PLoS ONE: Triglycerid Vabler i lipiddobbeltlag: Konsekvenser for Lipid Droplet Biogenese og Mobile Lipid Signal i Cancer Cell Membranes

Abstrakt

Triglycerider har en begrænset opløselighed, omkring 3%, i phosphatidylcholin lipid dobbeltlag. Under anvendelse millisekund-skala course kornet molekylære simuleringer, viser vi, at modellen lipiddobbeltlaget kan rumme en højere koncentration af triolein (TO) end tidligere forventet, ved sekvestrering triolein molekyler til dobbeltlaget centrum i form af en uordnet, isotropisk, mobil neutral lipidaggregat, mindst 17 nm i diameter, som danner spontant, og forbliver stabil på mindst mikrosekund tidsskala. Resultaterne fæste lid til den omdiskuterede eksistensen af ​​mobile neutrale lipidaggregater med ukendt funktion stede i maligne celler, og til den tidlige biogenese af lipiddråber rummes mellem de to foldere af det endoplasmatiske reticulum-membran. Den på aggregater giver dobbeltlaget en blister-lignende udseende, og vil hindre dannelsen af ​​multilamellare faser i modellen, og eventuelt levende membraner. De blærer vil resultere i unormal membran sonde partitionering, som bør tages hensyn til i fortolkningen af ​​probe-relaterede målinger

Henvisning:. Khandelia H, Duelund L, Pakkanen KI, Ipsen JH (2010) Triglycerid Vabler i Lipid dobbeltlag: Konsekvenser for Lipid Droplet Biogenese og Mobile Lipid Signal i Cancer cellemembraner. PLoS ONE 5 (9): e12811. doi: 10,1371 /journal.pone.0012811

Redaktør: Darren R. Blomst, University of Oxford, England

Modtaget: 13 juli, 2010; Accepteret: August 24, 2010; Udgivet: 22 September, 2010

Copyright: © 2010 Khandelia et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er finansieret af Den danske Grundforskningsfond. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i denne rapport undersøger vi de biofysik af model membraner indeholdende lave koncentrationer af triglycerid-molekyler.

Triglycerider eller triacylglyceroler (tgLS) er neutrale lipider, hvor hver af glycerol hydroxylgrupperne er forestret med en fedtsyre. TgLS er den vigtigste del af mange naturlige olier, såsom olivenolie. I pattedyr, tgLS er til stede det meste inde menneskehandel lipoprotein partikler, som transport kolesterol, sterylestere, og tgLS mellem væv [1], lipid dråber (LDS) [2]. LD’er er også til stede i andre eukaryots, og i nogle prokaryote celler der syntetiserer tgLS for energi og kulstoflagring [3]. TgLS i lipoproteiner og LDs har været genstand for stor interesse på grund af den rolle, som disse partikler i fysiologi [4], sygdom [5].

Udover lipoproteiner og LDs, tgLS er også til stede i flere biologiske membraner på varierende koncentrationer. De lamellare organer lungesurfactant ekstrakter i pattedyr kan indeholde mellem 0,5% til 1,8% vægt /vægt tgLS [6], [7]. Ocular linse lipider indeholde små mængder (gg tgLS /mg phospholipider) af tgLS. TgLS er også til stede i intestinale membranekstrakter [8]. Lysosomer indeholder ikke ubetydelige mængder af tgLS for eksempel i dyrkede hamster fibroblaster [9]. I rottehepatocytter, lysosomer indeholder næsten 3,7% tgLS [10]. Mange prolifererende eller aktiverede pattedyrceller i særdeleshed, har en høj koncentration af tgLS i membraner. Cancerceller indeholder så højt som 6,8% TGL fraktion af totale plasma membranlipider [11]. Adskillige maligne ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO) cellelinier indeholder 2,4-3,2% tgLS i deres plasmamembraner [12]. Humane neutrofiler indeholde så højt som 5,2% og 6,8% tgLS i deres plasmamembraner før og efter stimulering med lipopolysaccharider [13]. Aktiverede makrofager [14], lymfocytter [15] og B-celler [16] indeholder også store mængder af tgLS i deres plasmamembraner. I denne rapport, vi undersøge effekten af ​​lave koncentrationer af tgLS, som findes i en række celletyper nævnt ovenfor, om strukturen og dynamikken i model membraner, med det formål i sidste ende opnå hints i den mulige strukturelle og funktionelle rolle tgLS i plasmamembranen af ​​levende systemer. Vi har anvendt triolein (TO) som vores model TGL, og 1-palmitoyl-2-oleoyl

sn

glycero-3-phosphocholin (POPC) som model phospholipid.

