PLoS ONE: overvinde Modstand af kræftceller til PARP-1 hæmmere med tre forskellige Drug Combinations

Abstrakt

Inhibitors af poly [ADP-ribose] polymerase 1 (PARPis) lovende til behandling af kræft, der mangler kapacitet til homolog rekombination reparation (HRR). Men nye terapeutiske strategier kræves for at overvinde medfødt og erhvervet resistens over for disse stoffer, og dermed udvide den vifte af kræftsygdomme, der kunne drage fordel af dem. Vi viser, at menneskelige kræftceller, der reagerer dårligt på ABT-888 (en PARPi), bliver følsom over for det, når co-behandlet med vorinostat (en histondeacetylaseinhibitor (HDACi)). Vorinostat også sensibiliserede PARPis ufølsomme kræftceller til 6-thioguanin (6-TG) -a stof, der er målrettet PARPis sensitive celler. Den sensibiliserende effekt af vorinostat var forbundet med øget phosphorylering af eukaryot initieringsfaktor (elF) 2α, som i sig selv øger følsomheden af ​​cancerceller til ABT-888. Vigtigt er det, har disse lægemiddelkombinationer ikke påvirke overlevelsen af ​​normale fibroblaster og bryst celler, og signifikant øget hæmning af xenograft tumorvækst i forhold til hvert lægemiddel alene, uden at påvirke musene vægt eller deres lever- og nyrefunktion. Vores resultater viser, at kombinationen af ​​vorinostat og ABT-888 kan vise sig nyttige til behandling af cancer med medfødt resistens over PARPis grund aktiv HRR maskiner, mens kombinationen af ​​vorinostat og 6-TG potentielt kunne overvinde medfødt eller erhvervet resistens over for PARPis grund sekundære eller vending BRCA mutationer, til nedsat PARP-1-niveau eller til forøget ekspression af flere lægemiddelresistente proteiner. Vigtigt er det, kan lægemidler, som øger fosforylering af eIF2α efterligne sensibiliserende effekt af vorinostat på cellulært respons på PARPis eller 6-TG, uden at aktivere alle sine nedstrømseffektorer

Henvisning:. Ayalon M, Tuval-Kochen L, Castel D, Moshe I, Mazal I, Cohen O, et al. (2016) overvinde Modstand af kræftceller til PARP-1 hæmmere med tre forskellige Drug Kombinationer. PLoS ONE 11 (5): e0155711. doi: 10,1371 /journal.pone.0155711

Redaktør: Gayle E. Woloschak, Northwestern University Feinberg School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: Juli 5, 2015; Accepteret: 3 maj 2016; Udgivet: May 19, 2016

Copyright: © 2016 Ayalon et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. https://ec.europa.eu/research/mariecurieactions/Grant # PCIG10-GA-2011 til 303.795. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Det er for nylig blevet opdaget, at bryst-, ovarie- og prostata cancer celler, som bærer bi-allele mutationer for brystkræft modtagelighed genet (BRCA) 1 eller BRCA 2, eller at der phosphatase og tensin homolog deficient (og derfor ude af stand til udtrykke RAD51), er ekstremt følsomme over for hæmmere af PARPis og sletning af PARP-1 [1,2]. Disse resultater forstærkede opfattelsen af, at nedsat evne til HRR resultater i følsomhed over for PARPis.

Den menneskelige PARP familie består af 17 enzymer hver især er produktet af et andet gen. Enzymerne alle besidder konserverede katalytiske domæner og DNA-bindende domæner. PARP-1 binder til strandede replikationsgafler samt til enkelt strengbrud (SSB’er), som kan dannes spontant, under basen excision reparation eller som respons på DNA-beskadigende midler. Binding til DNA-læsioner aktiverer PARP-1 fører til tilsætning af poly (ADP-ribose) dele fra NAD

