PLoS ONE: RAN Nucleo-Cytoplasmatisk Transport og mitosespindelen Assembly Partners XPO7 og TPX2 er nye Prognostiske Biomarkører i serøs epithelial kræft i æggestokkene

Abstrakt

Formål

epitelovariecancer har den højeste dødelighed af alle gynækologiske maligniteter. Vi har vist, at høje RAN ekspression tæt korreleret til høj kvalitet og ringe overlevelse patient med epitelial ovariecancer. Men som RAN er en lille GTPase involveret i to vigtigste biologiske funktioner, nucleo-cytoplasmatisk transport og mitose, er det stadig ukendt, hvilke af disse funktioner associeret med dårlig prognose.

Metoder

For at undersøge den biomarkør værdien af ​​RAN netværkskomponenter i serøs epitelial ovariecancer, protein ekspression af seks specifikke RAN partnere blev analyseret ved immunohistokemi under anvendelse af et væv microarray repræsenterer 143 patienter associeret med kliniske parametre. RAN BNP /GTP cyklus blev evalueret af ekspressionen af ​​RANBP1 og RCC1 den mitosefunktion af TPX2 og IMPβ, og nucleo-cytoplasmatisk handel funktion ved XPO7, XPOT og IMPβ.

Resultater

Baseret på Kaplan-Meier-analyser, RAN, cytoplasmatisk XPO7 og TPX2 var signifikant forbundet med dårlig samlet patient overlevelse, og RAN og TPX2 var forbundet med lavere sygdomsfri overlevelse hos patienter med høj kvalitet serøse carcinom. Cox regressionsanalyse viste, at RAN og TPX2 udtryk var uafhængige prognostiske faktorer for både samlet og sygdomsfri overlevelse, og at cytoplasmatisk XPO7 udtryk var en prognostisk faktor for den samlede patient overlevelse.

Konklusioner

I denne systematisk undersøgelse viser vi, at RAN og to protein partnere involveret i sine Nucleo-cytoplasmatisk og mitotiske funktioner (XPO7 og TPX2 henholdsvis) kan anvendes som biomarkører at stratificere patienterne baseret på prognose. Især vi rapporteret for første gang den kliniske relevans af exportin XPO7 og viste, at TPX2 udtryk havde den stærkeste prognostiske værdi. Disse resultater tyder på, at protein partnere i hver af RAN funktioner kan skelne mellem forskellige resultater i høj kvalitet serøse epitelial æggestokkene kræftpatienter. Desuden er disse proteiner peger på cellulære processer, der i sidste ende kan være målrettet for at forbedre overlevelsen i serøs epitelial ovariekræft

Henvisning:. Cáceres-Gorriti KY, Carmona E, Barres V, Rahimi K, LETOURNEAU IJ, Tonin PN et al. (2014) RAN Nucleo-Cytoplasmatisk Transport og mitosespindelen Assembly Partners XPO7 og TPX2 er nye Prognostiske Biomarkører i serøs epithelial kræft i æggestokkene. PLoS ONE 9 (3): e91000. doi: 10,1371 /journal.pone.0091000