Der har været spredte rapporter undersøger de biofysik og biokemi af model TO-phospholipid blandinger. Adskillige

13C-NMR studier er blevet anvendt til at bestemme den maksimale opløselighed af tgLS i modelmembraner hovedsagelig indeholdende PC lipider. Den

13C-spektret af en TGL kan skelne mellem carbonylgrupperne på forskellige positioner (a eller p), og forskellige hydrering niveauer (nær en grænseflade, eller i et olieagtigt dråbe). Brug

13C-NMR, opløselighed TO i lamellare strukturer og orienteret som fosfolipider er således dokumenteret at være inden for 3% både i små unilamellære vesikler (SUV’er) [17], [18] og i multilamellare vesikler (MLV’er) [19] af phosphatidylcholin lipider. Lignende opløselighedsgrænser blev opnået, når heterogen tgLS, hvor alle tre positioner af glycerol ikke er esterificeret med den samme fedtsyre, blev opløst ved SUV’er [20]. I SUV’er, er opløseligheden sænkes til så lavt som 1%, hvis cholesterol er til stede i et 1:02 forhold med phospholipider og til 0,15%, hvis forholdet er 1:01 [21]. I alle undersøgelser blev yderligere carbonyl toppe i spektre opnået, når TGL koncentrationen blev hævet over 4%. Disse toppe var typiske for tgLS i “olie” fase. Multinucleare og magi-vinkel spinning NMR undersøgelser af 0, 0,25, og 0,75 molbrøk TIL i æg-phosphatidylcholin viste, at TO forårsagede betydelige ændringer i den molekylære organisation dobbeltlag, herunder en stigning i kæde flydeevne [22]. TgLS, bliver formet som omvendte kegler, kan også fremme lamellar til omvendt sekskantede faseovergang i begge PE membraner [23],.

Selv om der kan påvises [24] kun op til 2-3% tgLS som opløst ved grænsefladen i modelmembraner, er det klart, at prolifererende celler (se ovenfor) kan indeholde mere end 6-7% tgLS. Hvis model membraner kun kan rumme 2-3% tgLS i den kanoniske dobbeltlag kropsbygning, og endnu mindre, så hvis kolesterol er til stede [21], og mere end 6-7% tgLS er faktisk til stede i membranerne i kolesterol-holdige levende celler,

hvor kommer det overskydende TGL gå

? Et muligt svar ligger i observation af en særskilt gruppe af

1H-NMR resonanser fra levende celle NMR eksperimenter, der stammer fra “mobile lipider” fra væv triglycerider [25]. Det blev foreslået i 1980’erne [26], at dette signal delvis stammer fra en overskydende triglycerid pulje, som er anbragt i midten af ​​membranen som mikrodomæner. Der har været spredte rapporter om mikroskopiske observationer af sådanne mikrodomæner, selv om en smule større i størrelse -60 nm [27], [28], [29]. Det meste af

1H-NMR mobile lipid signal muligvis kommer fra den cytoplasmatiske pulje af tgLS, men baseret på mikroskopi studier og følsomheden af ​​signalet til paramagnetiske gadolimium ioner (som binder til membraner), muligheden for en membran pulje af tgLS kan ikke udelukkes [25].

i seneste arbejde, blev det vist, at centrifugering eller natten bundfældning af TO-POPC blandinger førte til en faseadskillelse i en tung fase pellet og en let fase, mens den overskydende TO dannede en olieagtig senere på toppen [30]. Selv om sammensætningen af ​​de lette og tunge fase var ens, de to faser havde bemærkelsesværdigt forskellige hydrering og fluiditetsegenskaber, hvoraf nogle kunne forklares ved en model, som antydede, at glycerolskelettet af tgLS også kunne være i centrum af lipiddobbeltlaget [30].

