PLoS ONE: Capsaicin-induceret aktivering af p53-SMAR1 Auto-Regulatory Loop nedregulerer VEGF i ikke-småcellet lungekræft at begrænse Angiogenesis

Abstrakt

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-dødsfald verdensplan. Trods årtiers forskning, de behandlingsmuligheder for patienter med lungecancer forbliver utilstrækkelig, enten til at tilbyde en kur eller endda en væsentlig overlevelse fordel på grund af dens iboende resistens mod kemoterapi. Vores resultater foreslår effektiviteten af ​​capsaicin i nedregulering VEGF-ekspression i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) -celler i hypoksisk miljø. Capsaicin-behandling genaktiveres p53-SMAR1 positive feedback loop i disse celler at overtale p53-medieret HIF-1α nedbrydning og SMAR1-induceret undertrykkelse af COX-2-ekspression som behersket HIF-1α kernelokalisering. Sådanne signal-modulationer derfor ned regulerede VEGF udtryk at forpurre endothelcellemigration og dannelse netværk, forudsætninger af angiogenese i tumor mikro-miljø. Ovenstående resultater fortaler kandidatur capsaicin i udelukkende rettet mod angiogenese ved at nedregulere VEGF i tumorceller at opnå en mere effektiv og overbevisende terapi af resistente NSCLC

Henvisning:. Chakraborty S, Adhikary A, Mazumdar M, Mukherjee S , Bhattacharjee P, Guha D, et al. (2014) Capsaicin-induceret aktivering af p53-SMAR1 Auto-Regulatory Loop nedregulerer VEGF i ikke-småcellet lungekræft at begrænse angiogenese. PLoS ONE 9 (6): e99743. doi: 10,1371 /journal.pone.0099743

Redaktør: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, USA

Modtaget: December 31, 2013; Accepteret: 16 maj 2014; Udgivet: 13 juni 2014

Copyright: © 2014 Chakraborty et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. SC- University Grants Kommissionen- UGC 2-8 /2002 (SA I) (SA-I) dateret 06.11.2008. AA- Institut for Videnskab og Teknologi-DST R /3393/06 dateret 16.10.2006. MM Institut for Bioteknologi-DBT-RA dateret 05.06.2009. SM Råd videnskabelig og industriel Research-CSIR 09/015 (0386) /2010 EMR-1 dateret 22.02.2010. PB- Institut for Bioteknologi-DBT-RA dateret 01.06.2010. DG-University Grants Kommissionen- UGC 2-8 /2002 (SA I) dateret 21.04.2011. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Meget resistent ikke småcellet carcinom (NSCLC), som omfatter 80% af alle lungekræfttilfælde er uløseligt resistent over for kemoterapi og /eller strålebehandling. Da angiogenese er afgørende for NSCLC vækst og metastase, derfor kontrollerende tumorassocieret angiogenese kan være en lovende taktik i at begrænse NSCLC progression. Adskillige pro-angiogene faktorer, såsom vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) er højt udtrykt i tumormikromiljøet og stærkt inducere tumor angiogenesishttp: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3827603/- b3 [1] . Denne forskydning af tumormikromiljøet til en angiogen tilstand, eller “angiogen switch” [1], [2], er en vigtig hastighedsbegrænsende faktor i tumorudvikling.

