PLoS ONE: STED Super-Resolution Mikroskopi for Klinisk Paraffin-Embedded human endetarmskræft Tissue

Abstrakt

Formalin faste og paraffinindstøbt humant væv resektion under cancer kirurgi er uundværlig til diagnostiske og terapeutiske formål og repræsenterer et stort og stort set uudnyttet ressource for forskning. Optisk mikroskopi af prøveemnet er begrænset af diffraktion-begrænset opløsning på konventionel optisk mikroskopi. For at overvinde denne begrænsning, anvendte vi STED super opløsning mikroskopi muliggør optisk spaltning langt under diffraktion barriere. Vi visualiseret nanoskala protein fordelinger i sektioner af godt kommenteret paraffin-indlejret humant endetarmskræft væv gemt i en klinisk repository. Anvendelse af antisera mod flere mitokondrielle proteiner, sted mikroskopi afslørede distinkte sub-mitokondrieprotein distributioner, hvilket tyder på en høj grad af strukturel konservering. Analyse af humane væv opbevares i op til 17 år viste, at disse prøver var stadig modtagelig for super-opløsning mikroskopi. Sted mikroskopi af sektioner af HER2-positiv rektal adenocarcinom afsløret detaljer i overfladen og intracellulære HER2 fordeling, der blev sløret i de tilsvarende konventionelle billeder, der viser potentialet i super-opløsning mikroskopi til at udforske den hidtil stort set uudnyttet nanoskala regime i væv, der er lagret i biorepositories.

Henvisning: Ilgen P, Stoldt S, Conradi LC, Wurm CA, Rüschoff J, Ghadimi BM, et al. (2014) STED Super-Resolution Mikroskopi for Klinisk Paraffin-Embedded human Rektal kræftvæv. PLoS ONE 9 (7): e101563. doi: 10,1371 /journal.pone.0101563

Redaktør: Anthony W.I. Lo, Den kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: Marts 12, 2014 Accepteret: 9. juni 2014, Udgivet: 15 jul 2014

Copyright: © 2014 Ilgen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle data er inkluderet i papiret

Finansiering:. En del af arbejdet blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft gennem Cluster of Excellence “Nanoscale Microscopy og Molekylær Fysiologi af Brain” og projektet IMAGINT EU (Health-F5 -2.011-259.881) (begge til SJ) samt gennem KFO179 “Biologisk grundlag af individuelle tumor hos patienter med endetarmskræft.” de finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

antallet af humane vævsprøve gemt i (kliniske) biorepositories blev estimeret. på mere end 300 millioner allerede for 15 år siden i USA alene [1], [2]. Mange af disse prøver er blevet formalinfikseret og paraffinindlejret, en standard klinisk konserveringsmetode, der er i brug i mere end et århundrede. I mange kliniske omgivelser, er væv taget fra kræftpatienter i onkologiske kirurgi gemt i blokke af paraffin til diagnosticering, beslutning om postoperative behandlingsstrategier og opfølgende undersøgelser, der repræsenterer en stor og værdifuld ressource til at studere patologi og funktionelle grundlag for mange maligniteter.

for analyser, kan lagres og kommenteret paraffinindstøbt væv sektioneret, afvoksede, farves og derefter afbildet af konventionel lysmikroskopi. I klassisk (fluorescens) mikroskopi den opnåelige opløsning er begrænset af diffraktion til omkring 250 nm, begrænser det ekstraherbare oplysninger fra en prøve. Over de sidste ti år, flere super opløsning mikroskopi teknikker (Nanoscopy) er blevet udviklet, der tillader at fundamentalt overvinde diffraktion grænse, der gør det muligt fjernfelts mikroskopi med en væsentligt forbedret opløsning [3] -. [5]