Tidligere simuleringer af TGL-holdige systemer har enten fokuseret på lipidemulsioner [31], eller på lipoproteiner [32], [33]. I denne undersøgelse har vi undersøgt de konformationer af tgLS i model POPC lipiddobbeltlag ved koncentrationer over og under grænsefladepolymerisering opløselighedsgrænsen for tgLS. Vi har brugt en omfattende kursus kornet molekylære simuleringer for at få adgang strukturelle og dynamik detaljer ikke let tilgængeligt med analytiske teknikker. Udover at opnå ny indsigt i de biofysik af TGL-holdige membraner, vores resultater er relevante for biogenesen af ​​lipiddråber i ER, og at tilstedeværelsen af ​​mobile lipid domæner i maligne eller aktiverede celler.

Metoder

Simuleringer blev udført ved hjælp af kursus-kornet (CG) modeller af POPC-tO-blandinger ved en to koncentrationer, en smule under (~2.3%), og den ene over (~5.2%) grænseflade-opløselighed grænse på tO. Den komplette liste over simuleringer er vist i tabel 1. CGMD simuleringerne er foretaget ved hjælp af MARTINI kraftfelt for lipider [34]. Force field parametre for TO blev tilpasset fra eksisterende parametre for DOPC, ved at erstatte phosphocholin- del af en oleoyl kæde. Det var ikke forpligtet til at indføre nye partikel, obligations- eller interaktion typer.

De første koordinater for en POPC dobbeltlag blev opnået fra en selv-samling simulering af 270 POPC i overskydende vand, på en lipid: vand-forhold på 1:60. Da hver vand perle i MARTINI svarer til fire vandmolekyler, simuleringen indeholdt 270 lipider og 4050 vand perler. For at konstruere 5,2% TO-POPC blanding blev 14 POPC molekyler erstattet af molekyler på to forskellige måder. I et tilfælde blev 7 tilfældige POPC molekyler plukket fra hver folder og erstattet af molekyler. Vi vil henvise til denne opsætning som RAND5. I det andet tilfælde blev ensartet fordelte POPC molekyler selektivt erstattet af molekyler. Vi vil henvise til denne opsætning som UNI5. To eksemplarer af hver af RAND5 og UNI5 opsætninger blev simuleret med forskellige starthastighed distributioner, hvilket resulterer i 4 simuleringer af 5,2% til systemer. For at konstruere den 2,3% til systemer, 8 til molekyler blev fjernet fra UNI5 systemer. Vi vil henvise til denne opsætning som UNI2. To eksemplarer af UNI2 setup blev simuleret.

Simuleringer var også køre til større dobbeltlag patches 19 nm × 19 nm. Til dette blev den UNI2 og UNI5 systemer gentaget fire gange i planet af dobbeltlaget, hvilket resulterer i dobbeltlag indeholdende 1024 POPC og 24 (2,3%) eller 56 (5,2%) til molekyler. Vi vil henvise til disse systemer som 4X2 og 4×5 hhv. Den endelige konfiguration fra UNI5 simulation blev brugt til at konstruere et større system ved hjælp af samme procedure, og en simulering af større patch blev gennemført, vil vi henvise til denne opsætning som 4XMID5. To meget store simuleringer blev gennemført med 5,2% til at teste for finite størrelse effekter, og at kontrollere, om antallet og størrelsen af ​​TO aggregater i midten af ​​membranen ændres (se senere). Disse systemer vil blive omtalt som 9×5 og 16×5. Dobbeltlaget plastre blev 28 nm × 28 nm og 37 nm × 37 nm, og antallet af lipider var 2430 og 4230 henholdsvis.

Endelig, for at bekræfte spontan opdeling af molekyler i lipidfasen, selv-samling simuleringer af 2,3% og 5,2% til indeholder tilfældigt fordelt POPC, TO og vandmolekyler blev gennemført. Tre eksemplarer af hver koncentration blev simuleret, og i hvert tilfælde AT opdelt i selvstændige samlet POPC dobbeltlag inden for de første 100 nanosekunder. Dataene fra selvsamlende simuleringer vil ikke blive diskuteret yderligere, fordi resultaterne er identiske med dem fra RAND5, UNI5 og UNI2 simuleringer.