+ for proteiner involveret i DNA-reparation og replikation herunder PARP-1 selv og histoner i nærheden af ​​PARP-1s bindingssteder . Ophobning af poly (ADP-ribose) fører til rekruttering af DNA reparation proteiner. På SSB’er er den vigtigste rolle PARP-1 at rekruttere røntgen reparation cross-komplementerende protein 1 (XRCC1), mens strandede replikationsgafler sin aktivitet indebærer rekruttering af checkpoint kinase 1 (CHK1) [3-5]. PARP-2 aktiveres også ved DNA beskadigelse og har en rolle i at undertrykke spontan dannelse af DNA toksiske læsioner, men dens relative forekomst og katalytiske aktiviteter er lavere end PARP-1 [3]. Mens PARP-1 – /- eller PARP-2 – /- mus er levedygtige og sunde, den dobbelt knockout mus dør in utero, hvilket antyder, at nogle af de roller, som hver af disse PARP’er spillet er væsentlige og overflødige [1,3] . Farmakologisk inhibering af PARP-1-aktivitet eller dets deletion inhiberer reparation af SSB, der i mangel af funktionelle HRR kan føre til dannelse af unrepaired dobbelt strengbrud (DSBs) under replikation, at replikationsgaffel sammenbrud og celledød [1,3,4 ]. Det er derfor klart, hvorfor PAPRis ​​target celler med muteret BRCA eller som på anden måde svækket i deres evne til HRR. Desværre, foruden deres begrænsede målpopulation, udvikling af resistens over for PARPis er et stort problem. Sekundære BRCA mutationer, som genopretter BRCA åbne læseramme (ORF) og funktionel C terminal samt øget ekspression af multiresistens (MDR) en eller nedsat ekspression af PARP-1 alle føre til tab af følsomhed over for PARP-1 hæmmere [1 , 3]. Også, nedsat ekspression af 53BP1 er blevet påvist at ophæve følsomhed BRCA1 muterede celler til PARPis [6]. Det er derfor vigtigt at finde måder at overvinde modstand mod PARPis uanset om det bliver erhvervet eller medfødt.

Relevant for dette begreb er resultaterne, der HDAC-hæmmere nedsætter niveauet af HRR proteiner, og ved 5 uM, vorinostat (den første HDACi at være FDA godkendt til behandling af kræft) drastisk reducerer niveauet af disse proteiner i kræftceller, men ikke i normale celler [7,8]. Derfor forventes vorinostat at sensibilisere cancerceller for behandling med PARPis, uanset deres medfødte evne til DNA-reparation. Også aktiviteten af ​​NF-kB og CHK1 som er forbundet med resistens over for vorinostat [7] er afhængig af PARP-1-aktivitet [5,9]. Derfor er vorinostat og PARPis forventes gensidigt at højne antineoplastisk effekt af hinanden. Faktisk mens arbejdet var i gang flere laboratorier rapporteret, at HDAC-hæmmere sensibiliserede dyrkede kræftceller til PARPis [10-14].

Ud over PARPis, anti-metabolit 6-thioguanin (6-TG) også mål celler med BRCA mutation eller med andre mangler i deres kapacitet til HRR [15]. 6-TG for tiden anvendes i behandling af akut lymfoblastisk leukæmi. I celler 6-TG metaboliseres til 6-TG nukleotid, der er inkorporeret i DNA under replikation. Efter sin inkorporering i DNA 6-TG nukleotid undergår S-methylering, aktiverende mismatch repair (MMR) og udløser dannelse af DSBs der kræver HR til reparation [16]. Desuden 6-TG-afhængig akkumulering af reaktive oxygenforbindelser fører til oxidation af det inkorporerede 6-TG og MMR-uafhængig dannelse af inter-streng-tværbindinger (ICL) [17], som kræver den kombinerede virkning af Fanconi anæmi ( FA) og HRR veje for reparation [17,18]. Interessant celler, der blev resistente over PARPis grundet sekundær BRCA2 mutation var stadig følsomme over for 6-TG [15]. Tilsyneladende, at sekundære mutationer ikke gjorde det muligt BRCA proteiner reparere MFR uafhængige læsioner efter dannelse af ICL [15,18]. Da det viste sig, BRCA1 har en unik rolle i FA-afhængige reparation af ICL, som ikke kan opfyldes af BRCA1 med en sekundær mutation, der ophævede følsomhed over for PARPis [18]. Evne vorinostat at dramatisk reducere niveauet af DNA reparation proteiner herunder at BRCA1 vil sandsynligvis øge virkningen af ​​6-TG ved at reducere både FA-afhængige og HR reparation. Også, hverken vorinostat eller 6-TG er flere lægemiddelresistente (MDR) 1 substrater [7,15], og derfor deres samlede indsats bør ikke blive påvirket af en mulig stigning i niveauet af MDR1. Endelig forventes også vorinostat-inducerede stigning i phosphorylering af eIF2α at bidrage til hæmning af HRR [19] og dermed føre til øget cellulær respons på både PARPis og 6-TG.