Redaktør: Eric Asselin, University of Quebec på Trois-Rivieres, Canada

Modtaget: 26 juli, 2013; Accepteret: 6 feb 2014; Udgivet: 13 marts 2014

Copyright: © 2014 Cáceres-Gorriti et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling (MOP # 36056) fra den canadiske Institutes of Health Research (CIHR) til a-MM-M, PNT og DP. Tumor banking blev støttet af Banque de tissus et données af Réseau de recherche sur le cancer i Fond de recherche du Québec – Santé (FRQS), der er forbundet med den canadiske Tumor Repository Network (CTRNet). KYC-G blev delvist understøttet af stipendier fra Carole Epstein Foundation og Canderel fond af Institut du kræft de Montréal. IJL blev understøttet af en FRQS postdoc uddannelse award. A-MM-M og DMP er forskere fra Centre de recherche du Centre hospitalier de l’Université de Montréal (CRCHUM) og PNT er forsker ved Forskningsinstitut for McGill University Health Centre (muhc), som begge får støtte fra FRQS. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epithelial ovariecancer (EOC) er den mest dødbringende af alle gynækologiske maligniteter i Nordamerika [1] og i hele verden. Dette tilskrives den asymptomatisk sygdommens art indebærer en sen diagnose med en fem-års overlevelse på 30% [2], [3]. I løbet af de sidste 30 år har fremskridt inden for kirurgi og kemoterapi haft ringe indflydelse på den samlede patient overlevelse [4], [5] og nuværende behandling fører til tilbagefald i størstedelen af ​​patienterne. Ca. 80% af EOC patienter præsenterer en serøs histotype [6], [7], som er kategoriseret efter tumor kvalitet og til klinisk fase, der repræsenterer graden af ​​cellulær differentiering og spredning af sygdommen [8] hhv. Molekylær beviser understøtter en klassificering, der adskiller patienter med disse serøse carcinomer i to typer: patienter med lav-grade tumorer (LG, godt differentierede) og med høj kvalitet tumorer (HG, dårligt differentierede) [9], [10]. Patienter med LG serøse tumorer har typisk en god prognose, men tegner sig for 5% af alle serøse EOCs. Patienter med HG serøs karcinom har en dårlig prognose med overlevelse på fem-års mindre end 40% [11]. Forskning i disse to forskellige sygdomme, LG og HG serøs EOC, vil således give en bedre forståelse af kræft i æggestokkene biologi og hjælpe med at forbedre de kliniske resultater. Desuden kan biomarkør opdagelse diskriminerende HG serøse EOC patienter med god eller dårlig prognose bidrage til patient terapeutisk lagdeling og kan øge den samlede overlevelse.

I tidligere undersøgelser, vi har vist, at RAN (RA-relateret Nuclear protein), i EOC, er over udtrykt som tumor lønklasse stiger og er stærkt forbundet med dårlig patient overlevelse [12], [13]. Derfor Ran funktioner kan dereguleres i ovariecarcinomer og RAN ekspressionsmønstre kan anvendes som prognostisk værktøj i patienter med fremskreden EOC.

In vitro

, anvendelsen af ​​en kort hårnål RNA (shRNA) målretning RAN ekspression forhindrer EOC celleproliferation, hvilket antyder RAN som et potentielt medgørlige terapeutisk mål til behandling af denne sygdom [14]. Desuden faldende RAN udtryk i

in vivo

mus xenograft eksperimenter resulterede i anholdelsen af ​​EOC tumorvækst [14]. Disse observationer indikerer, at RAN er involveret i kræft i æggestokkene progression og kunne være impliceret i tumorigenese og /eller celle overlevelse. Disse resultater korrelerer godt med lignende undersøgelser i forskellige typer af kræft [15] – [19].

På det cellulære niveau, RAN udfører to store og tydelige funktioner. Ved interfase, RAN regulerer nucleo-cytoplasmatisk transport af molekyler gennem den nukleare pore kompleks [20], [21]. Ved mitose, RAN udfører en anden funktion og styrer cellecyklusprogression gennem regulering af mitosespindelen dannelse [22]

RAN-GTP cyklus er reguleret af tre proteiner.; RCC1, RAN-GAP1, og RANBP1 [23], [24]. RCC1 udvekslinger BNP for GTP, konvertering af RAN-BNP til RAN-GTP [23]. I modsætning hertil RANBP1 og RAN-GAP1 arbejde for at øge GTP hydrolyse [24] og dermed genopbygge RAN-BNP pool [25], [26]. RAN bruger samme GTP /GDP cyklus at regulere begge dets fysiologiske funktioner. Imidlertid gradient GTP /GDP opnås ved disse regulatorer er unik for hver funktion af RAN. For nuklear transport, er gradienten etableres tværs kernemembranen ved asymmetrisk fordeling af regulatoren proteiner [27]. Under mitose, selv om ingen membran adskiller de regulerende myndigheder, er en gradient opnået i nærhed til kromosomet med RCC1 er fastgjort til kromosomer [27].