Simuleringerne blev udført med den GROMACS 4.0.4 pakke i isobarisk-isotermisk (NPT) ensemble ved 1 bar og 323 K, ved hjælp af Berendsen [35] termostat (afslapning tid 0.3ps) og barostat (kobling konstant 3,0 til mindre dobbeltlag patches, og 5,0 for større dobbeltlag patches) med semi-isotrope pres kobling. Z-aksen var parallel med dobbeltlaget normal. En tidsskridt på 30 fs blev brugt, koordinater blev reddet hver 900 ps, ​​og blev efterfølgende behandlet for at gemme snapshots hver 13,5 ns at fremskynde analyse rutiner. Ikke-bundne interaktioner var cutoff ved 12 Å.

Analyse af simuleringer blev foretaget i GROMACS suite af programmer. VMD blev anvendt til molekylære grafik [36]. De første 2 mikrosekunder af CG simuleringer blev kasseret som ækvilibrerings- perioder for beregning af ensemble-gennemsnittet egenskaber.

Resultater

Fordeling af Triolein i POPC

De strukturelle egenskaber af dobbeltlag, fordelingen af ​​tO og POPC tæthed, og flip flop satser til fra to eksemplarer hver af de UNI5 og RAND5 var kvalitativt og kvantitativt ens, viser, at de resultater, diskuteres i de følgende afsnit er uafhængige af de indledende konformationer af tO i POPC dobbeltlaget. Endvidere skyldes den større 4×5 og 4XMID5 simuleringer var identiske, hvilket viser, at de endelige konformationer var uafhængig af den oprindelige tilstand af systemet. For klarhedens skyld resultater fra kun én ud af de fire CG simuleringer med 5,2% til vil blive præsenteret, medmindre andet er angivet. Tilsvarende er resultaterne fra kun en af ​​de to kopier af UNI2 fremlagt.

Densiteten fordeling af glycerol rygraden til fra UNI2 (2,3% TO), UNI5 (5,2% TO) og 4×5 (5,2 % TO, er større simulering størrelse) simuleringer er vist i fig. 1. Simuleringer snapshots fra de tre simulationer er vist i fig. 2. Tætheden af ​​for komponenter er blevet multipliceret med en faktor 10 for tydelighedens skyld. Counter-intuitivt, er der en betydelig densitet af det polære til glycerol rygrad bosiddende i den hydrofobe centrum af membranen i alle tre tilfælde. Der er en højere tæthed af i UNI5 simulation, sammenlignet med UNI2 simulering. I UNI5 simulation, TIL nogle molekyler partition i dobbeltlaget center i form af en til at aggregere, der er blottet for enhver konkret arrangement af TO molekyler. Antallet af molekyler, som forblev på grænsefladen var ens for de 2,3% og 5,2% simuleringer, hvilket indikerer den begrænsede grænsefladespænding opløselighed TO i lipid dobbeltlag. De overskydende lipider, der ikke kunne rummes ved grænsefladen i de 5,2% simuleringer dannede et aggregat i midten af ​​membranen. Men da systemet størrelse forøges, blev meget lidt til venstre ved grænsefladen (fig. 1a) i 4XMID5 simulering. Således foretrækkes opsuget af den samlede, snarere end ophold på membranen grænsefladen i et tilstrækkeligt stort system med en større aggregat. Der var meget lidt at ved grænsefladen i 4×5, 4XMID5, 9×5 og 16×5 simuleringer, og den samlede besatte et areal næsten halvdelen af ​​det af membranen patch (fig. 2a). Ingen aggregat blev dannet i UNI2 simuleringer. Vi bemærker, at ikke-nul tæthed TO på dobbeltlaget center i UNI2 systemet viser, at AT kan fordele sig i dobbeltlaget centrum uden et aggregat er til stede. Densiteten profil UNI2 svarer til den af ​​de større 4X2 ifølge den samme koncentration. Den samlede i midten af ​​membranen er biologisk relevant. Det svarer til triglycerid-rige mobile lipid domæner tidligere påvises under anvendelse

1 H-NMR-spektre af cellesuspensioner, der registrerer mobile lipide domæner, der bærer en stor mængde triglycerider [11], [26], [28]. Aggregatet er også lignende en spirende lipid dråbe observeret i ER-membranen. Vi vil vende tilbage til dette i diskussionen.