Forsøgene præsenteret her viser, at celler, som reagere dårligt på PARP-1 hæmmer-ABT 888 -become følsom over for den i nærværelse af vorinostat. Tilsvarende vorinostat forbedret respons cancerceller til 6-TG. Under vores eksperimentelle betingelser den kombinerede behandling af vorinostat og ABT-888 viste kun en moderat effekt på niveauet af BRCA1 og ingen på RAD51, men førte til øget fosforylering af eIF2α. Forsøg med den farmakologiske inhibitor af eIF2α dephosphoryleringen-salubrinal-såvel som med phosphomimetic S51D og ikke-phosphorylatable S51A varianter af eIF2α viste, at øget fosforylering af eIF2α-i og for sig selv-sensibiliserer cancerceller til ABT-888.

Endelig de kombinerede behandlinger af vorinostat og ABT-888 eller vorinostat og 6-TG steget markant hæmning af xenotransplantattumorer vækst i forhold til hvert lægemiddel alene uden at påvirke nyre eller lever funktioner eller forårsage nogen signifikant vægttab.

Materialer og metoder

Cell kultur

human MDA-MB-231, BT-549 og MCF-7 og human glioblastom U-87 cancer cellelinjer samt primære humane bryst celler var fra American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). Dermal humane fibroblaster blev opnået ved skriftlig tilladelse fra to donorer (godkendt af Institutional Review Board på Sheba Medical Center, protokol # 7044). MDA-MB-231, MCF-7, BT-549 og U-87 blev bekræftet ved kort tandemgentagelse profilering.

vækstbetingelser

MCF-7-celler blev dyrket i lav glucose Dulbecco modificeret eagle medium (DMEM), blev U87-celler dyrket i højglucose DMEM, MDA-MB-231 og BT-549-celler i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640. cellelinie medier blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), penicillin og streptomycin fra Biological Industries Kibbutz Beit-Haemek, Il. Vækstmedium af BT-549 blev også suppleret med 0,023 IU /ml af human rekombinant insulin (Sigma, St. Louis, MO.). Fibroblaster blev dyrket i højglucose DMEM suppleret med 20% FBS, penicillin-streptomycin, 1% ikke-essentielle aminosyrer og 0,2% β-mercaptoethanol (Invitrogen, Life Technologies Grand Island, NY). Primære normale humane brystceller blev dyrket i mamma-epitelcelle basalt medium indeholdende rekombinant human insulin, og TGFa, L-glutamin, epinephrin, apo-transferrin, hypofyse ekstrakt og hydrocortison hemisuccinat alle fra ATCC. Til Western blot-analyse af cellulære proteiner blev celler udpladet med en tæthed på 4 · 10

3 per cm

2 og lægemidler blev tilsat 48 timer efter plating fra stamopløsninger i dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma, St. Louis MO). Kontroller modtog køretøjet. Koncentrationen af ​​DMSO i vækstmediet ikke overstige 0,08%.

Narkotika

Salubrinal var fra Calbiochem-Merck4Biosciences (Darmstadt, Tyskland), vorinostat fra LC laboratorier (Boston, MA), ABT -888 fra SelleckChem eller APExBIO (Houston, TX), 6-TG fra Tocris Bioscience (Bristol, UK) eller Sigma, (St. Louis, MO.), blev Z-VAD-FMK købt fra APExBIO og senescens β-galactosidase-farvning kit blev indkøbt fra cellesignalering Technologies (Boston, MA).