af disse teknikker, stimuleret emission depletion (STED) mikroskopi fremstår som en tilgang, der kan anvendes sammen med immunolabeled prøver og som ikke kræver beregningsmæssige indsats for at skabe det endelige billede [6], [7]. I sted mikroskopi, er et let mønster, der anvendes til at hæmme fluorescens ved veldefineret prøve koordinater sådan, at tilstødende funktioner udsender sekventielt. Inhiberingen af ​​fluorescens opnås ved stimuleret emission af exciterede fluoroforer til grundtilstanden. I en typisk sted mikroskopi implementering fluoroforerne placeret på den ydre rand af en scanning fokal plet af excitation lys er forbigående slås fra ved de-excitation gennem stimuleret emission med en doughnut-formet STED-beam byder på en central nul. Som følge heraf, fluorophorer kun inden for en effektiv fokusering med en diameter på er i stand til at fluorescere. Her,

λ

er bølgelængden,

I

s

er karakteristisk for fluoroforen, og

I

max

betegner intensiteten af ​​toppen omsluttende nul. For

I

max

/

I

s

1, bliver den effektive fokus meget mindre end diffraktion grænse. Som en konsekvens, i modsætning til i konventionelle linse-baserede optiske mikroskoper, opløsningen er ikke længere begrænset af bølgelængden.

sted mikroskopi dermed egner sig som et effektivt værktøj til at åbne op for hidtil stort set uudnyttet nanoskala regime i arkiveret humant væv materiale. Tidligere har forskellige super opløsning teknikker blevet anvendt til at afbilde protein lokaliseringer i kemisk fikserede Vibratome sektioner eller cryostatsnit af mus eller rotte væv [8] – [10], samt i dele af plast indlejret væv fra gnavere, der udtrykker fluorescerende proteiner som tags [11], [12]. Sted mikroskopi er også blevet anvendt til at afbilde levende væv [13] – [15]. Ingen af ​​disse metoder kunne straks overføres til etablerede kliniske procedurer, som kræver standardiserede procedurer og mulighed for langsigtet prøve opbevaring.

For at undersøge om sted mikroskopi kan bruges til at visualisere protein distributioner i paraffin-indstøbt væv, vi brugte arkiveret rektal cancer væv, der var blevet resekteret under standardiseret total mesorectal excision (TME-kirurgi) og blev opbevaret ved stuetemperatur i op til 17 år i en klinisk patologi repository. Dette væv blev valgt til denne undersøgelse, fordi med en kontinuerligt stigende forekomst, er colorektal cancer blevet et af de tre hyppigste kræftformer i den vestlige verden [16]. En tredjedel af tarmkræft er rektal kræft, og på trods af fremskridt i diagnostik og multimodalitet behandling ved hjælp af præoperativ (neoadjuverende) kemostråleterapi efterfulgt af forlænget onkologiske TME-kirurgi, er den langsigtede prognose for patienter med lokalt fremskreden endetarmskræft begrænset af forekomst af fjerne metastaser i næsten 30% af patienterne [17] – [19]

Deregulering af signalering via human epidermal vækstfaktorreceptor (HER; også kendt som erbB) -familien af ​​proteiner har en indviklet rolle ved. patogenesen af ​​talrige humane cancere [20]. For nylig blev det påvist, at HER2 overudtrykt i -30% af den primære lokalt fremskreden rektal adenocarcinom, klinisk iscenesat som Union for International Cancer Control (UICC) iscenesætter II og III [21]. Der vides kun lidt om den subcellulære lokalisering af HER2 i tumorvæv.

I dette manuskript undersøgte vi muligheden for at visualisere nanoskala distribution af HER2 og andre proteiner ved hjælp STED super opløsning mikroskopi i arkiveret endetarmskræft væv. Vi viser, at selv væv opbevares i mere end et årti i en klinisk database er modtagelig for STED super-opløsning billeddannelse.

