PLoS ONE: Selaginella tamariscina Dæmper Metastase via Akt Pathways i Oral Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

Rå ekstrakter af

Selaginella

tamariscina

, en orientalsk lægeurt, er blevet dokumenteret til behandling af flere humane sygdomme. Dette studie undersøgte de mekanismer, som

Selaginella

tamariscina

hæmmer invasiv menneskelige oral pladecellekræft (OSCC) HSC-3 celler.

Metode /vigtigste resultater

Heri vi vise, at

Selaginella

tamariscina

svækket HSC-3 celle migration og invasion i en dosisafhængig måde. De anti-metastatiske aktiviteter

Selaginella

tamariscina

forekom i det mindste delvist på grund af nedregulering af matrixmetalloproteinaser (MMP) -2 og MMP-9 gelatinaseaktivitet og nedregulering af proteinekspression. Ekspression og funktion af både MMP-2 og MMP-9 blev reguleret af

Selaginella

tamariscina dele på transskriptionsniveau, som vist ved kvantitativ realtids-PCR og reporter assays. Kromatin immunofældning (chip) data anførte endvidere, at binding af cAMP respons element-bindende (CREB) protein og aktiverende protein-1 (AP-1) til MMP-2 promoter formindsket på det højeste dosisniveau på

Selaginella

tamariscina

. DNA-bindende aktivitet af specificitet protein 1 (SP-1) til MMP-9-promotoren blev også undertrykt ved den samme koncentration.

Selaginella

tamariscina

påvirkede ikke mitogenaktiveret proteinkinase signalvejen, men hæmmer effekten af ​​gelatinase ved at reducere aktiveringen af ​​serin-threonin kinase Akt.

konklusioner

Disse resultater viser, at

Selaginella

tamariscina

kan være en potent adjuvans, terapeutisk middel i forebyggelsen af ​​oral cancer

Henvisning:. Yang JS, Lin CW, Hsin CH, Hsieh MJ, Chang YC (2013)

Selaginella

tamariscina

Dæmper Metastase via Akt Pathways i Oral Cancer Cells. PLoS ONE 8 (6): e68035. doi: 10,1371 /journal.pone.0068035

Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, Taiwan

Modtaget: April 12, 2013; Accepteret: 23. maj 2013; Udgivet 14. juni, 2013 |

Copyright: © 2013 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev understøttet af en forskningsbevilling fra National Science Rådet, Taiwan (NSC100-2632-B-040-001-MY3). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

hoved og hals pladecellekræft udgør ca. 3% af alle kræfttilfælde i USA, og oral pladecellekræft (OSCC) er den mest almindelige form for hoved og halscancer [1]. Den høje metastase til cervikale lymfeknuder forårsager ringe overlevelse af kræft oral [2]. Kræftceller typisk spredes ved at secernere forskellige molekyler, som nedbryder den ekstracellulære matrix (ECM), invaderer blodkarrene, og migrerer til fjerntliggende organer [3]. Matrixmetalloproteinaser (MMP’er) er en vigtig gruppe enzymer, der regulerer ECM sammensætning under normal udvikling og patologiske responser [4]. Selv om forskellige MMP’er bidrager til cancercelle metastase, har gelatinaserne MMP-2 og MMP-9 er mest intensivt undersøgt [5]. MMP-2, også kendt som gelatinase A, er en 72-kDa protein udtrykt i de fleste væv og celler [6]. I modsætning hertil MMP-9 (gelatinase B), en 92-kDa protein, betinget observeret i leukocytter [7]. Forhøjet MMP-2 og MMP-9-ekspression er blevet observeret i invasive og metastatiske tilfælde af human oral cancer [8-10]. Derfor er der blevet gjort koncentreret indsats for at udvikle MMP hæmmere (MMPIs) at standse spredningen af ​​kræftceller [11].