Colony overlevelse assay

Plating for kolonioverlevelse assay kolonitælling, og beregning af procent klonogene død (CD) blev udført i triplikater som beskrevet før [19-21]. Kolonier blev fikseret, farvet og talt 10-14 dage efter udpladning, når 90-95% af kolonierne i kontrolgruppen havde mere end 50 celler. Eksperimentelle kombination indeks (CI) og simulerede dem på ED50, blev ED75, ED90 og ED95 opnås ved anvendelse af computerprogrammet CompuSyn ifølge Chou [21]. CI 0,9 indikerer synergistisk interaktion. Primære bryst celler ikke danne kolonier. Cellerne blev derfor udpladet ved en densitet på 300 celler /cm

2 og de forskellige lægemidler blev tilsat en dag senere i yderligere fem dage. Celledød blev bestemt ved trypan blå-udelukkelse assay udført tredobbelt og udtrykt som procent celledød (CD). De koncentrationer af lægemidler, der anvendes i vores koloni overlevelse assay var på rækken af ​​plasma Cmax opnået i prækliniske undersøgelser med laboratoriedyr [22,23] og i kliniske studier med human [24].

Western blot-analyse

Fremstilling af cellelysater og analyse af behandlingsrelaterede inducerede ændringer i proteinniveau og phosphorylering blev udført som vi tidligere beskrevet [19]. Proteinindhold blev bestemt med et bicinchoninsyre reagens (Bio-Rad, Hercules, CA), og lige belastning blev verificeret ved måling af absorbansen ved 520 nm af Ponceau S (Sigma, St-Louis, MO) ekstraheret med phosphatbuffer (2,67 mM KCI, 1,47 mM KH

2PO

4, 8,1 mM Na

2HPO

4 og 1,125 M NaCl) fra individuelle strimler af en dobbelt run [19,20]. Blots blev eksponeret for røntgenfilm til kemiluminescens efter behandling med West Pico ECL reagens (Thermo Scientific Rockford, IL). Værdier for integreret lys tæthed af autoradiogrammer blev opnået med Image J NIH software og blev anvendt til bestemmelse af behandlingsrelaterede inducerede ændringer i proteinniveauer og i forholdet af phosphoryleret eIF2α (p-eIF2α) til det samlede niveau af proteinet. Kanin antistoffer, der genkender enten p-eIF2α (# 9721) eller begge (# 9722) det phosphorylerede og ikke-phosphoryleret eIF2α, kanin-anti-RAD51 (# D4B10), kanin-anti-53BP1 (# 4937), kanin-anti-PARP (# 46D11) og kanin monoklonale antistoffer mod c-IAP1, c-IAP2, survivin og XIAP (# 9770) var fra cellesignalering Technologies (Boston, MA). Muse monoklonale antistoffer mod BRCA1 (klon D9 # sc-6954) og mod thioredoxin interagerende protein (TXNIP) # sc-166.234 var fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Dallas, TX). Mus monoklonale antistoffer mod Poly (ADP) ribose (PADPR) (10H # ab14459) var fra abcamBiochemicals

® (Cambridge, UK).

Ældning-associeret β-galactosidase farvning

ældning β-galactosidase farvning kit var fra cellesignalering Technologies og farvning blev udført i overensstemmelse med producentens anvisninger.

Transfektion af celler med plasmider, der koder for eIF2α varianter

heIF2α S51A og heIF2α S51D i pcDNA3.CD2 blev opnået fra Addgene (Cambridge, MA). Transient transfektion blev udført med JetPei (POLYPLUS, New York, NY) ifølge producentens instruktioner, som vi tidligere beskrevet [19]. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer på 6 brønds skåle, med 1,5 ug plasmid i 2 ml vækstmedium uden antibiotika i 24 timer før tilsætning af 0,5 ml medium og fortsætter med forsøgsprotokollen.

Tumorvækst i nøgne mus

Alle dyreforsøg blev udført i henhold til forsøgsprotokol # 609/10 /ANIM som blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Sheba Medical center. Celler blev suspenderet i en blanding af matrigel (reduceret vækstfaktor) (BD Biosciences, Bedford, MA) og RPMI (1: 1). Cellerne (1,5 * 10

6 i 200 pi) blev injiceret i lyske- brystfedtpuden af ​​athymiske

nu

– /

nu

– hunmus ( Harlan, Israel), der vejede ~ 20 gr. Dyrene blev vejet 1-2 gange ugentligt og tumorstørrelse blev målt 2-3 gange ugentligt med en digital skydelære. Tumor volumen blev estimeret ved hjælp af formlen