Ekspression af VEGF-genet er blevet vist at være opreguleres ved hypoxi [3] – [5] og omsætningen af ​​VEGF medieres af hypoxi-inducerbare faktor-1 (HIF-1) [2], [3]. Under normoxiske betingelser, er HIF-1α niveauer kraftigt reguleret af oxygenspænding ved hydroxylering af prolylrester, mens hypoxiske betingelser hindrer prolyl hydroxylering af HIF-1α [4] og proteinet er stabiliseret, gør det muligt at transaktivere målgener som VEGF [3] . Et væld af rapporter stramt link HIF-1α til p53 i et omvendt forhold, hvor p53 hæmmer HIF-1α transskription [6] og inducerer dens nedbrydning under flere sub-cellulære betingelser for stress [7] derved http: //www.jbc. org /søge author1 = Joanna + Zawacka-Pankau ? sortspec = dato indsende = Submitresulting i sin potente undertrykkelse. Interessant er p53 stabiliseret af SMAR1, et stillads matrix-associerede region-bindende protein, gennem forskydning af Mdm2 fra p53 N-terminal lomme og dermed redning p53 fra Mdm2-medieret proteasomalaktivitet nedbrydning [8]. Moderne rapporter [9], [10] viser, at SMAR1 på mild DNA skader fremmer p53 deacetylering gennem rekruttering af HDAC1 og specifikt undertrykker Bax og Puma udtryk derved hæmmer apoptose. Disse rapporter ikke kun attestere kandidatur SMAR1 i modulering af aktiviteten af ​​p53, men også hæve muligheden for inddragelse af p53 i andre cellulære funktioner i det milde DNA-skadelige mikro-miljø af cellen. Vigtigere, har flere undersøgelser også identificeret komplekse cross-samtaler mellem p5

3 fotos og Cox-2, hvorved Cox-2 undertrykker p53-netværk i cancerceller [11], [12] og

omvendt

[12]. Alle disse oplysninger fristet os at gøre indsigt i eksistensen af ​​et interaktivt forhold mellem SMAR1, p53, Cox-2 og HIF1-α, hvis nogen, der afgør skæbnen for VEGF udtryk under tumor angiogenese i NSCLC. Inhibering af tumorvækst med antiangiogene midler er blevet opnået, hvor lovende antitumor-responser er blevet rapporteret for en række anti-VEGF hæmmere. Men toksicitet af de fleste af disse lægemidler samt udvikling af resistens mod de midler tilkendegiver nødvendigheden af ​​at identificere alternative ikke-toksiske midler til at opnå den kontinuerlige inhibering af angiogenese for effektiv NSCLC terapi.

Forøgelse beviser indikerede anticancer virkninger af capsaicin (8-methyl-

N

-vanillyl-6-nonenamid), den aktive komponent af chilipeber, mod forskellige cancertyper [13] – [18]. Capsaicin er blevet rapporteret til at provokere apoptose og begrænser benzo (a) pyren induceret lunge tumorigenese i schweiziske albino mus [19] og lindrer ubalancen i miljøfremmede enzymer og tumormarkører [20]. Ifølge Anandakumar

et al.

[20] capsaicin modulerer pulmonal antioxidantforsvarssystem under benzo (a) pyren-induceret lungekræft i schweiziske albinomus [19]. Endvidere capsaicin viser antiproliferativ aktivitet mod human småcellet lungecancer i cellekultur og nøgne musemodeller via E2F-vejen [21]. Seneste rapport fra vores laboratorium har vist apoptogenic effekt af capsaicin på humane NSCLC celler [22]. Der er imidlertid ingen rapport om den rolle, denne fytokemiske på NSCLC-induceret angiogenese. Endvidere selvom capsacin har vist sig at undertrykke human fibrosarkom-induceret angiogenese i kyllingechorioallantoinmembranen assay [23] ved at inhibere VEGF-induceret proliferation, og kapillær-lignende rør dannelse af primære dyrkede humane endotelceller, virkningen af ​​dette fytokemiske på VEGF-ekspression i NSCLC celle er endnu ikke blevet udforsket i detaljer.

Vores resultater betyde, at mens hindring af p53-SMAR1 loop induceret VEGF-ekspression i NLCSC celler og derved begunstige endotelceller (EF) migration og netværksdannelse i tumor miljø , reframing af disse pro-angiogene signaler ved capsaicin blokeret VEGF-produktion, selv under hypoxiske tilstanden, hvorved fastholdende NSCLC-induceret netto arbejde dannelse ved endotelcellerne. En sådan udvikling i forståelse kan tilbyde panorama af udelukkende rettet mod pro-angiogene faktorer og veje til at opnå en mere effektiv og overbevisende lungekræft terapi.