Resultater

Fluorescens mikroskopi af tyndslib

HER2-positiv rektal karcinom væv, arkiveres efter formalin fiksering og paraffin-indlejring, blev opdelt i 2 um tykke skiver. Vævssnittene blev afvokset og varmebehandlet i 45 min for antigen-genvinding [22]. Efter dette blev sektionerne farvet med DAPI for at fremhæve kerner og dekoreret med antisera mod integreret membranprotein HER2 og imod den mitokondriske ydre membran-protein Tom20, et essentielt protein udtrykkes i alle humane celler. Konfokal mikroskopi viste den stærke udtryk for HER2 i tumorvæv, mens de omgivende normale stromaceller ikke udtrykte en relevant mængde af HER2 (figur 1). Mitokondriemasse var højere i de maligne celler og som en konsekvens Tom20 var større, selv om, som forventet, Tom20 signaler var også påviselige i de normale stromaceller. DAPI signal var også genkendelig både i cancerceller og normale væv. Vi konkluderer, at flerfarvede immunofluorescens mærkning og konfokal mikroskopi er muligt på arkiveret rutinemæssigt behandles klinisk paraffinindstøbt væv.

Konfokal oversigt billede af en region i en HER2 positiv endetarmskræft vævssnit mærket med DAPI (blå) til fremhæve de kerner og dekoreret med antisera mod Tom20 (brand) og HER2 (grøn). (A) overlay, (B) Tom20, og (C) HER2. Scale barer:. 25 um

Strukturel konservering på nanoskala

Den optiske opløsning på konventionel konfokal mikroskopi er begrænset af diffraktion til -200 nm i aksiale plan, ofte skjuler værdifuld information . Paraffinindlejrede væv angiveligt udviser udtalt autofluorescens [23], og selv om den opnåelige strukturelle konservering af paraffinindlejret væv er tilstrækkelig til konventionel lysmikroskopi (figur 1; [24]), arkiverede væv kan være uegnet til at opfylde de høje krav til diffraktion ubegrænset super-opløsning mikroskopi. For at undersøge, om rutinemæssigt lagret paraffinindstøbt klinisk humant væv er egnet til sted mikroskopi, besluttede vi at analysere sub-mitokondrieprotein distributioner i mitokondrier. Disse organeller er udfordrende cellulære strukturer for super-opløsning mikroskopi på grund af deres lille størrelse, deres komplekse indre organellar arkitektur og meget tætte pakning af proteiner i de mitochondriemembraner [25]. Til dette formål har vi udnyttet paraffinindstøbt rektal cancer væv, der blev lagret i ~ 1 år ved stuetemperatur i en klinisk patologi arkiv. Vævssnit indeholdende et længdesnit af den indre cirkulære muskellag af rektum (

muscularis externa

) blev dekoreret med antisera mod fire forskellige mitokondrielle proteiner: Tom20, en perifer receptor TOM translocase i den mitokondriske ydre membran; Mic60 (mitofilin), en komponent i MINOS komplekset lokaliseret fortrinsvis ved cristae kryds i den indre membran; aconitase, en matrix enzym tricarboxylsyrecyklen katalyserer isomeriseringen af ​​citrat til isocitrat; og cyclophilin D, en peptidylprolyl isomerase lokaliseret i mitokondrie matrix.

mitokondrier i

muscularis externa

danner store aflange tubuli. Når vævsblokke blev skåret langs længdeaksen af ​​resektion rektale prøve, blev de fleste af de organeller strakt ud i snitplanet (figur 2A). Tværs af en stor STED billede af størrelse 120 um x 100 um, viste Tom20 en særskilt punktformet lokalisering i mitokondrierne (figur 2A), som er i fuld overensstemmelse med tidligere undersøgelser ved hjælp af forskellige former for super opløsning mikroskopi i dyrkede pattedyrceller [26] , [27]. Den opnåede opløsning, som bestemt på baggrund-klynger, var konsekvent ~ 40 nm i hele de optagede vævssnit (Figur S1). Betragtninger i de tilsvarende konfokale optagelser fordelingerne af Tom20, Mic60, aconitase og cyclophilin D var næsten ikke til at skelne, den højere opløsning leveres af sted mikroskopi viste forskelle i sub-mitokondrie fordelinger af de respektive proteiner (figur 2B-E). Tom20, aconitase og cyclophilin D blev generelt fundet i jævnt fordelte klynger, om end i forskellige mængder. Sektioner dekoreret med et antiserum mod cyclophilin D udstillet det tætteste klyngedannelse (Figur 2E), mens et antiserum mod aconitase resulterede i mærkning af sparsomme klynger (figur 2D). Som tidligere vist for Mic60 i dyrkede celler [28] forekommer dette protein også at have en mere ordnet fordeling i humant væv (figur 2C). Den overordnede sub-mitokondrie fordeling af de respektive proteiner i vævet var sammenlignelig med lokalisering observeres i dyrkede humane celler (figur S2).