Selvom RAN bruger de samme regulatorer til GTP /BNP udveksling, det udnytter unik partner proteiner under interfase og mitose til at udføre forskellige fysiologiske funktioner (transport vs. spindel forsamling). Under interfase, er berigelsen af ​​RAN-GTP i kernen koblet til exportins såsom exportin-t (XPOT) [28], [29] og exportin-7 (XPO7 også kaldet RANBP16) [30], [31], som tjene som adaptorer ved at fastgøre tRNA’er og proteiner, henholdsvis at tillade nuklear eksport af deres last. I modsætning hertil RAN-BNP i cytoplasmaet binder sig til importins, såsom importin β (IMPβ) [32], [33], der anerkender den nukleare lokalisering (NLS) af proteiner for at lette deres bevægelse gennem den nukleare kuvert. Under mitose, RAN-GTP fremmer spindelenhed på en måde, der er uafhængig af nuklear transport [34]. IMP-p binder og hæmmer spindel samling faktorer, såsom TPX2 (Målretning Protein for Xklp2). I nærhed til kromosomer, er TPX2 efterfølgende frigives lette reguleringen af ​​mikrotubuli organisation og dynamik [35].

Formålet med dette studie var at undersøge, hvilken funktion af RAN ville være mere relevant impliceret i HG serøs EOC malignitet og dårlig patientoverlevelse. For at verificere effekten af ​​én funktion

versus

den anden, udtryk for molekylære partnere, specifikke for Nucleo-cytoplasmatisk transport og mitose, blev analyseret ved immunhistokemi på en væv microarray af 143 serøse carcinomer omfattende 131 tilfælde af HG og 12 af LG tumorer. Vi evaluerede udtryk for individuelle proteiner i sammenhæng med kliniske parametre og bestemt deres tilknytning til EOC progression og resultat. Lovende resultater blev opnået for to RAN partnere, XPO7 og TPX2, med potentiale til at være klinisk relevant i stratificering HG serøse EOC patienter.

Metoder

Etik Statement

kammerat institutionelle etiske komité (Comité d’éthique de la recherche du Centre hospitalier de l’Université de Montréal) godkendte denne undersøgelse og skriftligt samtykke blev opnået fra patienter forud for prøvetagning.

patienter og vævsprøver

Tumor prøver blev opnået fra patienter, som gennemgik kirurgi for kræft i æggestokkene på Institut for Gynækologisk onkologi – Centre hospitalier de l’Université de Montréal (KAMMERAT). En gynækolog-onkolog beslutsom sygdom etape som defineret af Federation International for Gynækologi og Obstetrik (FIGO). En uafhængig patolog revideret histopatologi og tumor klasse. kriterier for denne undersøgelse Tissue valg var baseret på en uafhængig bekræftelse af serøs histopatologi i prøver fra kemoterapi-naive patienter. Prøverne blev indsamlet mellem 1990 og 2006. Patient samlet overlevelse blev defineret som tiden fra kirurgi til døden af ​​kræft i æggestokkene eller sidste opfølgning. Patient sygdomsfri overlevelse blev beregnet ud fra tidspunktet for kirurgi, indtil den første progression. Derfor kun patienter, der skred indgik i vores analyse. Kliniske data om progressionsfri interval blev defineret i henhold til niveauet af blod CA125 og tumorstørrelse vurderet af billeddannelse. Patienter kendt for at være i live på tidspunktet for analysen blev censureret på tidspunktet for deres sidste opfølgning. Alderen for diagnose af patienter med LG tumorer varierede fra 27 til 71 år (gennemsnit = 48,5 år), og de blev fulgt 50,6 måneder i gennemsnit. Alderen af ​​patienter med HG tumorer varierede fra 34 til 87 år (gennemsnit = 62,6 år) og deres gennemsnitlige opfølgning var 37,2 måneder. Den kohorte er beskrevet i tabel S1.

Epithelial serøs æggestokkene tumorvæv Microarray (TMA)

Alle sager blev gennemgået af en gynækologisk patolog. Karakteren og typen af ​​ovariecancer [9], [10] blev identificeret og områder af interesse blev markeret på dias. To kerner på 1 mm for hver vævsprøve blev opstillet på to recipient paraffinblokke. Dette væv vifte bestod af kerner fra 12 LG og 131 HG tumorer (2 kerner per patient prøve) af serøs histopatologiske undertype og seks paraffinindstøbte EOC cellelinie pellets som farvning kontroller (292 i alt kerner). TMA blev derefter sektioneret, farvet med hematoxylin-eosin og udsat for en anden anmeldelse af væv patologi at kontrollere tilstedeværelsen af ​​tumor materiale i hver kerne.