Selaginella

tamariscina

er en urt traditionelt anvendes i orientalsk medicin, som udviser flere terapeutiske evner. Først, fordi

Selaginialla tamariscina

har vist sig at reducere blodsukker og serum lipid peroxid niveauer, det udviser potentielle anvendelser i behandlingen af ​​diabetes [12,13]. For det andet, bioflavonoider isoleret fra

Selaginella

tamariscina

demonstreret antibakterielle og svampedræbende effekt [14-16]. For det tredje, rå ekstrakter fra

Selaginella

tamariscina

har hæmmet menneske mesangial celledeling, og har nedsat interleukin-1 beta og tumornekrosefaktor-alfa produktion [17]. For det fjerde,

Selaginella

tamariscina

kunne være en potentiel kemoforebyggende middel mod forskellige menneskelige kræftceller, såsom gastrisk kræft [18], lungecancer [19], brystkræft [20], og livmoderhalskræft [21]. Formålet med denne undersøgelse var at belyse effekten af ​​

Selaginella

tamariscina

på humane OSCC HSC-3 celler. Vores resultater viste, at

Selaginella

tamariscina

standset oral cancer cellemigrering gennem nedregulering af MMP-2 og MMP-9-ekspression og ved at reducere DNA-bindingsaktivitet til promotorelementer. Desuden blev de anti-metastatiske virkninger forbundet med inaktivering af serin-threonin kinase Akt.

Materialer og metoder

Uddrag fra

Selaginella

tamariscina

Selaginella

tamariscina

blev købt fra urter butikker og tørrede hele planter (100 g) blev ekstraheret to gange med 500 ml 50% ethanol i destilleret vand. De samlede ekstrakter blev filtreret og koncentreret ved 70 ° C under anvendelse af en rotationsfordamper under lavt tryk. Den koncentrerede rå ekstrakt blev frosset ved -80 ° C i 2-3 dage og derefter det var frysetørret i en frysetørrer og opbevaret ved -20 ° C. Ekstraktionen udbytte var 2,8% (vægt /vægt) og den kemiske profil Selaginella tamariscina ekstrakt (STE) blev analyseret ved hjælp af højtryks-væske kromatogrammer (HPLC) -masse spektrometer [19]. Kort fortalt

Selaginella

tamariscina

blev analyseret ved HPLC-massespektrometer ved hjælp af en HPLC (Hitachi L-6200 med en L-4500 diodearraydetektor) med en PE Sciex Qstar Pulsar ESI-TOF masse spektrometer. Prøver (10 pi) blev injiceret på en Merck LiChrospher 100 RP-18-søjle (4 x 250 mm). Søjlen blev ækvilibreret i 0,05% eddikesyre /vand (opløsning A) og eluering af komponenterne blev opnået ved at forøge koncentrationen af ​​opløsning B (100% acetonitril) fra 0 til 100% i 30 minutter ved en strømningshastighed på 1 ml /min. Absorbans blev overvåget ved 254 nm. De molekylære masser af toppene blev bestemt ud fra elektrospray ioniserings massespektre under anvendelse multipelt ladede ion profil [19]. Ekstrakten blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma Co., USA) og blev fremstillet ved forskellige koncentrationer for de efterfølgende eksperimenter.

Cellekultur og

Selaginella

tamariscina

ekstrakt (STE) behandling

HSC-3, et humant tunge pladecellecarcinom cellelinje opnået fra ATCC (Manassas, VA, USA), blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (Life Technologies, Grand Island, NY , USA), 10% føtalt bovint serum (Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA), 2 mM glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Alle cellekulturer blev holdt ved 37

oC i en fugtig atmosfære af 5% CO

2. For STE behandling blev passende mængder af stamopløsning af STE tilsat til dyrkningsmediet for at opnå de angivne koncentrationer og derefter inkuberet med celler for angivne tidsperioder, hvorimod dimethylsulfoxid opløsning uden STE blev anvendt som blank reagens.