V

= (

en

×

b

2) × 0,5, hvor

‘en

‘ er den større dimension og

“b

‘den vinkelrette diameter. Eksperimenter inkluderet 7 mus pr forsøgsgruppe ved test den kombinerede effekt af vorinostat og 6-TG på tumorvækst og 10 mus per gruppe ved test den kombinerede effekt af vorinostat og ABT-888. Køretøjet var sammensat af 40% PEG og 20% ​​DMSO i 0,72% NaCl. Lægemidler blev administreret dagligt gennem intraperitoneal injektion (i.p.) gennem hele forsøget starter en eller to dage før celleinokulering og kontroller modtog køretøjet. Injektionsvolumenet var 250 pi. På grund af utilsigtet skade forårsaget af injektioner, et par mus udviklede inden for 24 timer efter injektion, meget stort hæmatom på den injicerede side, der var forbundet med tegn på lidelse (foroverbøjet kropsholdning og vanskeligheder i bevægelser). Disse mus blev aflivet af CO

2 kvælning. Deres antal i forsøget, der testede effekten af ​​kombineret vorinostat og ABT-888-behandling var som følger: C- (3 ud af 11), V- (2 af 10), ABT-888 – (ingen), V og ABT -888 (2 ud af 11). Antallet af mus, der døde på samme måde under forsøget, der testede effekten af ​​kombineret vorinostat og 6-TG behandling var som følger: C- (ingen) V- (1 ud af 7) 6-TG- (1 ud af 7) V og 6-TG- (1 ud af 7). Eksperimenter blev afsluttet omkring fire uger efter initiering når tumorer begyndte at vise tegn på nekrose. Mus blev aflivet af CO

2 kvælning og blodprøver blev taget ved hjertepunktur. Komplet blodtælling sammen med lever og nyre funktioner blev udført af A.M.L Veterinary Division, Herzlia, Il. Prøver fra indre organer blev fikseret i 4% buffered formalin og bearbejdet for hematoxylin og eosin (H 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Forsøg med nøgne mus:. ANOVA med gentagne målinger blev anvendt til at teste for betydningen af ​​de observerede forskelle i tumor volumen blandt de forskellige forsøgsgrupper. Analysen omfattede mus, der overlevede hele eksperimenterne. Tid inden emne faktor og V og ABT eller V og 6-TG mellem underlagt faktorer blev anvendt. For at nærme normalfordeling blev dataene analyseret efter kvadratroden transformation. ANOVA med gentagne målinger blev også anvendt til at påvise den manglende behandlingsrelaterede inducerede ændringer i mus vægt.

s

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Vorinostat sensibiliserer cancerceller in vitro til behandling med ABT 888

Det er blevet rapporteret, at vorinostat reducerer niveauet af DNA-reparation proteiner i cancer, men ikke i normale celler [8]. Vi også observeret, at vorinostat førte til en dosisafhængig reduktion af BRCA1 og RAD51 niveau i MDA-MB-231 celler (S1 Fig). Disse resultater fik os til at teste virkningen af ​​vorinostat af følsomheden af ​​cancerceller til PARPi-ABT-888.

Det er blevet rapporteret, at 5 um ABT-888 fører til ~ 90% reduktion i klonogene overlevelse af MDA-MB-436 BRCA1 muteret brystcancercellelinie [25]. I modsætning hertil MDA-MB-231, som besidder vildtype BRCA1 [26] responderet dårligt på behandling med 7-10 uM ABT-888 (figur 1). Stadig, inhibitoren var aktiv i cellerne som påvist ved dets evne til at ophæve H

2O

2-induceret dannelse af poly (ADP) -ribose (Fig 1b). Den tredobbelte negative BT-549 brystcancercellelinje og glioblastoma U-87 blev ligeledes modstandsdygtig over for ABT-888, medens østrogen afhængige MCF-7-brystcancercellelinier var relativt følsomme over for lægemidlet. Ikke desto mindre, som bemærket i fig 1a, vorinostat-forstærket respons af alle disse cellelinjer til ABT-888 og alle eksperimentelle og simulerede CI viste, at interaktionen mellem vorinostat og ABT-888 er synergistisk (Fig 1a og S1 tabel). Under vores eksperimentelle betingelser, blev normale humane fibroblaster og bryst celler næppe påvirket af nogen af ​​disse agenter eller deres kombination.