Western blot analyse

kvalitet og specificitet individuelle antistoffer hvor verificeret ved Western blot-analyse. Samlede proteinekstrakter (30 ug) blev fyldt og elektroforeret på SDS-polyacrylamidgel derefter overført på en nitrocellulosemembran. Membranerne blev blokeret med 5% mælk-PBS (1 time) og derefter probet med primære antistoffer (2 timer ved stuetemperatur) ved den optimale fortyndinger (1:500 til RAN, XPO7, XPOT og TPX2; 1:200 for IMPβ; 1:300 for RCC1; 1:75 til RANBP1). Hvert primært antistof blev påvist med et HRP-konjugeret sekundært antistof (Santa Cruz Biotechnology Inc.) og visualiseret ved den forøget kemiluminescens (ECL) -metoden (GE Healthcare, UK). Beta-actin blev anvendt som en loading kontrol (1:50,000) (Abcam, Cambridge, MA).

Immunhistokemi (IHC)

I den manuelle farvningsfremgangsmåde, TMA blok blev sektioneret på 4 um på SuperFrost + glas objektglas (Fisher Scientific Limited, Nepean, ON, Canada). Objektglas blev opvarmet ved 60 ° C i 15 minutter, afparaffiniseret i xylen, rehydreret i en ethanol-gradient, og vasket i phosphatbufret saltvand (PBS). At afsløre antigener blev objektglassene anbragt i 20 minutter ved høj temperatur under højt tryk i citratbuffer (10 mM natriumcitrat, 0,05% Tween 20, pH 6,0) og farvning med anti-RCC1 (1/50, SC-1161, Santa Cruz Biotechnology Inc.), anti-IMPβ (1/25, SC-1863 Santa Cruz Biotechnology Inc.) og anti-TPX2 (1/100, NBP1-01041, Novus Biologicals), eller i citrat-EDTA-buffer (10 mM natrium citrat, 1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 8,0) til farvning med anti-RANBP1 (1/25, SC-1159, Santa Cruz Biotechnology Inc.), anti-XPOT (1/50, LS-C80366, Levetid Biosciences Inc.) og anti-XPO7 (1/200, LS-C55360, Levetid Biosciences Inc.) antistoffer. Objektglas blev derefter inkuberet med 3% hydrogenperoxid i PBS (for at blokere endogen peroxidase) og vasket i PBS. Vævssnit blev blokeret med en ikke-serumprotein-blokerende reagens (DakoCytomation Inc., Mississauga, ON, Canada) i 15 minutter ved stuetemperatur og inkuberet med primært antistof i 60 minutter ved stuetemperatur i et fugtigt kammer. Substitution af det primære antistof med PBS tjente som en negativ kontrol. Objektglassene blev derefter vasket i PBS, inkuberet med sekundære antistoffer konjugeret med peberrodsperoxidase (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA). Reaktionsprodukter blev udviklet ved anvendelse diaminobenzidin (DAB) indeholdende 0,3% hydrogenperoxid op til 5 min. Cellekerner blev modfarvet med fortyndet hæmatoxylin i 1 min.

For automatisk farvning metode, sektioner af formalin fast paraffin indlejrede tumorer (4 um) blev farvet ved hjælp af den BenchMark XT automatiseret farvningsværktøjet (Ventana Medical System Inc., Tucson , AZ). Antigen-genvinding til RAN blev udført med Cell Conditioning 1 (Ventana Medical System Inc.) i 30 minutter. Objektglas blev inkuberet med anti-RAN-antistof (1/100, SC-1156, Santa Cruz Biotechnology Inc.) i 40 minutter, og udviklet af iView DAB detektion kit (Ventana Medical System Inc.). Hematoxylin og blånelse reagens blev anvendt til kontrafarvning (Ventana Medical System Inc.). TMA’er blev observeret af lysfelt mikroskopi og digitalt afbildet (Aperio ScanScope, Vista, Californien, USA).

Farvning Kvantificering

Proteinekspression ved IHC blev scoret i henhold til den subcellulære lokalisering og farvning intensitet ondartet celler. Nuklear og cytoplasmatisk ekspression af RAN netværk proteiner i ovariecancer væv blev observeret ved anvendelse af digitalt afbildet scanninger af hver farves TMA og afsluttet efter intensiteten af ​​farvning. For hver RAN netværk protein i epitelceller zoner af tumoren kerner, blev farvningen intensiteten af ​​DAB defineret som 0 (ingen farvning), 1 (svag farvning), 2 (moderat farvning) og 3 (stærk farvning). Alle TMAs blev analyseret i en blindtest af to uafhængige observatører. Inter-rating korrelation (ICC) var større end 75% for alle assays. Gennemsnittet af alle kerner med kræft fra den samme patient blev anvendt til analyse. Når stærke forskelle i scoring mellem de to observatører opstod kernen blev revurderet til at nå til enighed mellem de to observatører.