Bestemmelse af cellelevedygtighed (MTT-assay)

i cellelevedygtighed eksperiment blev en mikrokultur tetrazolium (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid) kolorimetrisk assay blev udført for at bestemme cytotoksicitet STE. HSC-3-celler blev podet i 24-brønds plader ved en densitet på 5 x 10

4 celler /brønd og behandlet med STE ved en koncentration mellem 0-100 ug /ml ved 37

oC i 24 timer. After eksponeringsperioden blev mediet fjernet, og cellerne blev vasket med phosphatbufret saltvand (PBS) og derefter inkuberet med 20 pi MTT (5 mg /ml) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) i 4 h. Antallet af levedygtige celler pr skål er direkte proportional med produktionen af ​​formazan, som kan måles spektrofotometrisk ved 563 nm efter solubilisering med isopropanol. Salg

In vitro sårlukning Salg

HSC-3 celler (1 × 10

5 celler /brønd) blev udpladet i 6-brønds plader i 24 timer, sårede ved at skrabe med en pipettespids, derefter inkuberet med DMEM-medium indeholdende 0,5% FBS og behandlet med eller uden STE (0, 25, 50 , 75 og 100 ug /ml) i 0, 12 og 24 timer. Celler blev fotograferet under anvendelse af et fasekontrastmikroskop (x 100).

cellemigrering og invasion assays

Cell migration og invasion blev analyseret ifølge fremgangsmåderne beskrevet af Yang et al. [19]. Efter en behandling med STE (0, 25, 50, 70 og 100 ug /ml) i 24 timer blev overlevende celler høstet og podet til Boyden kammer (Neuro Probe, Cabin John, MD, USA) ved 10

4-celler /brønd i serumfrit medium og derefter inkuberet i 24 timer ved 37

oC. For invasion assay, 10 pi Matrigel (25 mg /50 ml, BD Biosciences, MA, USA) blev anvendt på 8 um pore size polycarbonat membranfiltre og bundkammeret indeholdt standardmedium. Filtrene blev derefter lufttørret i 5 timer i en laminær strømning. De invaderede celler blev fikseret med 100% methanol og farvet med 5% Giemsa. Celleantal blev talt under et lysmikroskop. Migrationen assay blev udført som beskrevet i invasionen assay med nogen belægning af Matrigel.

Bestemmelse af MMP-2 og MMP-9 ved gelatinezymografi

Aktiviteterne af MMP-2 i betinget medium blev målt ved gelatinezymografi protease-assays. Kort fortalt blev opsamlede medier af passende størrelse (justeret med vital celleantal) fremstillet med SDS-prøvebuffer uden kogning eller reduktion og underkastes 0,1% gelatine-8% SDS-PAGE-elektroforese. Efter elektroforese blev gelerne vasket med 2,5% Triton X-100 og derefter inkuberet i reaktionsbuffer (40 mM Tris-HCI, pH 8,0; 10 mM CaCl

2 og 0,01% NaN3) i 12 timer ved 37

oC . Derefter blev gelen farvet med Coomassie brilliant blue R-250.

Fremstilling af totale cellelysater

I totale cellelysater forberedelse, celler blev skyllet med PBS to gange og skrabet med 0,2 ml kold RIPA puffer indeholdende protease inhibitorer cocktail, og derefter hvirvelbehandlet ved 4

oC i 10 minutter. Cellelysater blev udsat for en centrifugering af 10.000 rpm i 10 minutter ved 4

oC, og det uopløselige pellet blev bortkastet. Koncentrationen af ​​totale cellelysater protein blev bestemt ved Bradford-assay.