a. Klonogen død i respons på kombineret behandling af vorinostat og ABT-888: Cancer cellelinjer og fibroblaster blev belagt for klonogene overlevelse analyser og behandlet med vorinostat, ABT-888 eller begge dele. Værdier er middel klonogene død (CD) (%) af triplikater ± SEM. Bestemmelse af procent celledød (CD) for normale bryst celler blev udført ved trypanblå eksklusion assay. Forsøget blev gentaget en gang med lignende resultater. Forskelle mellem CD af kombineret behandling og hver af de eneste behandlinger eller kontrollerne var signifikante. *

s

0,05, ** p 0,01. Kombination indeks (CI) var 0.9. b. ABT-888 er aktiv i cellerne: MDA-MB-231 celler blev inkuberet natten over med 10 pM ABT-888 end 15 min med 1 mM H2O2 før høstning og forarbejdning til detektion af poly (ADP-ribose) (PADPR) ved western-blot .

Molekylære mekanismer, der ligger til grund for sensibiliserende effekt af vorinostat

Brug de eksperimentelle betingelser er afbildet i figur 1a vi bestemt niveauet af DNA-reparation protein i celler behandlet med vorinostat, ABT-888 og deres kombination. I modsætning til vores forventninger, fandt vi, at kombinationen af ​​vorinostat og ABT-888 havde kun en moderat effekt på niveauet af BRCA1, reducerer det ved ikke mere end ~ 40%, mens niveauet af RAD51 var upåvirket. Interessant nok blev niveauet for 53-BP1 steget med vorinostat og ved ABT-888, og deres kombination øget niveauet for 53BP1 mere end hvert lægemiddel alene (figur 2a-2c). Det fremgår, at øget niveau af 53BP1 i ansigtet af nedsat niveau af BRCA1 for cellulær følsomhed over for PARPis betragtes i diskussionen (figur 2).

Kombineret behandling af vorinostat og ABT-888 reducerede niveauet af BRCA1 med ~ 30% (a), ikke påvirke niveauet for RAD51 (b), øget niveau af 53BP1 forhold til at styre ABT-888 eller vorinostat behandlede celler (c), og faldt niveauet af TXNIP (d). ABT-888 (10 uM), vorinostat (0,5 uM) og deres kombination sattes til cellerne 48 timer efter plating. Cellerne blev høstet 48 timer senere og behandlet til western blot analyse af ændringer i niveauerne af BRCA1, RAD51 og TXNIP. Tal i bunden af ​​autoradiogrammer angiver ændringer i forhold til kontrol i niveauet af BRCA1, RAD51, TXNIP og indlæst proteiner (Ponceau). Forsøget blev gentaget en gang med lignende resultater. Uforkortede billeder af autoradiogrammer præsenteret i paneler (a) og (b) er vist i S2 Fig.

I mangel af en dramatisk effekt af den kombinerede behandling på niveauet af BRCA1 eller RAD51 vi bestemt effekten af ​​vorinostat, ABT-888 og deres kombination på niveauet af cellulære thioredoxin interagerende protein (TXNIP). Det er blevet rapporteret før, at øget ekspression af TXNIP ligger til grund for differentierede virkning af vorinostat på cancerceller [27]. Vi demonstrerede også, at høje koncentrationer af vorinostat førte til en dosisafhængig stigning af TXNIP i MDA-MB-231 celler (S1 Fig). Men under vores eksperimentelle betingelser kombinationen af ​​vorinostat og ABT-888, som forbedret celledød gentagne gange ført til et fald i stedet for en stigning i niveauet af TXNIP i MDA-MB-231-celler (figur 2d).