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS softwareversion 16,0 ( SPSS Inc., Chicago, IL, USA), hvor p 0,05 blev anset for betydelig. Protein ekspressionsmønstre for RAN partnere blev korreleret (Pearson korrelation test, to-halet) med proteinet ekspression af RAN og sygdomsstadie (I-IV). Overlevelse kurver (samlet overlevelse og sygdomsfri overlevelse) blev afbildet af Kaplan-Meier estimator, sammenlignet ved hjælp af log-rank test og analyseret for signifikante forskelle. For hver RAN partner, er antallet af patienter i alle overlevelse kurve revideret i tabel S2. Univariate og multivariate Cox proportional hazard modeller blev anvendt til at bestemme hazard ratio for hver markør. Multivariate analyser blev udført under anvendelse af en fare model med en indtaste metode. Højst fire uafhængige variable indgik i multivariat Cox regressionsmodellen at undgå over-montering.

Resultater

Angivelse af RAN og dets netværk Partner Proteiner i serøs EOC Væv

for at afgøre, om nogen af ​​partnerne i RAN er impliceret i biologi EOC, udførte vi en IHC-analyse ved hjælp af en TMA indeholder i alt 286 kerner af prøver kræft repræsenterer 143 patienter. RAN og de seks RAN-partner proteiner (RANBP1, RCC1, IMPβ, XPO7, XPOT og TPX2), blev analyseret ved hjælp af dette væv array. Specificitet for hvert antistof blev først vurderet ved Western blot-analyse under anvendelse af cellulære ekstrakter af fire EOC cellelinier (figur S1) og ved IHC under anvendelse paraffinindlejrede cellepellets fra samme cellelinjer (figur S2). Intensiteten og lokaliseringen af ​​farvningen blev derefter vurderet under anvendelse af digitalt afbildet scanninger af hver farvet TMA. Nuklear og cytoplasmatisk udtryk for RAN netværk proteiner i EOC væv blev observeret og klassificeret i henhold til den gennemsnitlige intensitet farvning så lav (scores 1), medium (scores = 1 2) og høje (scores ≥2) (figur 1) , bortset TPX2, som blev klassificeret som fraværende (scores = 0) eller til stede (scores 0). på grund af den unikke farvningsmønster af dette protein (figur 1-2) Salg

Repræsentative billeder af immunoperoxydase farvning mønster på en TMA kerne er vist for hvert protein og tumorklassificering (forstørrelse 20 ×). Kvantificering af RAN (A-B), RANBP1 (C-D) og IMPβ (G-H) blev udelukkende til cytoplasmatisk farvning. RCC1 (E-F) og TPX2 (M-N) udelukkende blev lokaliseret til kernen. XPO7 (I-J) og XPOT (K-L) blev kvantificeret for både deres nukleare og cytoplasmatisk udtryk.

For hvert protein blev farvningsintensitet defineret som 0 (ingen farvning), 1 ( svag farvning), 2 (moderat farvning) eller 3 (mørk farvning) inden for epithelial rum af to uafhængige observatører. Gennemsnittet af farvningen intensitet for hvert protein blev sammenlignet mellem lav kvalitet (hvide søjler) og høj kvalitet tumorer (grå søjler) under anvendelse af en Student-test. * P 0,05 ** p≤0.005

udtryk for RANBP1 (BNP) og RCC1 (GTP), der er generelle proteiner relateret til RAN-GTP cyklus, blev oprindeligt undersøgt.. IMPβ udtryk blev analyseret til samtidigt at evaluere begge de to hovedfunktioner RAN. Så vi specifikt udforsket nucleo-cytoplasmatisk funktion af RAN ved at vurdere ekspressionen af ​​to exportins: XPO7 og XPOT. Endelig undersøgte vi TPX2 modstykke for at evaluere spindelkonstruktion under mitose, en anden vigtig funktion af RAN. Figur 1 viser repræsentative billeder til farvning af hvert protein i HG serøse ovariecarcinomer. Ekspression af RAN (Figur 1A-C), RANBP1 (figur 1D-F) og IMPβ (fig 1J-L) blev lokaliseret til både cytoplasmaet og kernen, selv om signal kvantificering udelukkende fokuseret på cytoplasmaet baseret på dets højere ekspression i dette cellulære rum. Ekspression af RCC1 (figur 1G-I) og TPX2 (Figur 1Y-Z) blev nukleare. Nuklear og cytoplasmatisk farvning blev observeret for XPO7 (Figur 1 M-R) og XPOT (figur 1S-X) proteiner, og begge blev kvantificeret.