STED registreringer blev udført på 2 um tykke afvoksede sektioner skåret langs længdeaksen af endetarmen. (A) Venstre: STED oversigt billede af en region i den indre cirkulære lag af rektal

muscularis externa

dekoreret med et antiserum mod Tom20. Højre: forstørrelser på de områder i de angivne stiplede firkanter viser fordelingen af ​​TOM klynger inden mitokondrierne. (B-E) Sted billeder af vævssnit dekoreret med antisera mod Tom20 (B), Mic60 (mitofilin) ​​(C), aconitase (D), og cyclophilin D (E). I hvert panel konfokal (øverst til venstre) og den tilsvarende STED billede (øverst til højre) vises. Nederst: Forstørrelse af STED billedet som vist med en stiplet firkant. Bemærk de forskellige fordelinger af de fire proteiner i mitokondrierne. Scale barer: 20 pm (A, til venstre); 1 um (A, højre) og (B-E, øverst); 200 nm (B-E, nederst).

Samlet set tyder disse data en tilstrækkelig strukturel konservering af rutinemæssig klinisk paraffinindstøbt væv kvalificere det til brug i STED super-opløsning mikroskopi.

STED super-opløsning mikroskopi af HER2 mærket rektal cancer væv

for at vurdere fordelen ved sted mikroskopi forhold til konventionel mikroskopi, vi visualiseret fordelingen af ​​HER2 i sektioner af rektal cancer væv, der blev mærket som HER2 -positive baseret på immunokemi og in situ hybridisering [21], [29]. Tre på hinanden følgende 2 um-tykke sektioner af paraffin-indstøbt væv blev skåret og behandles ens for afvoksning og antigen hentning. De tre sektioner dækker samme region, hvilket muliggør direkte at sammenligne egenskaberne af forskellige farvningsprocedurer. Det første afsnit blev farvet ved en standard klinisk Hematoxylin-Eosin (HE) procedure. Som følge heraf blev kernerne farves i blå, hvorimod cytoplasmaet og den extracellulære matrix optrådte i forskellige nuancer af pink (figur 3A). De andre to sektioner blev dekoreret med et antiserum mod HER2, men med forskellige sekundære antistoffer. For standard immunhistokemi, anvendte vi et sekundært antistof konjugeret med peroxidase, der katalyserer oxidationen af ​​3, 3′-diaminobenzidin, hvilket resulterer i en brun bundfald (figur 3B). Til fluorescens mikroskopi, sekundære antistoffer mærket med rødt fluorescerende farvestof KK114 [30] blev anvendt (figur 3C).

Bemærk, at tre på hinanden følgende sektioner dække samme region i vævet. Billederne blev taget med diffraktionsbegrænset Vidvinklet (A, B) eller konfokal (C) mikroskopi. (D, H) og (E, I): svarende forstørrelser af (B) og (C), henholdsvis på steder indikeret med pilene. (F, G, J, K): sammenligning af diffraktionsbegrænset konfokal mikroskopi med STED super opløsning mikroskopi på sektioneret lagret tumorvæv. Vist er forstørrelser af områderne angivet af de stiplede kvadrater. Top-højre hjørne: konfokal billedbehandling. Venstre-nederste område: STED billeddannelse. Pilene peger på HER2-positive vesikel-lignende strukturer, der er løst i Sted billederne. Scale barer:. 1 mm (A-C), 50 um (D, E, H, I), 2 um (F, J), og 500 nm (G, K)