Foruden TXNIP, øget phosphorylering af eIF2α har også vist sig ved flere laboratorier, herunder vores, at mediere den cytotoksiske virkning af vorinostat på cancerceller [19,28]. Vi har derfor undersøgt niveauet af eIF2α phosphorylering i celler behandlet med både vorinostat og ABT-888 og fandt, at vorinostat ved koncentrationer, der forbedrede følsomhed over for ABT-888, førte til en markant stigning i eIF2α fosforylering, mens ABT-888 alene medførte kun en svag stigning i phosphorylering af proteinet. I celler behandlet med begge midler var svarede til den opnåede med vorinostat alene niveauet af phosphoryleret eIF2α. I modsætning hertil den kombinerede virkning af vorinostat og ABT-888 undlod at øge niveauet af phosphoryleret eIF2α i humane fibroblaster eller i humane normale bryst celler (figur 3a).

a. Vorinostat steg eIF2α phosphorylering i ABT-888 behandlede MDA-MB-231-celler, men ikke i ABT-888 behandlede fibroblaster og normale bryst celler: ABT-888 (10 uM), vorinostat (0,5 uM) og deres kombination sattes til cellerne 48 timer efter plating. Cellerne blev høstet 48 timer senere og behandlet til Western blot-analyse af ændringer i forholdet mellem p-eIF2α /eIF2α. Tal i bunden af ​​autoradiogrammer angiver ændringer i forhold til kontrol af p-eIF2α /eIF2α og indlæst proteiner (Ponceau). Forsøget blev gentaget en gang med lignende resultater. b. Salubrinal øger CD af MDA-MB-231-celler som respons på ABT-888: Celler blev behandlet med salubrinal, ABT-888 eller begge. Værdier er middel CD (%) af triplikater ± SEM. Forsøget blev gentaget en gang med lignende resultater. Forskelle mellem CD (%) af kombineret behandling og hver af de eksperimentelle behandlinger eller kontroller var signifikant. **

s

0,01, *

s

0,05. CI var 0.9. c. En phosphomimetic eIF2α variante stigninger klonogene død som reaktion på ABT-888: The PARPi (10 uM) blev tilsat til cellerne 18 timer efter transfektion med 1.5μg /2ml eIF2α S51A eller eIF2α S51D. Kolonier blev behandlet til analyse 10 dage efter behandlingsstart. Værdier er middel CD (%) af tredobbelte prøver ± SEM. Eksperimentet blev gentaget to gange med lignende resultater. Forskelle mellem hver af de kontroller og deres ABT-888 behandlede modstykker samt mellem ABT-888 behandlede S51A og S51D varianter var betydelig. SA-ikke-phosphorylatable S51A eIF2α, SD-phosphomimetic S51D eIF2α. d. Salubrinal øger eIF2α phosphorylering og 53BP1 ekspression i ABT-888 behandlede celler uden at påvirke niveauet af BRCA1 eller RAD51: ABT-888 (10 uM) og salubrinal (4,5 uM) blev tilsat til cellerne 48 timer efter plating. Cellerne blev høstet 48 timer senere og behandlet til Western blot-analyse af ændringer i BRCA1, RAD51, 53BP1 og forholdet p-eIF2α /eIF2α. Tal i bunden af ​​autoradiogrammer er ændringer i forhold til kontrol af niveauet af BRCA1, RAD51, 53P1, forholdet p-eIF2α /eIF2α og mængderne af indlæste proteiner (Ponceau). Forsøget blev gentaget en gang med lignende resultater. e. Niveauet af phosphoryleret eIF2α er højere og niveauet af samlede eIF2α er lavere i normale fibroblaster og brystceller end i cancerceller: Celler blev høstet til Western blot-analyse fire dage efter udpladning. Forsøget blev gentaget en gang med lignende resultater. Tal i bunden af ​​autoradiogrammer angiver ændringer i forhold til styring af peIF2α /eIF2α og mængden af ​​lastede proteiner (Ponceau). Forsøget blev gentaget en gang med lignende resultater. Uforkortede billeder af MDA autoradiogram i panel (a) i RAD51 og 53BP1 i panelet (d) og de autoradiogrammer i panelet (e) er præsenteret i S3 Fig.