Ran Network Proteiner korreleret med Tumor Grade

Under etableret farvningen mønster for hver af RAN netværk proteiner, vi derefter vurderet farvningsintensiteten ifølge tumor bedømmelse (figur 2). I en tidligere undersøgelse, rapporterede vi den iagttagelse, at RAN farvning var positivt forbundet med øget tumor klasse i serøs EOC [13]. I den foreliggende undersøgelse under anvendelse af en beriget patient kohorte, vi yderligere bekræfte vores indledende fund viser at niveauer af cytoplasmatisk RAN ​​var signifikant højere i HG tumorer sammenlignet med LG tumorer (p 0,001) (figur 2A). Det cytoplasmatiske farvning intensitet RANBP1 (p 0,001), IMPβ (p = 0,048), og nuklear lokalisering af RCC1 (p = 0,004) var signifikant højere i HG versus LG tumorer (Figur 2B-D). For Nucleo-cytoplasmatisk RAN ​​netværk proteiner, blev nukleare XPO7 betydeligt mindre udtrykt i HG end LG tumorer (p = 0,005), hvorimod der ikke blev observeret nogen signifikante forskelle på cytoplasmatisk XPO7 farvning eller til cytoplasmatisk /nukleare XPOT farvning (Figur 2E-2H). Interessant, i modsætning til alle andre RAN netværk proteiner undersøgt, farvning for den mitotiske RAN partner TPX2 blev fundet udelukkende inden kerner af HG serøse carcinomer (p 0,001) (Figur 2i). Dets ekspression blev dikotomiseret som enten positiv eller fraværende på grund af den unikke farvningsmønster af dette protein i tumorer i patienter. Vores resultater antyder, at deregulering af RAN netværk er karakteristisk for HG serøs EOC, og er således i overensstemmelse med den nylige forestilling, at HG og LG serøs EOC er særskilte sygdomsenheder [9], [10].

Vi dernæst undersøgte sammenhængen mellem ekspressionen af ​​RAN og hver af RAN netværkspartnere hjælp af Pearson korrelation test (to-halet) (tabel 1). Som forventet, de er involveret i GTP-cyklus og IMPβ proteiner, var positivt korreleret med RAN (RANBP1, s 0,001; RCC1, p = 0,026, IMPβ, s 0,001), hvilket tyder på en kompetent RAN GTPase cyklus (tabel 1). For nucleo-cytoplasmatisk rolle RAN blev en signifikant positiv sammenhæng fundet for cytoplasmatisk XPO7 (p = 0,028) samt nuklear XPOT udtryk (p = 0,050) (Tabel 1). Imidlertid blev der ikke observeret nogen korrelation mellem farvning intensiteter af RAN og TPX2, som kunne forklares ved den indirekte karakter af deres interaktion i mitose [35].

Sammenhængen mellem ekspression af RAN eller af RAN netværkspartnere med sygdomsstadium blev også undersøgt under anvendelse af Pearson korrelation test (to-halet) (tabel 1). En signifikant korrelation observeredes kun RANBP1 farvning (p = 0,034), som viser en svag negativ sammenhæng (Pearson koefficient = -0,181) (tabel 1).

RAN, XPO7 og TPX2 er forbundet med dårlig Patient Survival

Vi undersøgte sammenhængen mellem ekspression af RAN partner proteiner og samlet overlevelse i kohorte af 143 patienter. Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev afledt og sammenlignet ved log-rank test kun HG tilfælde (Figur 3, tabel S2-S3). LG sager blev ikke medtaget på grund af det lave antal patienter, hvilket afspejler sjældenhed af denne sygdom, og på grund af deres særlige sygdom karakteristika i forhold til HG sager. En tærskelværdi kunne ikke opnås ved ROC kurver analyser, og at undgå bias i at vælge en cut-off for hvert protein blev alle farvende score (grupperet som vist i figur 1) tages i betragtning ved udledning af Kaplan-Meier-kurver for hver protein.