Western blot-analyse

20 ug prøver af totale cellelysater eller nukleare fraktioner blev adskilt ved SDS-PAGE på 10% polyacrylamidgeler og overført til en nitrocellulosemembran under anvendelse af Mini-Protean Tetra Elektroforese System som tidligere beskrevet [22]. Blottet blev efterfølgende inkuberet med 5% fedtfri mælk i Tris-bufret saltvand (20 mM Tris, 137 mM NaCl, pH 7,6) i 1 time for at blokere ikke-specifik binding og derefter natten over med polyklonale antistoffer mod MMP-2, MMP -9, TIMP-1, TIMP-2, tre MAPK’er (ERK 1/2, JNK 1/2 og p38), eller Akt med de specifikke antistoffer for ikke-phosphorylerede eller phosphorylerede former af de tilsvarende ERK 1/2, JNK 1/2 , p38 og Akt. Blots blev derefter inkuberet med et peberrodsperoxidase gede-anti-kanin eller anti-mus IgG i 1 time. Bagefter signal blev detekteret ved anvendelse af forøget kemiluminescens (ECL) kommercielt kit (Amersham Biosciences) og den relative fotografiske densitet blev kvantificeret ved at scanne de fotografiske negativer på en gel dokumentation og analysesystem (AlphaImager 2000 Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA, USA ).

RNA-fremstilling og TaqMan kvantitativ real-time PCR

Totalt RNA blev isoleret fra orale cancerceller under anvendelse af Trizol (Life Technologies, Grand Island, NY) ifølge fabrikantens instruktioner. Kvantitativ realtids-PCR-analyse blev udført ved anvendelse af Taqman ettrins-PCR Master Mix (Applied Biosystems). 100 ng af total cDNA blev tilsat pr 25 pi reaktion med MMP-2, MMP-9 eller GAPDH-primere og Taqman prober. Den MMP-2, MMP-9 og GAPDH primere og prober blev designet ved hjælp kommerciel software (ABI PRISM Sequence Detection System, Applied Biosystems). Kvantitative real-time PCR assays blev udført in triplo på en StepOnePlus detektionssekvensen system. Tærsklen blev sat over den ikke-skabelon kontrol baggrund og inden for det lineære fase af target-genamplifikation at beregne cyklus nummer, hvor afskriften blev opdaget.

Transfektion og MMP-2, MMP-9-promotor-drevet luciferaseassays

HSC-3-celler blev podet ved en koncentration på 5 x10

4 celler per brønd i 6-brønds cellekulturplader. Efter 24 timers inkubation, pGL3-basic (vektor), MMP-2 eller MMP-9-promotor-plasmid blev co-transficeret med en β-galactosidase-ekspressionsvektor (pCH110) i celler under anvendelse Turbofect (Fermentas, Carlsbad, CA). Efter 12 timers transfektion blev celler behandlet med vehikel eller STE (0 eller 100 ug /ml) i 24 timer. Cellelysaterne blev høstet, og luciferaseaktivitet blev bestemt ved anvendelse af et luciferase-assay kit. Værdien af ​​luciferaseaktiviteten blev normaliseret til transfektionseffektivitet og overvåges af β-galactosidaseekspression.

chromatin immunoprecipitation analyse (chip)

chromatin immunoprecipitation analyse blev udført som beskrevet tidligere [23,24] . DNA immunfældet med anti-CREB, anti-SP1 eller anti c-fos blev oprenset og ekstraheret ved anvendelse af phenol-chloroform. Immunpræcipiteret DNA blev analyseret ved PCR eller kvantitativ PCR ved anvendelse af specifikke primere som tidligere beskrevet [23].

Statistisk analyse

I alle de målinger, blev anvendt variansanalyse efterfulgt af Scheffe efterfølgende sammenligning at vurdere forskellene mellem kontrol og celler behandlet med forskellige koncentrationer af STE. En forskel ved p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant og forsøgene blev gentaget tre gange.