Materialer og Metoder

Cell kultur

Humane cancer cellelinjer, A549, MCF-7, HeLa, HCT-15, og normal lunge fibroblast WI-38, blev opnået fra Nationalt Center for Cell Science, Indien, og holdes ved 37 ° C og 5% CO

2 i DMEM medium suppleret med 10% FBS (Lonza, NH), L-glutamin (2 mM), natriumpyruvat (100 ug /ml), ikke-essentielle aminosyrer (100 uM), streptomycin (100 ug /ml), penicillin (50 U /ml; Invitogen, CA) [24]. Humane umbilical vene endotelceller (HUVEC) blev opnået fra HIMEDIA Cell Culture (Mumbai, Indien), og holdt ved 37 ° C og 5% CO

2 i M199 (Gibco, Grand Island, NY) suppleret med 20% FBS og EF vækst supplement (ECGS, BD Biosciences, Bedford, MA). Alle eksperimenter blev udført med HUVEC’er mellem passagerne 2-5. Levedygtige celleantal blev bestemt ved trypanblå eksklusion test [11].

For at efterligne hypoxi, A549 celler blev dyrket i nærværelse af 100 pmol /L CoC

2 (Sigma, St. Louis). Celler blev behandlet med capsaicin (Sigma, St. Louis), som kræves i eksperimentet. Når det er påkrævet, blev A549-celler behandlet med Brefeldin A (1 ug /ml, Calbiochem, NJ) og /eller MG 132 (10 uM, Sigma, St. Louis) og /eller rekombinant VEGF (0,8 ng /ml, for at holde ækvivalent mængde VEGF, der var til stede i Hy-A549 brugte medier, som blev anvendt ved 01:01 forholdet med M199 på endotelceller, PeproTech, CA) og /eller VEGF neutraliserende antistof (25 ng /ml, R Foster city , CA). De resulterende cDNA’er blev amplificeret med primere specifikke for VEGF 5′-GAGATGAGCTTCCTACAGCAC-3 ‘(fremad) og 5′-TCACCGCCTCGGCTTGTCACAT-3′ (revers), p53 5’-CCCACTCACCGTACTAA-3 ‘(fremad) og 5’-GTGGTTTCAAGGCCAGATGT-3 ‘(tilbage), HIF-1α 5′-TGGTGACATGATTTACATTTCTGA-3′ (fremad) og 5’-AAGGCCATTTCTGTGTGTAAGC-3 ‘(tilbage), SMAR1, 5′-GCATTGAGGCCAAGCTGAA-AGCTC-3′ (fremad) og 5’-GGAGTTCAGGGTGATGAGTGTGA C -3 ‘(tilbage), Cox-2 5′-tgat-CGAAGACTACGTGCAACA-3′ (fremad) og 5’-GCGGATGCCAGTGATAGAGTG-3 ‘(tilbage) og GAPDH (intern standard) 5′-CAGAACATCATCCCTGC-CTCT-3′ (fremad ), 5’-GCTT-GACAAAGTGGTCGTTGA-G-3 ‘(tilbage).

plasmider og siRNA transfektioner

pcDNA3.1 p53, pcDNA3.1 SMAR1 og pcDNA3.0 Cox-2 eller SMAR1-shRNA (300 pmol /millioner celler), og kontrol pcDNA3.0 vektorer (2 ug /million celler) blev indført i eksponentielt voksende kræftceller anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA) ifølge protokollen tilvejebragt af producenten. Stabilt udtrykker kloner blev isoleret ved begrænsende fortynding ved selektion med G418 (400 ug /ml; Cellgro, USA) og puromycin (1 ug /ml; Cellgro, USA) i 14 dage, og celler overlever denne behandling blev klonet og bedømt for p53, SMAR1 og Cox-2 ved immunblotting. For endogen silencing af specifikke gener blev celler transficeret med 300 pmol HIF-1α- /Cox-2 -siRNA (Santa Cruz, CA) og p53 shRNA (Santa Cruz, CA) under anvendelse af lipofectamin-2000 for 12 timer. MRNA og proteinniveauer blev bestemt ved RT-PCR og western blotting.