Angivelse af RAN netværk proteiner blev vurderet som prognostiske indikatorer i kun de high-grade serøse carcinomer ved Kaplan-Meier analyse. Overlevelse blev defineret som tiden fra operation til død af kræft i æggestokkene eller sidste opfølgning. Af log-rank testen blev anvendt til at definere statistisk forskel mellem grupperne. For paneler A-H, lav farvning (blå linje) er defineret af værdier 1, medium farvning (grøn linje) defineret ved = 1 2 og høj farvning (lyserød linje) defineret som ≥2. For panel I, prøver scoret som negativ (sort linie) eller positiv (grå linie) i TPX2 farvning. I A-I, p angiver signifikans blandt alle grupper. For paneler J-K, negative TPX2 farvning med lav farvning intensitet RAN (J -Sort linje) eller XPO7 (K – sort linje); negativ TPX2 farvning med medium + høj farvning af RAN (J – cyan linje) eller XPO7 (K – violet linje); positiv TPX2 farvning med medium + høj farvning af RAN (J – grå linje) eller XPO7 (K – grå linje). I J-K, er p (øverste højre hjørne) beregnet for sort versus cyan (RAN, panel J) eller violet (XPO7, panel K). I J-K, p (nederste venstre hjørne) beregnes for grå versus cyan (RAN, panel J) eller violet (XPO7, panel K). A-K, p 0,05 er angivet med fed skrift

Stigende niveauer af cytoplasmatisk RAN ​​farvning i HG serøs EOC var signifikant associeret med en dårligere samlet overlevelse (p = 0,016;. Figur 3A, tabel S3 ). Disse observationer er i overensstemmelse med vores foreløbige resultater [13]. Af de RAN netværkspartnere, den høje cytoplasmatisk udtryk for XPO7 (p = 0,02, figur 3E) og høj nukleare TPX2 udtryk (p = 0,002, figur 3I) blev korreleret med generelle kortere overlevelse

For yderligere at undersøge. potentielle prognostiske betydning af RAN og dets partnerlande proteiner i den samlede patient overlevelse blev univariate Cox regressionsanalyser udført (tabel 2). Cytoplasmatisk RAN ​​og XPO7 farvning og lokalisering nukleare TPX2 i HG serøs EOC var signifikant korreleret med dårlig samlet overlevelse (p = 0,008, p = 0,027, p = 0,002, henholdsvis). Disse proteiner var betydelige uafhængige prognostiske faktorer for overlevelse med hazard ratio (HR = 1,82 for RAN, HR = 1,58 for XPO7 og HR = 2,66 for TPX2) sammenlignes med residual sygdom (HR = 1,82), en kendt prognostisk faktor [3] .

samlet set vores resultater tyder på, at XPO7, der er involveret i RAN s nucleo-cytoplasmatisk eksport af proteiner, og TPX2, partner i RAN i mitose, samt RAN selv, kan bidrage til maligne potentiale serøs EOC og indflydelse patientens samlede overlevelse.

Foreningen af ​​RAN og TPX2 med gentagelse i serøse EOC Patienter

betydningen af ​​RAN netværk proteiner i tilbagefald i forbindelse med sygdomsfri overlevelse blev vurderet af Kaplan-Meier-kurve og Cox regressionsanalyser som beskrevet ovenfor. Stigende niveauer af cytoplasmatisk RAN ​​farvning i HG serøse EOCs var signifikant associeret med kortere sygdomsfri overlevelse ved Kaplan-Meier analyse (p = 0,014, figur 4A, tabel S3). Af RAN netværk proteiner, analyser Kaplan-Meier-kurve findes kun lokalisering nukleare TPX2 som signifikant associeret med tilbagefald i HG serøs EOC (p = 0,004, figur 4I, tabel S3). Univariate Cox regressionsanalyser valideret disse resultater, hvor RAN (p = 0,006) og TPX2 (p = 0,006) proteiner viste signifikant sammenhæng med recidiv (tabel 2). Disse resultater var også sammenlignelige med hazard ratio bestemt for residual sygdom (tabel 2).