Resultater

Virkninger af

Selaginella

tamariscina

på HSC-3 cellelevedygtighed og motilitet

HSC-3 cellelevedygtighed i nærværelse af forskellige koncentrationer (0-100 pg /ml) af

Selaginella

tamariscina

i 24 timer er vist i figur 1A . Selv den højeste koncentration, 100 ug /ml, ikke havde en cytotoksisk virkning på HSC-3-celler. Vi brugte 0-100 pg /ml

Selaginella

tamariscina

at gennemføre de følgende forsøg. Figur 1B viser resultaterne af at bruge en ridse-sår assay til at beregne migration evne HSC-3 celler behandlet med forskellige koncentrationer af

Selaginella

tamariscina

. Resultaterne viser, at

Selaginella

tamariscina

signifikant reduceret cellemotilitet både tids- og dosisafhængigt (p 0,001). (Figur 1B og 1C)

(A) HSC-3-celler blev behandlet med STE (0, 25, 50, 75 og 100 ug /ml) i 24 timer før det underkastes en MTT assay for cellelevedygtighed. Værdierne repræsenterede middelværdier ± SD af mindst tre uafhængige forsøg. (B) HSC-3-celler blev såret og derefter behandlet med vehikel (DMSO) eller STE (0, 25, 50, 75 og 100 ug /ml) i 0h, 12h og 24 timer i 10% FBS-holdigt medium. Ved 0, 12 og 24 timer, blev fase-kontrast billeder af sårene på tre forskellige steder taget.

Virkninger af

Selaginella

tamariscina

om migration og invasion af HSC-3 celler

for at undersøge effekten af ​​

Selaginella

tamariscina

på celle migration og invasion, vi brugte en Boyden kammer assay til at detektere celle motilitet. Figur 2A viser, at

Selaginella

tamariscina

signifikant hæmmede migration i en koncentrationsafhængig måde i 24 timer. Tilsvarende Figur 2B viser, at invasivitet af HSC-3-celler også blev reduceret efter inkubation med forskellige koncentrationer (0-100 pg /ml) af

Selaginella

tamariscina

i 24 timer.

(a) migrationen celle og (B) celleinvasion blev målt ved anvendelse af et Boyden kammer i 16 timer og 24 timer med polycarbonatfiltre hhv. migration og invasion evner HSC-3-celler De blev kvantificeret ved at tælle antallet af celler, der invaderede til undersiden af ​​den porøse polycarbonat som beskrevet i

Materialer og metoder

sektion. Værdierne repræsenterede middelværdier ± SD af mindst tre uafhængige forsøg. * P 0,05 sammenlignet med køretøjet gruppen.

Virkninger af

Selaginella

tamariscina

på MMP-2 og MMP-9 protein-ekspression og enzymaktivitet

evne

Selaginella

tamariscina

at undertrykke vandrende og invasive evner HSC-3 celler ved at reducere MMP-2 og MMP-9-ekspression blev vurderet ved hjælp af gelatinezymografi. Figur 3A viser, at enzymaktiviteten af ​​MMP-2 og MMP-9 blev undertrykt af

Selaginella

tamariscina

i en koncentrationsafhængig måde. Den højeste koncentration af

Selaginella

tamariscina

, 100 ug /ml, inhiberede MMP-2 og MMP-9-aktivitet med 57% og 51%, henholdsvis (figur 3B).

Selaginella

tamariscina

også væsentligt reduceret MMP-2 og MMP-9-protein-ekspression, når detekteres ved anvendelse western blotting (figur 3C). Således foreslår vi, at den anti-metastatisk evne

Selaginella

tamariscina

mindste delvist hæmmet MMP-2 og MMP-9 udtryk. Undersøgelse af virkningerne af STE på proteinet ekspression af MMP’er endogene inhibitor, TIMP-1 og TIMP-2, viste, at STE inducerede TIMP-1 og TIMP-2 opregulering i en koncentrationsafhængig måde (figur 3C og 3D)

(A og B) HSC-3-celler blev behandlet med STE (0-100 pg /ml) i 24 timer og derefter underkastet gelatinezymografi at analysere aktiviteten af ​​MMP-2 og MMP-9. (C) HSC-3-celler blev behandlet med STE (0-100 pg /ml) i 24 timer og derefter underkastet western blotting for at analysere de proteinniveauer af MMP-2, MMP-9, TIMP-1 og TIMP-2. (D) Kvantitative resultater af MMP-2, MMP-9, TIMP-1 og TIMP-2-proteinniveauer som blev justeret med β-actin proteinniveau. Værdierne repræsenterede middelværdier ± SD af mindst tre uafhængige forsøg. * P 0,05 sammenlignet med køretøjet gruppen.