chromatin immunoprecipitation og PCR

Chippen assay blev udført som tidligere rapporteret af vores laboratorium [9]. Kort fortalt blev agaroseperler blokeret med BSA og, efter vask, perlerne blev præ-inkuberet med antistof mod SMAR1 /BANP (BTG-3 associeret kerneprotein, Santa Cruz, CA). Cellelysaterne blev sonikeret for at forskyde DNA til længder mellem 200 og 1000 basepar og derefter centrifugeret ved 13.000 rpm i 10 min ved 4 ° C. Supernatanter blev fortyndet 10 gange i ChIP fortyndingspuffer og tilsat til pelleterede agaroseperler, der var præinkuberet med antistoffer. Efter inkubation natten over ved 4 ° C blev perlerne vasket med lavt saltindhold, højt saltindhold, LiCI og Tris /EDTA-buffere. Endelig blev kromatin elueret ved inkubering af perlerne med 5 M NaCl ved 65 ° C, og proteiner blev fjernet ved behandling med proteinase K. ChIP DNA blev derefter oprenset under anvendelse af en passende oprensning kit og opbevaret ved -20 ° C. SMAR1-bundet ChIP DNA blev amplificeret ved anvendelse af PCR. Sekvenserne af sandsynlige SMAR1 bindingssteder på Cox-2-promotor er som følger: site-1: 5′-TGA-CCAGCATCCCAAATGTA-3 ‘(fremad) og 5′-TGAGGGA-AAAACAGGGCATA-3′ (tilbage); site-to 5’-CAAAAAGAAAATGA-TCCACGC-3 ‘(fremad) og 5′-TCATGAGACACGGATGCCTA-3′ (tilbage); site-3 5’-CCGTGTCTCA-TGAGGAATCA-3 ‘(fremad) og 5′-ATCATGGGTAGTGCTCAGGG-3′ (tilbage); site-4 5’-TGCT-GTCATTTTCCTGAATGC-3 ‘(fremad) og 5′-GGGGATTTTGACAGTTGGAA-3′ (tilbage); site-5 5’-GCCCAGGCA-ACTGAAAAGTA-3 ‘(fremad) og 5′-CTCCCTGATGCGTGGATTAT-3′ (tilbage); site-6 5’-TTT-TGGACATTTAGCG-TCCC-3 ‘(fremad) og 5’TGTTCTCCGTACCTTCA -CCC-3′ (tilbage); site-7 5’-TACCTTTCCC-GCCTCTCTTT-3 ‘(fremad) og 5′-TGGGGCGAGTA-AGGTTAAGA-3′ (tilbage); site-8 5’-AAC-CTTACTCGCCCCAGTCT-3 ‘(fremad) og 5’CAGA-AGGACACTTGG-CTTCC-3’ (tilbage).

Kvantitativ real-time PCR

Kvantitativ real -tid PCR blev udført for at kvantificere den tidsafhængige ekspressionsniveauer af VEGF og HIF-1α i capsaicin-behandlede Hy-A549-celler (22). Kvantitativ real time PCR blev udført i Master cyklusmaskinen gradient (en Applied Biosystems 7500 Sequence Detection System) under anvendelse af SYBR-green Rox mix (ABgene, Epsom, Storbritannien). Primere anvendt til VEGF er 5′-TCACAGGTACAGGGATGAGGACAC-3 ‘(fremad) og 5′-CAAAGCACAG-CAATGTCCTGAAG-3′ (revers) og for HIF-1α 5’-TGGTGACATGATTTACATTTCTGA-3 ‘(fremad) og 5’-AAGGCCATTTCTGTGTGTAAGC-3 ‘(tilbage).