For at afgøre, om øget fosforylering af eIF2α i ABT-888 behandlede cancerceller bidrager til den sensibiliserende effekt af vorinostat, vi evaluerede effekten af ​​salubrinal-en inhibitor af eIF2α dephosphoryleringen-af følsomheden af ​​cellerne til ABT-888. Som bemærket i fig 3b og i S2 tabel, salubrinal forbedret følsomhed af cellerne til ABT-888, og lignende resultater blev opnået med den phosphomimetic eIF2α variant S51D (figur 3c). Efter aftale med dets virkning på følsomheden af ​​kræftcellerne til ABT-888, salubrinal efterlignede effekten af ​​vorinostat på øget fosforylering af eIF2α i ABT-888 behandlede celler og lignende til kombinationen af ​​vorinostat og ABT-888, kombinationen af ​​salubrinal og ABT-888 ikke reducere niveauet af RAD51. Men i modsætning til virkningen af ​​vorinostat blev sensibiliserende effekt af salubrinal opnås uden overhovedet at påvirke niveauet af BRCA1 (figur 3d). Interessant virkningen af ​​salubrinal alene på niveauet af 53BP1 var højere end det observerede med vorinostat eller ABT-888 alene og i celler behandlet med både salubrinal og ABT-888 niveauet af 53BP1 var højere end den observeret i ABT-888 behandlede celler og lignende til den, der bemærkes i celler behandlet med salubrinal alene (figur 3d).

af note, i ubehandlede fibroblaster eller normale bryst celler, niveauet af samlede eIF2α var meget lavere og niveauet af den phosphorylerede protein var meget højere end i den ubehandlede human brystcancer cellelinje MDA-MB-231 (fig 3e), hvilket tyder på, at normale celler kan være mere tolerante end cancerceller til forøget phosphorylering af eIF2α.

Under vores forsøgsbetingelser, den sensibiliserende effekt af vorinostat på det cellulære respons på ABT-888 blev ikke påvirket af tilstedeværelsen af ​​den pan-caspaseinhibitoren-z-vad-fmk (S4 fig). En caspase-uafhængig effekt af vorinostat på celle overlevelse er påvist før af Xu et al. [29]. Mærkeligt, z-vad-fmk alene førte til en dosisafhængig formindskelse i celleoverlevelse-et fænomen, der er blevet observeret før i forskellige cellulære systemer [30-32].

Relativt høje koncentrationer af vorinostat (5 -10 folder højere end dem, der anvendes i vores undersøgelser) har vist sig at dramatisk reducere niveauet af inhibitoren af ​​apoptose protein (IAP) -familien, såsom c-IAP1, c-IAP2, XIAP og survivin [29]. Vi undersøgte derfor effekten af ​​vorinostat og af den kombinerede behandling af vorinostat og ABT-888 på niveauet af disse proteiner (S5 Fig). Under vores eksperimentelle betingelser, har vorinostat ikke påvirke niveauet for c-IAP1, survivin og XIAP. Også, ABT-888 ikke påvirke niveauet for disse proteiner. Niveauet af c-IAP2 blev reduceret med vorinostat behandling, men blev forøget med ABT-888. Ikke desto mindre, under vores eksperimentelle betingelser, den kombinerede behandling ikke at påvirke niveauet for disse IAP.

Den kombinerede behandling af vorinostat og ABT-888 blev dog forbundet med en øget forekomst af forstørrede flade ældede udseende celler, som farves for β-galactosidaseaktivitet (S6 fig). Også her har en lignende effekt af vorinostat blevet rapporteret før af Xu et al. [33].

Interessant, svarende til behandling med vorinostat og ABT-888, behandling med salubrinal og ABT-888 førte til en øget forekomst af ældede udseende celler, som farvet for β-galactosidase (S6 Fig). Også, ligesom vorinostat, salubrinal ikke påvirke niveauet for c-IAP1, survivin og XIAP men førte til en nedsat niveau af c-IAP2, og ligesom vorinostat og ABT-888, kombineret behandling af salubrinal og ABT-888 påvirkede ikke niveau af disse IAP (S5 fig).

Øget inhibering af tumor xenograft vækst i mus behandlet med både vorinostat og ABT-888

virkningen af ​​vorinostat af følsomheden af ​​MDA-MB-231 ABT-888 blev gengivet in vivo. Kombineret behandling af vorinostat og ABT-888 førte til en signifikant hæmning af tumorvækst i forhold til hver behandling alene (figur 4a). De forskellige behandlinger førte ikke til en signifikant effekt på kropsvægt (figur 4b) og synes ikke at påvirke komplet blodtælling, lever eller nyre funktioner (S3 og S4 Tables). H & E-farvning af snit fra indre organ ikke udviste behandlingsrelaterede inducerede ændringer i hjerte, lever, nyre og lunger. b. c. b. b. c. b.