Virkninger af

Selaginella

tamariscina

på MMP-2 og MMP-9 mRNA-ekspression og DNA-bindende aktivitet

virkningerne af

Selaginella

tamariscina

på MMP-2 og MMP-9 mRNA-ekspression blev også undersøgt. Et lavt niveau af MMP-2 og MMP-9 mRNA-ekspression blev observeret ved den højeste dosis af

Selaginella

tamariscina Hotel (100 mikrogram /ml) i 6 timer (figur 4A og 4B). For yderligere at undersøge, hvordan

Selaginella

tamariscina

regulerer transkriptionelle aktivitet af MMP-2 og MMP-9, gennemførte vi en luciferase reporter assay, hvor både

Selaginella

tamariscina

og styre- celler blev transficeret med en MMP-2 og MMP-9-promotor-konstruktionen. Figur 4C viser, at MMP-2-promotoraktiviteten blev reduceret med

Selaginella

tamariscina

på en dosis-afhængig måde. Tilsvarende ca. 50% inhibering af MMP-9-promotor-aktivitet var tydelig ved 100 ug /ml

Selaginella

tamariscina

(figur 4D). Disse observationer antyder, at

Selaginella

tamariscina

regulerer MMP-2 og MMP-9-aktivitet ved det transkriptionelle niveau.

HSC-3-celler blev behandlet med STE ( 0, 25, 50, 75 og 100 ug /ml) i 24 timer og derefter underkastet kvantitativ real-time PCR for at analysere mRNA-ekspression af MMP-2 (A), eller MMP-9 (B). (C) MMP-2 eller (D) MMP-9 promotor reporter assay til analyse promotoraktiviteten af ​​MMP’er. Luciferaseaktivitet, bestemt i tre eksemplarer, blev normaliseret til p-galactosidase-aktivitet. Værdierne repræsenterede middelværdier ± SD af mindst tre uafhængige forsøg. * P 0,05 sammenlignet med køretøjet gruppe.

Tidligere undersøgelser har vist, at MMP promotorer reguleres af adskillige transkriptionsfaktorer, såsom AP-1, NFKB, CREB, og SP-1 [23,25,26]. Vi udførte en chromatin immunoprecipitation (chip) assay til at evaluere inddragelsen af ​​transkriptionsfaktorer i de inhiberende virkninger af

Selaginella

tamariscina

på MMP-2 og MMP-9-aktivitet (figur 5A og 5B) . Chip assay og kvantitativ realtids-PCR viste, at

Selaginella

tamariscina

undertrykt binding af CREB og SP-1 til MMP-2-promotoren (figur 5A) i det væsentlige. Figur 5B viser, at

Selaginella

tamariscina

betydeligt inhiberede AP-1, men ikke NF-KB-DNA-binding til MMP-9-promotor. Disse resultater viser, at

Selaginella

tamariscina

inhiberet MMP-2 og MMP-9-ekspression ved regulering bindingsaktiviteten af ​​transkriptionsfaktorer på cis-element i MMP promotorer.

HSC-3-celler blev behandlet med STE 100 ug /ml i 24 timer og derefter den nukleare fraktion blev fremstillet som beskrevet i “

Materialer og metoder

“. Chip analyse af foreningen af ​​forskellige transkriptionsfaktorer med MMP-2 (A) eller MMP-9 (B) promoter region i HSC-3 celler. Værdierne repræsenterede middelværdier ± SD af mindst tre uafhængige forsøg. * P 0,05 sammenlignet med køretøjet gruppen.