statistiske analyser

Værdier er blevet vist som standard fejl af middelværdien (SEM) eller repræsentant for typisk eksperiment medmindre andet er angivet. Data blev analyseret, og når det er relevant, betydning af forskellene mellem middelværdierne blev bestemt ved Students

t

test. Resultaterne blev betragtet som signifikante ved

s

0,05. Alle forsøg blev udført uafhængigt tre gange

Resultater

Capsaicin hæmmer NSCLC-induceret EF migration og netværksdannelse

Da EF migration er et afgørende skridt for tumor-induceret angiogenese.; undersøgte vi migration af HUVEC’er i nærvær af det brugte medium fra kulturer af både normale celler og NSCLC. I kernen, HUVEC’er blev dyrket i fravær eller nærvær af brugt medier af normal lunge fibroblastceller (WI-38) og NSCLC celler (A549) samt COCI

2-stimulerede A549-celler (Hy-A549). Resultater af sårheling assay udviste ikke-signifikant migration af HUVEC’er i overværelse af brugt medier WI-38 celler, hvorimod blev betydelig migration observeret i tilstedeværelse af A549 brugt medier, en situation efterligne tumor-bærende tilstand (figur 1A) . Procent migration af HUVEC’er var endnu mere i Hy-A549 brugte medier (figur 1A), hvilket indikerer, at den hypoxiske tilstand favoriserer angiogenese. Hy-A549-celler blev derfor anvendt til resten af ​​forsøgene til at angive hypoxisk tilstand.

(A) Migration af HUVEC’er i nærvær eller fravær af brugte medier af NME, WI-38, A549 og Hy-A549 (CoCl

2-stimuleret til at efterligne hypoxisk tilstand kræves for tumor-induceret angiogenese) blev underkastet tovejs sårheling assay for 24 timer (

venstre panel Salg). Antallet af celler migreret i sårområdet, gengives grafisk (

højre panel

). (B) Repræsentative billeder af HUVEC migration ved inkubering med capsaicin-behandlede (0-50 uM) Hy-A549 celle brugt medium (

venstre panel

). Procent celle migreret i sårområdet har været repræsenteret grafisk (

højre panel

). (C) Hy-A549-celler blev behandlet med capsaicin på en dosis-afhængig måde i 24 timer og cellelevedygtigheden blev scoret af trypanblåt-udelukkelse assay (

venstre panel

). Hy-A549-celler, behandlet med capsaicin (37,5 uM), blev underkastet Annexin-V-FITC /PI binding og analyseret flow cytometrisk til bestemmelse af procent tidlig apoptose (

højre panel

). (D) cytotoksiske virkning af forskellige doser af capsaisin på HUVEC-celler blev målt ved trypan blåt farvestof-udelukkelse assay. (E) Grafisk fremstilling af HUVEC migration ved inkubering med brugte medier fra capsaicin-behandlede (37,5 uM) HBL-100, HCT-15, HeLa og A549. (F) Repræsentative billeder af kapillær-lignende spire dannelsen af ​​HUVEC’er i tilstedeværelse af medier alene eller brugte medier af WI-38 /A549 /Hy-A549 /capsaicin-behandlede Hy-A549. Værdier er gennemsnit ± SEM af tre uafhængige forsøg i hvert enkelt tilfælde eller repræsentant for typisk eksperiment.

