LSCC. Daniela

et al

[35] foreslog, at positiv cytoplasmatisk p16 farvning kan være relateret til en lavere metastatisk potentiale af primær malignt melanom. Således er vores studie yderligere bekræftet, at Smad4 og p16 spiller vigtig rolle i processen med LNM i bugspytkirtelkræft.

I nærværende undersøgelse, vi yderligere undersøgt sammenhængen mellem de cytoplasmatiske ekspressionsniveauer af RhoT1, Smad4 og p16 og OS . Vi fandt, at patienter, hvis kræft havde lavt cytoplasmatisk udtryk niveau Smad4 havde signifikant dårligere overlevelse end patienter med højt cytoplasmatisk udtryk for Smad4 (

P =

0,047). Dette fund var i overensstemmelse med nogle tidligere forskning [36], [37]. Desuden har den mulige sammenhæng mellem ekspressionen af ​​nogle medlemmer af Rho-GTPaser og klinisk resultat tidligere blevet beskrevet. For eksempel, Takao

et al

[38] foreslog, at Rac1 var involveret i LNM af urothelial karcinom i de øvre urinveje, og forbundet med en kortere sygdomsfri overlevelse tid (

P

0,001). Ligeledes en anden undersøgelse [28] rapporterede, at den høje ekspression af RhoA og RhoC var forbundet ikke blot med muskel invasion og LNM (

P

0,001,

P

0,05, henholdsvis ), men også med dårligere overlevelse i blærekræft (

P

0,0001). Omvendt var høj ekspression af RhoB korreleret med bedre samlet overlevelse (

P

0,05). Imidlertid har hidtil få studier undersøgt forholdet mellem ekspressionen af ​​RhoT1 og resultatet eller prognose for patienter med kræft i bugspytkirtlen. I denne undersøgelse fandt vi, at høj RhoT1 ekspression omvendt var korreleret med overlevelsen af ​​patienter med kræft i bugspytkirtlen (

P =

0,034). Desuden er resultaterne af univariate Cox proportionel risiko analyse for den cytoplasmatiske udtryk for RhoT1, Smad4 og p16 i bugspytkirtelkræft væv viste, at den lave ekspression af RhoT1 var korreleret med en stigning i risikoen for død (

P =

0,042). Tilsammen den foreliggende undersøgelse, at RhoT1 kan betragtes som en potentiel prognostisk biomarkør for samlet overlevelse, og som et potentielt terapeutisk mål for intervention i patienter med kræft i bugspytkirtlen.

Afslutningsvis vores resultater viser, at lav cytoplasmatisk ekspressionsniveauer for RhoT1 og Smad4 var signifikant associeret med øget risiko for LNM og dårligere overlevelse. Så vidt vi ved, er dette den første rapport påviser, at ekspressionen af ​​RhoT1 potentielt kan anvendes til at forudsige resultatet af patienter med kræft i bugspytkirtlen. Flere studier med et større antal sager er nødvendige for at validere vores resultater.

Materialer og metoder

Patient Befolkning

Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité af Biobank center relaterede hospitaler. Prøver med informeret samtykke blev indsamlet mellem 1995 og 2009 fra 162 patienter, som gennemgik bugspytskirurgi, og blev opbevaret ved Biobank Center of National Engineering Center for Biochip på Shanghai. 162 patienter med både kliniske data og tilstrækkelig væv til inklusion i denne undersøgelse blev identificeret. Klinisk information, inkluderet alder, køn, præsentation og patologiske fund inkluderet tumorstørrelse, scene, differentiering, perineurale invasion og lymfeknude status, blev opnået fra originale patologi rapporter. Patologisk iscenesættelse blev opdateret i henhold til gældende amerikansk fælles udvalg om kræft retningslinjer. Da vi indsamlet og analyseret data med tilbagevirkende kraft, opfølgende data var ikke tilgængelige i alle tilfælde. Med en skæringsdato i december 2011 blev 92 patienter i vores undersøgelse tabte til opfølgning, 70 patienter med kræft i bugspytkirtlen blev inkluderet i vores endelige overlevelse analyse. Samlet overlevelse blev målt fra tidspunktet for endelig operation til døden fra kræft i bugspytkirtlen. Indtil nu, 46 af de 70 patienter døde.

Tissue Microarray Construction

Original formalinfikserede, paraffinindlejrede prøver blev anvendt til at konstruere en PDAC væv microarray (FFPE TMA). Hematoxylin og Eosin (H 2, 1 point for 20%; 3, 2 point for 20-75%; 4, 3 point for 75%, som tidligere beskrevet [39]. Dernæst blev den gennemsnitlige intensitet af immunoreaktivitet ligger på en skala fra 0 til 3 (0, ingen; 1, svag, 2, mellemliggende og 3 stærk). Den samlede score var produktet af scorer for intensiteten og positiv sats for farvning (Farvning index = intensitet × positiv sats, fraværende, 0, mild, 1-3; moderat, 4-6, og stærk, 7-9). Til analyse af data, Farvning indeks scoret som enten fraværende eller mild blev betragtet lavt udtryk, enten moderat eller stærk blev anset for high-udtryk. Slides blev gennemgået af 2 uafhængige observatører blindet til kliniske og patologiske data. I tilfælde af uenighed, blev opnået enighed ved fælles gennemgang.

Statistisk analyse

Sammenhængen mellem de enkelte klinisk-patologiske variabler og LNM, mellem dem, proteiner udtryk og LNM blev statistisk analyseret ved hjælp af χ

2 -test. Uafhængige risikofaktorer for LNM blev bestemt ved hjælp af logistisk regressionsanalyse for at identificere de variabler uafhængigt forbundet med metastaser. Den optimale følsomhed og specificitet ekspressionsniveauer af tre proteiner blev bedømt ved modtageren driftskarakteristik (ROC) kurve analyse. Kaplan-Meier-metoden blev anvendt til at estimere overlevelsesfunktionen, og log-rank testen blev anvendt til at undersøge den statistiske signifikans. Cox proportionel risiko model blev udført for at estimere hazard ratio for OS og at teste for uafhængige prognostiske faktorer. Alle statistikker var to-sidede med

P

værdi 0,05 betragtet som statistisk signifikant. Analyser blev udført ved hjælp af SPSS softwarepakken (version 17.0).