Virkninger af

Selaginella

tamariscina

på MAPK og AKT veje

For yderligere at undersøge de underliggende mekanismer i opstrøms signalveje af MMP-2 og MMP-9, vi brugte western blotting til at vurdere effekten af ​​

Selaginella

tamariscina

på MAPK og AKT veje. Figur 6A-6C viser, at MAPK-vejen, som omfatter ERK, JNK, og p38 proteinkinaser, ikke var især inhiberet. Imidlertid

Selaginella

tamariscina

reduceret phosphorylering af Akt på en dosis-afhængig måde (figur 6D). Foreslår vi derfor, at aktiveringen af ​​Akt signalvejen er nødvendig for

Selaginella

tamariscina

at undertrykke MMP-2 og MMP-9.

HSC- 3-celler blev dyrket i forskellige koncentrationer af STE (0, 25, 50, 75 og 100 ug /ml) i 24 timer, og derefter cellelysaterne blev underkastet SDS-PAGE efterfulgt af Western blots med (A) anti-ERK1 /2, (B) anti-JNK, (C) anti-p38 og (D) anti-Akt (total og phosphoryleret) antistoffer som beskrevet i Materialer og Metoder. Bestemte aktiviteter af disse proteiner blev efterfølgende kvantificeret ved densitometrisk analyse med den for kontrollen er 100%, som vist lige under gelen data. Værdierne repræsenterede middelværdier ± SD af mindst 3 uafhængige forsøg. * P 0,05 sammenlignet med køretøjet gruppen.

Diskussion

Talrige lægeplanter er blevet undersøgt for anticancer applikationer, såsom

Dioscorea

nipponica

Makino [23 ] og

Terminalia

Catappa [26]. Gennem det seneste årti,

Selaginella

tamariscina

er blevet en traditionel behandling af forskellige sygdomme [14,15,18,19]. I denne undersøgelse, foreslår vi, at

Selaginella

tamariscina

udviser gavnlige virkninger på oral cancer celle behandling ved (1) at hæmme HSC-3 oral cancer celle migration og invasion, (2) at reducere MMP- 2 og MMP-9-genekspression og enzymaktivitet, (3) inhibering phosphorylering af AKT, (4) aftagende nuklear translokation af CREB og SP-1 til en MMP-2-promotoren, og (5) aftagende nuklear translokation af AP-1 til en MMP-9-promotor. Talrige flavonoider findes i de rå ekstrakter af

Selaginella

tamariscina Hoteller, som udviser forskellige farmakologiske virkninger. Amentoflavon markant anholdt cellecyklus og induceret apoptose af menneskelige bryst- og livmoderhalskræft celler [21,27,28]. Desuden sumaflavone udøvede antiinflammatoriske virkninger ved at blokere iNOS ekspression gennem AP-1-inhibering [29]. Desuden Mirzoeva et al viste, at apigenin udviser antiangiogenisk potentiale i prostatacarcinomceller ved inhibering Smad2 /3 og Src /FAK /Akt pathways [30]. De tidligere undersøgelser har antydet, at flavonoider spiller en afgørende rolle i den anti-metastatiske virkninger af

Selaginella

tamariscina

, men de underliggende mekanismer i denne proces kræver yderligere forklaring.

metastase, som forårsager 90% af kræftdødsfald, er den proces, hvorved cancerceller spredes fra det oprindelige tumorsted til fjerne organer [31]. Nedbrydningen af ​​ECM komponenter og basalmembranen er et kritisk trin i metastase. Der er flere typer af proteaser, der styrer ECM nedbrydning og remodellering. MMP-2 og MMP-9 er den mest omfattende undersøgt af MMP familie på grund af deres høje association med migration kræft og invasion [5]. Adskillige tidligere studier har indikeret, at naturlige produkter hæmmer cancer metastase ved at inhibere MMP-2 og MMP-9-ekspression [23,26]. Vores resultater viser, at