Interessant, tilbragte-medier af capsaicin-behandlede Hy-A549 signifikant hæmmede tumor-induceret HUVEC migration i en capsaicin dosis -afhængig måde, den optimale effekt være på 37,5 uM capsaicin på 24 timer ud over der kunne være opnået nogen yderligere signifikant ændring (Figur 1B). Virkningen af ​​capsaicin på levedygtigheden af ​​Hy-A549-celler blev undersøgt ved trypanblåt-udelukkelse assay. Figur 1C (

venstre panel)

afbildet den dosisafhængige effekt af capsaicin på levedygtigheden af ​​Hy-A549 celler samt HUVEC (figur 1D). Resultaterne indikerede, at ved udsættelse i 24 timer, nåede capsaicin inducerede ikke nogen signifikant død i en af ​​cellerne Til koncentrationer på 37,5 uM. Disse resultater derved udelukket muligheden for forsinkelse af EF migration som følge af Hy-A549 celledød ved denne koncentration af capsaicin. Men koncentrationer, der overskrider 37,5 uM viste sig at være giftigt for både Hy-A549 celler og HUVEC (figur 1C,

venstre panel

og 1D). Yderligere eksperimenter blev derfor begrænset til 37,5 uM. For at vurdere om reduktionen i celletallet skyldes tidlig apoptose, blev antallet af Annexin-V-positive celler bestemmes ved flowcytometri. Resultater af figur 1C (

højre panel

) viste 37,5 uM dosis af capsaicin som sub-apoptotisk dosis for Hy-A549-celler. Disse resultater sammen sikrede fraværet af “indblanding” af apoptotiske celler ved 37,5 uM dosis capsaicin anvendt i de efterfølgende eksperimenter. At virkningen af ​​capsaicin ikke er begrænset til en bestemt type, blev valideret ved anvendelse af et batteri af cellelinier, dvs. HBL-100, HCT-15, HeLa og MCF-7 (figur 1E). For detaljerede mekanistiske undersøgelser blev udført eksperimenter med Hy-A549-celler.

Dernæst spire dannelse assay af EC’er blev udført på Matrigel, et veletableret angiogenese assay. HUVEC’er dannede rør-lignende netværk inden 8 h (figur 1F). Angiogen spire dannelsen af ​​HUVEC’er var højest i overværelse af brugte medier Hy-A549 celler efterfulgt af den af ​​A549 celler og WI-38 celler (figur 1F). Imidlertid capsaicin forbehandling af Hy-A549 effektivt hindret spire-dannelse ved HUVEC’er (figur 1F) hvor rørlignende strukturer blev reduceret både i bredden og i længden og viste ufuldstændig samt brudt netværksstrukturer (figur 1F).

Capsaicin inhiberer VEGF at forsinke cancercelle-induceret EF migration

Alle reaktionerne hidtil defineret forekom uafhængig af direkte kontakt af HUVEC-celler med tumorceller eller endda nærhed og derved øge muligheden for tilstedeværelse af tumor -shed opløselige pro-migrerende faktorer i de brugte medier. Støtte dette, brugte medium af Brefeldin-A-behandlede Hy-A549 ikke inducere signifikant EF migration (figur 2A) og capsaicin kunne ikke indføre nogen yderligere effekt (figur 2A). For at genbekræfte vores hypotese, effekt af capsaicin i reguleringen pro-angiogene faktorer som VEGF, bFGF, EGF, TGF-β, blev overvåget i Brefeldin-A forbehandlede Hy-A549 celler. Selvom capsaicin ikke påvirkede bFGF, EGF og TGF-β-niveauer det betydeligt nedreguleret VEGF-ekspression (figur 2B). Yderligere undersøgelser afslørede, at de brugte medier Hy-A549-celler (10

6 celler /ml medier) indeholdt et gennemsnit på 1,6 ng VEGF, der faldt betydeligt efter capsaicin behandling (figur 2C,

venstre panel

) . For at bedømme effekten af ​​capsaicin i regulering VEGF i Hy-A549 celler, vedtog vi nogle tilgange. I den første fremgangsmåde, blev da Brefeldin A-forbehandlede Hy-A549-celler behandlet med capsaicin i 24 timer, intracellulær VEGF blev ophævet både mRNA og protein niveauer (figur 2C,

midterste panel

). Disse observationer blev yderligere understøttet af vores kvantitative realtids PCR-data skildrer et fald i relativ VEGF mRNA-ekspression i Hy-A549 celler efter capsaicin behandling (figur 2C,