HE farvning giver et overblik over vævet, mens immunhistokemi og immunofluorescens billeder viser stærk HER2 udtryk i tumorcellerne, men ikke i det omgivende ikke-maligne stroma væv. Dernæst sammenlignede vi immunhistokemi farvning med immunofluorescens mærkning som registreret af konfokal og sted mikroskopi (figur 3B-K). Til dette formål valgte vi tilsvarende regioner i de to forskelligt mærkede vævssnit. Hvorimod de konfokale billeder af immunofluorescens mærkning yde en højere kontrast og membranerne er mere skarpt afgrænset som i billeder af immunhistokemi farvning, vises den samlede informationsindhold sammenlignelige (figur 3D, E, H, I). Formentlig, vises immunfluorescens billede skarpere, fordi der i tilfælde af immunhistokemi den opnåelige opløsning er i sidste ende begrænset af diffusionen af ​​det brune bundfald. Begge metoder viser, at HER2 overvejende findes i plasmamembranen i rektale cancerceller. Sted mikroskopi muliggør visualisering af yderligere oplysninger, som er skjult i diffraktion-begrænset konfokale billeder (figur 3F, G, J, K; figur S3). Det STED billede viser tydeligt ~450 nm mellemstore HER2 positive vesikel-lignende strukturer, som kan være på grund af HER2 internalisering. De Sted billeder selv antyder eksistensen af ​​individuelle HER2 protein klynger, som er fuldt skjult i diffraktion-begrænset konventionelle billeder.

Vi konkluderer, at sub-cellulære fordeling af HER2 kan visualiseres i sektioner af arkiveret klinisk paraffin -embedded rektal cancer væv. Sted mikroskopi afslører strukturelle detaljer, herunder HER2 positive vesikel-lignende strukturer i den lagrede materiale, der er sløret, når du bruger state-of-the-art konventionelle lys mikroskopi.

STED super opløsning mikroskopi på arkiveret klinisk materiale efter lang -term opbevaring

potentialet i super opløsning mikroskopi på paraffin-indstøbt væv kan kun udforskes bredt hvis kunne bruges metoden på standard kliniske prøver, som de er gemt i talrige kliniske arkiver rundt om i verden. For at bestemme indflydelsen af ​​langvarig opbevaring på anvendeligheden af ​​det arkiverede væv til sted mikroskopi, anvendte vi paraffinindlejret, rektal cancer væv, der blev opbevaret ved stuetemperatur i en rutinemæssig klinisk patologi arkiv i op til 17 år. De paraffinindlejrede væv blev forbehandlet som før og mærket med antistoffer mod den mitokondriske protein Tom20 (figur 4). Vi fandt, at selv 17 år gamle væv kunne anvendes til immunfluorescens mærkning, selvom med stigende opbevaringstid på lysstyrken af ​​de mærkede sektioner blev reduceret, formodentlig afspejler et fald af tilgængelige epitoper i de ældede prøver. Bemærkelsesværdigt, selv i den ældste vævsprøve, individuelle Tom20 klynger kunne løses ved sted mikroskopi, som ikke var at se forskellene i de respektive tilsvarende diffraktion-begrænset konfokale billeder, der dokumenterer, at selv årtier gamle paraffinindstøbte humane væv er modtagelig for STED super-opløsning mikroskopi.