Evaluering af RAN netværk proteinekspression på kun høj kvalitet serøse carcinomer ved Kaplan-Meier analyse. Progressionsfri overlevelse svarer til den tid i måneder regnet fra tidspunktet for den første operation, indtil den første progression. Af log-rank testen blev anvendt til at definere statistisk forskel mellem grupperne. (Se figur 3 legende for detaljer).

Derfor er vores resultater tyder på, at RAN s mitosefunktion specifikt via sin TPX2 partner, ser ud til at være forbundet med en gentagelse af HG serøs EOC.

multivariate analyser bekræfter den Stærke Foreningen af ​​TPX2 Expression i Patient overlevelse og sygdom Gentagelse

for yderligere at definere den potentielle prognostiske værdi af RAN protein-netværket blev multivariate Cox regressionsanalyser udført for RAN og hver partner, der opnås betydning i univariate analyser.

Hazard forhold mellem RAN blev XPO7 og TPX2 for den samlede patient overlevelse i forhold til standard prognostiske faktorer såsom scenen og residual sygdom (tabel 2). Vores resultater viser, at kun RAN (p = 0,015, HR = 1,84), TPX2 (p = 0,033, HR = 2,15) og resterende sygdom (p 0,05) var væsentlige uafhængige prognostiske markører for samlet overlevelse i HG tumorer. Interessant, både RAN og TPX2 havde højere HRs end residual sygdom (tabel 2).

For tilbagefald, blev mønsteret for ekspressionen af ​​RAN og TPX2 også i forhold til standard prognose variabler (fase og resterende sygdom). I HG tumorer, kun RAN (p = 0,013, HR = 1,69) og TPX2 (p = 0,024, HR = 2,53) var uafhængige variable forudsiger en høj risiko for recidiv (tabel 2).

A Samtidig Over- udtryk Mønster af TPX2 /RAN eller TPX2 /XPO7 er associeret med en dårligere prognose i serøse EOC Patienter

Vores resultater viser, at udtrykket mønstre af RAN og dens mitotiske partner TPX2 i serøs EOC handle som selvstændige prognostiske biomarkører for både samlet patient overlevelse og gentagelse. Vi næste evaluerede den kombinerede effekt af disse to kandidat biomarkører på overordnet og sygdomsfri overlevelse ved hjælp af Kaplan-Meier-kurve analyse. Vores resultater viste en signifikant forskel mellem farvede mønstre af RAN og TPX2 i progressionsfri overlevelse (figur 4J) i HG tilfælde. Især blev den samtidige tilstedeværelse af RAN og TPX2 forbundet med kortere sygdomsfri overlevelse sammenlignet med tilstedeværelsen af ​​RAN alene (15 måneder mod 30 måneder, p = 0,001, figur 4J). Den samme tendens blev også observeret for den samlede patient overlevelse med borderline signifikans (p = 0,07, figur 3J). Anvendelse af de samme analyser, vi også vist, at XPO7 og TPX2 ekspressionsmønstre var signifikant forbundet med både dårligere samlet overlevelse (p = 0,012) og kortere sygdomsfri overlevelse (p = 0,012) sammenlignet med tilstedeværelsen af ​​kun XPO7 (figur 3K, figur 4K). Det er bemærkelsesværdigt, at TPX2 udtryk, når det skete, var altid forbundet med enten RAN eller XPO7 co-ekspression.

Diskussion

Høj RAN ekspressionsniveauerne er blevet rapporteret i forskellige tumorer, såsom bugspytkirtel , colon, lunge, nasopharynx, mave og nyre, sammenlignet med normale væv [17] – [19], [36]. Interessant nok har RNA-interferens undersøgelser vist, at RAN nedregulering drastisk påvirker cancerceller overlevelse, men ikke fra normale celler [14], [18]. Men på trods af den afgørende betydning af RAN i cancerceller har det været vanskeligt at afgøre, hvilken funktion af dette protein er involveret i tumorigenese. Til at begynde at løse dette problem, vi har studeret udtryk for flere RAN partnere, specifik for dens forskellige funktioner, i samarbejde med EOC patient overlevelse og gentagelse.

Ved hjælp af en større kohorte, vi har bekræftet vores første resultater, at patienter med høj RAN ekspression i serøs EOC er forbundet med sygdommen og dårligt resultat [12], [13]. β-actin blev anvendt som en loading kontrol.