Selaginella

tamariscina

inhiberet MMP-2 og MMP-9-enzymaktivitet samt proteinekspression. Et fald i migration og invasion evner som følge af undertrykkelse af MMP-2 og MMP-9-aktivitet er blevet foreslået. Resultaterne ligner vores tidligere undersøgelse, hvor anti-metastatiske virkninger af

Selaginella

tamariscina

på lunge opstod kræftceller gennem reduceret gelatinase udtryk [19]. Talrige rapporter viser, at MMP-genekspression specifikt blev reguleret af mitogenaktiverede proteinkinaser (MAPK’er), en familie af serin /threonin-kinaser, herunder ERK’er, JNK’erne, og p38 [31-33]. Men vores undersøgelse resultater viste, at der ikke observerbare virkninger på MAPK signalvejen skyldes regulering af MMP produktion af

Selaginella

tamariscina

. Desuden har inddragelse af phosphoinositid-3-kinase (PI3K) /AKT signaltransduktionsvej i MMP-genekspression og cellemigrering undersøgt tilstrækkeligt. Wang et al viste, at isoliquiritigenin inhiberede ekspressionen og gelatinolytisk aktivitet af MMP-2 og MMP-9 ved at regulere opstrøms AKT signaleringsveje i brystcancer MDA-MB-231-celler [34]. En anden undersøgelse konkluderede, at berberine, en isoquinolin alkaloid, inhiberede brystcancercellelinje metastase ved at modulere AKT pathway [35]. Vore data også foreslået, at PI3K /AKT signalvejen er involveret som en opstrøms udløser af MMP-2 og MMP-9 regulering.

Udtrykket af MMP’er kan reguleres på flere niveauer, herunder transskription, post-transskription , oversættelse, proenzym-aktivering, og undertrykkelse niveauer af specifikke inhibitorer [36]. Det foreslås, at

Selaginella

tamariscina

reguleret MMP-2 og MMP-9 ved det transkriptionelle niveau, fordi promotoraktivitet og mRNA-ekspression blev inhiberet. MMP promotorer har flere cis-elementer, der kan transaktiveret af flere transkriptionsfaktorer, såsom NF-KB, AP-1, CREB, og SP-1. Tidligere undersøgelser har vist, at AKT /SP-1-vejen reguleret MMP-2 promoter aktivitet og påvirkede migration evne cancerceller [24,37]. Satpathy et al viste, at vævstransglutaminase 2 modulerer CREB aktivering og MMP-2-transkription i ovariecancer [38]. Den opstrøms promotorsekvens af MMP-9-genet indeholder AP-1 og NF-KB-sites. Epigallocatechingallat (EGCG) udøver sin anti-invasiv virkning ved at undertrykke AP-1-aktivering i humane gastriske cancerceller [39]. Desuden NF-KB regulerer ekspressionen af ​​MMP-9 i forskellige kræftformer [33,40,41]. Selvom MMP-9 mRNA ekspression blev reguleret af

Selaginella

tamariscina

, vi ikke observere en bemærkelsesværdig virkning på NF-KB-DNA-bindende aktiviteter. Vores undersøgelse viser, at MMP-2-ekspression reguleres af CREB og SP-1 DNA-bindende aktiviteter, når ramt af

Selaginella

tamariscina

, og AP-1 stedet var nødvendige for hæmning af MMP -9 udtryk.

resultaterne af denne undersøgelse viser, at

Selaginella

tamariscina

reduceret oral cancer migration og invasion ved at hæmme MMP-2 og MMP-9 genekspression, og enzymaktivitet. Disse antitumorvirkninger på OSCC er forbundet med undertrykkelse af AKT og undertrykkelsen af ​​DNA-bindende aktiviteter på MMP-2 og MMP-9 promotorer. OSCC invasion og metastase er en væsentlig hindring for kræftbehandling. Derfor hæmning af metastaser af

Selaginella

tamariscina

kunne give vitale forebyggende og terapeutiske fordele for behandling af oral cancer.