Repræsentative billeder af tumorvæv opbevares ved stuetemperatur i mindre end 1 år (A), 11 år (B) eller 17 år (C), blev snittet, afvoksede, dekoreret med et antiserum mod Tom20 og afbildes. Venstre: Repræsentative konfokale billeder. Den samme farve tabel blev anvendt til de tre billeder for at visualisere de relative farvende effektivitet. Mellemøsten /højre: Sammenligning af STED (midten) og konfokal (højre) mikroskopi af vævssnit af forskellig alder. Her blev farvetabellerne tilpasses de signalintensiteter opnåede. Scale barer:. 10 um (til venstre) og en um (midterste, højre)

Diskussion

Kræft væv resektion under onkologisk kirurgi er meget vigtigt for diagnostik. Til rutinemæssig analyse, er ekspressionsniveauerne af specifikke centrale proteiner generelt bestemt på tumor eller celleniveau. Proteiner, dog udføre deres funktioner lokalt, og dermed nanoskala fordeling af centrale proteiner kan indeholde værdifulde underskrifter, som hidtil ikke er blevet anset for klinisk diagnose. I denne undersøgelse viser vi, at STED super opløsning mikroskopi er velegnet til at afsløre nanoskala protein distributioner i væv, der er lagret i årtier i biorepositories og dermed åbne op for nanoskala i disse prøver.

Der er et enormt og hurtigt voksende mængde af vævsprøver opbevaret i forskellige biobanker. Biospecimen kvalitet betragtes som et kritisk [2], [31] og kvaliteten af ​​prøven vil også være kritisk for de data, der kan ekstraheres ved super-opløsning mikroskopi. Ikke desto mindre, på grund af praktiske begrænser den strukturelle konservering af prøven resektion under rutinemæssig operation forventes ikke at få kvalitetsniveauet, der er opnåeligt under strengt kontrollerede laboratorieforhold. Der er yderligere potentiale, men formentlig overvindes, udfordringer, herunder kvaliteten og tilgængeligheden af ​​egnede antistoffer og udfordringen at kombinere billeddata med fx metaboliske underskrifter af prøverne. Vi forestiller os, at den fremtidige udvikling i den super-opløsning felt herunder parallelisering af erhvervelsen billede [32], [33] samt automatiseret billedanalyse vil gøre det muligt skala analyse af biobanked væv ved hjælp af placering og andre teknikker super opløsning store.

Materialer og metoder

etik Statement

undersøgelsen blev godkendt af medicinske etiske komité ved universitetet i Göttingen (28 juni 2006; # 9/8 /08). Oprindelsen af ​​de specifikke prøver, der anvendes i denne undersøgelse er blevet beskrevet i en tidligere publikation [21].

Tissue fiksering og indlejring

Frisk reseceret væv blev fikseret i 4,5% bufferet formalin (Th. Geyer, Renningen, Tyskland) ved stuetemperatur i 12 til 24 timer. Det faste væv blev indlejret i paraffin automatisk (Süsse Labortechnik, Gudensberg, Tyskland) ved anvendelse af en vævsprocessor (Leica ASP 300, Leica Biosystems, Wetzlar, Tyskland). De paraffinblokke blev opbevaret i mørke ved stuetemperatur.

Udarbejdelse af væv slides

paraffinblokke blev kølet ned til -10 ° C på en køleplade (PFM Medical AG, Köln, Tyskland ). De afkølede paraffinblokke blev skåret i 2 um tykke vævssnit på en mikrotom (HM 430, MICROM International, Walldorf, Tyskland) og overført med en pensel i vand ved stuetemperatur før den blev monteret på objektglas. At strække de afskårne vævsprøver, blev objektglassene anbragt på en opvarmning tabel (MEDAX, Kiel, Tyskland) ved 37 ° C og tørres i en opvarmning inkubator ved 37 ° C natten over.

Afvoksning

De tørrede objektglas blev afparaffiniseret med Xylen (2 x 8 min) efterfulgt af en række faldende alkoholkoncentrationer (2 × 2 min 100% EtOH, 2 × 2 min 96% EtOH, 1 × 2 min 75% EtOH) og endelig skyllet 3 gange i vand.