højre panel

) og igen bekræftet ved konfokal mikroskopi (figur 2D). I den anden fremgangsmåde, kontrol-medier suppleret med rekombinant VEGF (0,8 ng /ml) forøgede endotelcellemigration og spire-dannelse (Figur 2E 2F). I den tredje fremgangsmåde, når capsaicin-forbehandlet Hy-A549 brugt medium blev suppleret med rekombinant VEGF-protein (0,8 ng /ml), tilbageførsel af capsaicin virkning på EF migration og spire-dannelse blev observeret (figur 2E 2F). I den fjerde fremgangsmåde, viste HUVEC’er signifikant reduktion i migration (figur 2E) og spire-dannelse (figur 2F), når Hy-A549-celle brugte medium blev forbehandlet med anti-VEGF-antistof. Men anti-VEGF antistof undladt at fremlægge nogen væsentlig yderligere hæmmende virkning på HUVEC migration og spire dannelse i capsaicin præ-behandlede Hy-A549 brugte medier (figur 2E 2F). Disse resultater sammen valideret den hypotese, at Hy-A549-celle-skur VEGF spiller en afgørende rolle i cancer-induceret EF migration og spire-dannelse. Afore-møblerede observationer fristet os til at afgrænse den komplette mekanisme ligger til grund for reguleringen af ​​tumor angiogenese ved capsaicin.

(A) Repræsentant fase kontrast mikrofotografier demonstrerer HUVEC migration ved inkubering med brugte medier af Brefeldin-A-forbehandlet, capsaicin ( 37,5 uM) -behandlede Hy-A549-celler (

venstre panel

). Procent celle migreret i sårområdet har været repræsenteret grafisk (

højre panel

). (B) Immunoblots viser ekspressions profiler af pro-angiogene faktorer VEGF, bFGF, EGF, TGF-β, i nærvær eller fravær af capsaicin. (C) Udskilt VEGF fra cellefri supernatant af Hy-A549 blev kvantificeret ved ELISA-assay (

venstre panel

). Tidsafhængige udtryk profiler af VEGF-mRNA /-protein i capsaicin-behandlede Hy-A549-celler blev bestemt ved Western blot og RT-PCR henholdsvis (

midterste panel

). Capsaicin-behandlede Hy-A549-celler blev undersøgt for tidsafhængig variation i udtrykket profiler af VEGF ved kvantitativ realtids-PCR analyse og gengives grafisk (

højre panel

). (D) immunfluorescerende billeder (60x forstørrelse), der viser tidsafhængige mønster af VEGF-proteinet (TRITC-fluorescerende) i capsaicin-behandlede Hy-A549-celler var repræsenteret sammen med nuklear farvning (DAPI: blå). (E) Repræsentative billeder af HUVEC migration ved inkubering med (i) rekombinante VEGF-suppleret kontrolmedium eller VEGF-suppleret brugt medie af capsaicin-behandlede Hy-A549-celler, eller med (ii) anti-VEGF-behandlede Hy-A549 brugt medier (

venstre panel

). Procent celle migreret i sårområdet er gengives grafisk (

højre panel

). (F) Repræsentative billeder af kapillær-lignende spire-dannelse ved HUVEC’er ved inkubering med rekombinante VEGF-suppleret brugte medier af capsaicin-behandlede Hy-A549-celler eller med anti-VEGF-behandlede Hy-A549 brugte medier. GAPDH /α-Actin blev anvendt som intern loading kontrol. Værdier er gennemsnit ± SEM af tre uafhængige forsøg i hvert enkelt tilfælde eller repræsentant for typisk eksperiment.