Automatiseret immunhistokemi

Standardiseret immunhistokemisk farvning blev udført i en Ventana BenchMark XT Immunostainer (Ventana, Ventana Medical Systems, Mannheim, Tyskland). Brug af immunostainer, blev varmen epitopgenfinding automatisk udført på vævssnit i CC1 (Cell Conditioning 1 løsning, Ventana Medical Systems, Mannheim, Tyskland) buffer i 60 minutter ved 100 ° C. Efterfølgende blev vævssnit automatisk inkuberet med PATHWAY anti-HER-2 /neu (4B5) kanin monoklonalt antistof ved 37 ° C i 32 min. Derefter blev snittene dekoreret med sekundære antistoffer koblet til peberrodsperoxidase og farvet med 3,3′-diaminobenzidin (Ultraview Universal DAB Detection Kit; Ventana Medical Systems, Mannheim, Tyskland). Som kontrastfarve blev Hematoxylin II kontrastfarve reagens (Ventana Medical Systems, Mannheim, Tyskland) anvendt til at farve kerner. Endelig objektet dias var manuelt dehydreret i en serie af stigende orden alkoholiske koncentrationer (2 × 1 min 75% EtOH, 2 × 1 min 96% EtOH, 2 × 1 min 100% EtOH) med en endelig 2 minutters inkubation i Xylen. Objektglassene blev monteret i Vitro-clud (Langenbrinck, laborato- und Medizintechnik, Emmending, Tyskland). Denne metode blev anvendt til figur 3B, D, H.

Manuel Hematoxylin og eosin (HE) farvning

HE farvning blev udført på sektioner af afparaffinerede væv. De væv Objektglassene blev skyllet i vand og derefter nedsænket i Hemalum opløsning (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Tyskland) i 10 minutter. At muliggøre udviklingen af ​​den blå farve af de farvede kerner blev væv objektglassene skyllet i fanen vand i 10 min. Efterfølgende blev prøverne modfarvet i 30 sekunder i en Eosin opløsning (1% eosin i 37,5% EtOH, Merck Millipore), skyllet i rent H

2O og dehydreret i en serie af stigende orden alkoholiske koncentrationer (2 × 1 min 75% EtOH, 2 × 1 min 96% EtOH, 2 × 1 min 100% EtOH) med en endelig 2 min inkubation i Xylen. Objektglassene blev monteret i Vitro-clud (Langenbrinck, laborato- und Medizintechnik, Emmending, Tyskland). Denne metode blev anvendt til figur 3A.

Manuel antigen hentning

Sektioner blev overført til et dias kammer, nedsænket i CC1 løsning (Cell Conditioning en løsning, Ventana Medical Systems, Mannheim, Tyskland) og derefter opvarmet til 45-60 minutter ved 100 ° C i en damper (Multi Gourmet plus, Braun, Kronberg, Tyskland). Efter afkøling i 20 minutter blev objektglassene skyllet i vand.

Manuel immunolabeling

Snit blev blokeret med 5% eller 10% (vægt /volumen) BSA i PBS (137 mM NaCl, 3 mM KCI, 8 mM Na

2HPO

4, 1,5 mM KH

2PO

4, pH 7,4) i 5 min og inkuberet i 1 time med det primære kanin monoklonale antistof PATHWAY anti-HER-2 /neu (4B5) (Ventana Medical Systems, Mannheim, Tyskland; Katalognummer: 790-2991) (fortynding: 1: 50), polyklonale kanin antistoffer mod Tom20 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA; sc-11415) (fortynding: 1:200), polyklonale kanin antistoffer mod Mic60 /mitofilin (ABCAM, Cambridge, Storbritannien, ab48139) (fortynding: 1:200), polyklonale kanin antistoffer rettet mod aconitase (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA; HPA001097) (fortynding: 1:400), eller monoklonale antistoffer mod cyclophilin D (også betegnet cyclophilin 3 eller cyclophilin F; Abcam, Cambridge, UK; ab110324) (fortynding: 1:400) henholdsvis ved stuetemperatur. De primære antistoffer blev påvist med sekundære antistoffer (fåre-anti-mus eller ged anti-kanin; Jackson ImmunoResearch Laboratories) custom mærket med det røde emitterende farvestof KK114 [30] (fortynding: 1:200) eller et sekundært antistof (fåre-anti-muse , Dianova, Hamburg, Tyskland) custom mærket med den gule udsender farvestof Atto532 (ATTO-TEC, Siegen, Tyskland) (fortynding: 1:100). Efter immunolabeling blev vævsprøverne monteret i Mowiol suppleret med 0,1% (vægt /volumen) DABCO (1,4-diazabicyclo [2.2.2] octan; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og 2,5 ug /ml DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole; Sigma-Aldrich).

Mikroskopi

Alle viste billeder repræsenterer repræsentative billeder. Sektioner fra mere end 10 forskellige paraffinblokke blev analyseret, vedvarende tilsvarende ydelse. De immunhistokemi-farves og HE-farvede vævssnit blev afbildet med en Axio Imager 2 udstyret med en Axio-Cam MRC (Zeiss, Jena, Tyskland). For konfokal mikroskopi blev en Leica TCS SP5 mikroskop bruges (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland). For STED og den tilsvarende konfokal mikroskopi blev en specialbygget sted mikroskopi anvendes [26], [34]. En opløsning på -250 nm i konfokale billeder og ~ 40 nm i Sted billederne blev opnået. Resolutionen blev bestemt ved at måle den fulde bredde ved halvt maksimum (FWHM) i x- og y-aksen på mere end 100 background klynger, som formodentlig stammer fra udfældede sekundære antistoffer. Billeddannelse blev udført i det væsentlige som beskrevet tidligere [26], [34]. Bortset kontrast strække ingen yderligere billedbehandling blev anvendt.

Støtte Information

Figur S1.

Målt diameter på baggrund klynger taget fra figur 2. (A) Den fulde bredde ved halvt maksimum (FWHM) på tværs af x og y akser mere end 100 individuelle klynger blev bestemt. Bemærk at også baggrunden klynger, der var fysisk større end den opløsning af mikroskopet blev analyseret. Derfor kan det bestemmes gennemsnitlige FWHM være værre end den faktiske opløsning af mikroskopet anvendes. (B) Repræsentative baggrund klynger. Scale bar: 100 nm

doi:. 10,1371 /journal.pone.0101563.s001

(TIF)

Figur S2. Salg Sub-mitokondrie protein fordelinger i dyrkede humane celler, der er optaget med en STED (til venstre) og konfokal (højre) mikroskop. Detalje af mitokondrier dekoreret med antisera mod Tom20 (A), aconitase (B), Mic60 /mitofilin (C), eller cyclophilin D (D). Humane primære fibroblaster (A, C) eller U2OS (human knogle osteosarkom epitelceller) (B, D). Scale barer: 500 nm

Doi:. 10,1371 /journal.pone.0101563.s002

(TIF)

Figur S3.

Linje profil gennem et område taget fra figur 3F. The STED super-opløsning billede (A) afslører HER2-positive vesikel-lignende strukturer, der er sløret i den tilsvarende konfokal billede (B). (C) Normaliserede fluorescenssignal intensitetsprofiler langs de angivne linjer i STED (rød) og konfokale (sort) billeder. Scatter plot viser fluorescens signaler gennemsnit over 3 tilstødende intensitet profiler. De fuldt optrukne linier repræsenterer de tilsvarende passer anvendelse af en Lorentz-funktion. Målestok:. 500 nm

doi: 10,1371 /journal.pone.0101563.s003

(TIF)

Tak

Vi står i gæld til Stefan W. Hell for diskussioner og støtte. Vi takker Jaydev Jethwa for kritisk læsning af manuskriptet og Birgit Jünemann og Hanna Styczen fra Institut for General, Visceral og Pediatric Surgery, for fremragende teknisk bistand og analyser af standard væv farvninger.