Capsaicin hæmmer VEGF transskription ved at målrette HIF-1α

Som capsaicin reducerer VEGF både på det transkriptionelle samt translationelle niveauer vi den hypotese, at dette fytokemiske kan have en regulerende virkning på HIF-1α, den vigtigste transkriptionsfaktor af VEGF under hypoxi [4]. Interessant Capsaicin reduceret HIF-1α på proteinniveauet men ikke på mRNA-niveauet i Hy-A549-celler (figur 3A,

venstre panel

), der blev yderligere bekræftet ved vor kvantitativ realtids-PCR-data (figur 3A,

højre panel

). Endvidere HIF-1α-siRNA-transficerede Hy-A549-celler indrettet fald i VEGF-ekspression (figur 3B) og brugte medier i disse transfektanter significant mindre EF migration (figur 3C). Disse resultater indikerede, at capsaicin hæmmede VEGF ved nedmodulering sin centrale transkriptionsfaktor HIF-1α (figur 3C). Men da capsaicin behandling af disse transfektanter vist yderligere fald i VEGF, involvering af HIF-1α-uafhængige vej (e) af VEGF inhibering med capsaicin ikke kan være virkningsløs.

(A) Tidsafhængige udtryk profiler af HIF -1α mRNA og -protein blev bestemt ved Western blot og RT-PCR, henholdsvis i capsaicin-behandlede Hy-A549-celler (

venstre panel

). Capsaicin-behandlede Hy-A549-celler blev undersøgt for tidsafhængig variation i udtrykket profiler af HIF-1α ved kvantitativ realtids-PCR analyse og gengives grafisk (

højre panel

). (B) Hy-A549-celler, transient transficeret med en ikke-målrettet kontrol-siRNA eller HIF-1α-siRNA, blev inkuberet med /uden capsaicin i 24 timer; Cellerne blev derefter analyseret for at bestemme VEGF-ekspression på protein og mRNA-niveauer (

venstre panel

). Immunoblot viser transfektionseffektiviteten af ​​HIF-1α (

højre panel

) (C) Kontrol-siRNA /HIF-1α-siRNA-transficerede Hy-A549 celle-supernatanter blev anvendt til at vurdere HUVEC migration ved sårheling assay efter capsaicin -Behandling (37,5 uM, 24 h) og gengives grafisk. (D) Tidsafhængig ekspressionsprofil af p53-mRNA og -protein blev bestemt ved Western blotting og RT-PCR i capsaicin-behandlede Hy-A549-celler (

venstre panel Salg). p53 fosforylering på Serin-15 position blev også evalueret (

højre panel

). (E) Hy-A549-celler, der var transficeret med kontrol-shRNA /p53-shRNA blev inkuberet med capsaicin i 24 timer og HIF-1α VEGF-mRNA og -protein blev bestemt ved Western blot og RT-PCR (

venstre panel

). Transfektionseffektiviteten blev kontrolleret ved at analysere p53 udtryk niveau (

højre panel

). (F) HIF-1α blev immunopræcipiteret fra capsaicin-behandlede Hy-A549-cellelysater og immunoblottedes med anti-Ub-antistof til analyse HIF-1α ubiquitinering. Stigen af ​​bands repræsenteret ubiquitineret HIF-1α. Sideløbende eksperiment blev immunpræcipitater analyseret for HIF-1a-niveauer ved Western blot. Sammenlignelige protein input blev bekræftet ved direkte Western blotting med anti-α-actin under anvendelse af 20% af cellelysaterne, der blev anvendt til immunfældning. (G) Kontrol og MG-132 drug-forbehandlet Hy-A549-celler blev udsat for capsaicin-behandling i 24 timer og derefter blev undersøgt for ekspression af HIF-1α /VEGF ved Western blotting. α-Actin /GAPDH blev anvendt som intern loading kontrol. Værdier er gennemsnit ± SEM af tre uafhængige forsøg i hvert enkelt tilfælde eller repræsentant for typisk eksperiment.

Capsaicin henvender HIF-1α i en p53-afhængig måde

Da p53 direkte retter sig mod HIF- 1α for proteosomal nedbrydning [9], vurderede vi rollen af ​​p53, om nogen, i capsaicin-induceret regulering af HIF-1α og VEGF.