Antal tæthed profiler af glycerol rygraden i TO (Glyc-TO), POPC fosfat grupper (Phos-POPC) og POPC glycerol perler (Glyc-POPC). Koncentrationen af ​​AT ved grænsefladen svarer til UNI2 (c) og UNI5 (b) simuleringer, men er meget lav i 4XMID5 simulering (a), hvor det meste af den til Områder i dobbeltlaget centrum.

Øjebliksbilleder fra (a) 4XMID5 (b) UNI5 (c) UNI2 simuleringer. POPC haler er vist i blå, bliver POPC fosfat perler vist som grønne kugler, TIL haler er vist i rød, til glycerol rygrad læser vises som røde kugler, og vand er afbildet i cyan. De blå linier repræsenterer de centrale simulering celle grænser.

tætheden profiler i fig. 1 ikke symmetrisk omkring dobbeltlaget center. Især er der mere til molekyler på opdeling i den øverste folder (z 0) sammenlignet med lavere folder, trods den høje AT flip-flop. Grunden til denne tilsyneladende anomali er, at antallet af POPC lipider i de to foldere af dobbeltlaget ikke var lig i den indledende lipid selv-samlet POPC dobbeltlag, som blev anvendt til efterfølgende konstruere alle TO-POPC simuleringsmodeller. Antallet af POPC molekyler i den øvre indlægsseddel blev lavere end i den nedre folder, hvilket således resulterer i et større antal til molekyler i sidste ende at diffundere til den øvre folder til at holde det molekylære densitet lig i begge foldere. Vi implementerede to yderligere simuleringer (med 2,3% og 5,2% TO), hvor det oprindelige antal POPC molekyler var lig i begge foldere, og i så fald, var at fordeles ligeligt i begge foldere (Figur S1).

flip-flop på tO molekyler i alle CG simuleringer er rapporteret i den sidste kolonne i tabel 1. på grundlag af tætheden fordeling af til glycerol rygraden i hver simulering, blev dobbeltlaget opdelt i tre regioner, to grænsefladeteknik og en i midten af ​​membranen. En flip-flop begivenhed blev registreret hver gang centrum af massen af ​​glycerol rygraden i en til molekyle translokeres fra en grænseflade-region til den anden. Den flip-flop på TO var bemærkelsesværdig høj: spænder fra 0,3 til 1,2 pr mikrosekunder for prøveudtagning tid, afhængig af koncentrationen af ​​TO, og størrelsen af ​​simuleringen. En flip-flop på ~ 1 pr mikrosekunder sampling tid ville gå uopdaget i kortere all-atom MD simuleringer. Flip-flop sats i RAND5 og UNI5 simuleringer var højere på grund af dannelsen af ​​at sammenlægge hvilket sænker fri energi barriere for translokation af den polære til glycerol rygrad over membranen. Størrelsen af ​​de samlede stigninger næsten proportionalt i større 4×5 og 4XMID5 simuleringer, og flip-flop satser samtidig stige med næsten en faktor tre, tilsyneladende på grund af et yderligere fald i den frie energi barriere, som aggregatet optager næsten halvdelen af overfladearealet af dobbeltlaget patch. Aggregaterne dannet i 5,2% simuleringer er meget dynamisk karakter, og for molekyler udveksler ofte mellem interface og aggregatet. Ingen flip-flop begivenhed blev observeret for enhver POPC molekyle i enhver simulering i aftale med tid-løst lille vinkel neutronspredning eksperimenter på store unilamellære vesikler, som tyder meget langsomme POPC flip-flop [37]. Vi implementerede også omkring 1 mikrosekund simuleringer med højere opløsning forenet-atom modeller for 0% og 5% til at bruge Berger kraftfelt for lipider. I disse simuleringer blev der ikke SKAL ses på dobbeltlaget centrum, og ingen af ​​de TO molekyler flip-floppede på grund af de korte tidshorisonter.

Molekylær konformationer af Triolein Molekyler

De tre acylkæder triolein molekyler kan sprede sig i forhold til hinanden, hvilket fører til forskellige molekylære konformationer. Tidligere MD simuleringer af ren til systemer i krystallinske eller amorfe stater viste, at molekylerne kan vedtage flere konformationer, herunder stemmegaffel (sn1 og SN3 hale parallelt, og sn2 antiparallelle), stolen (sn1 og sn2 eller sn2 og SN3 parallelt, og den anden hale antiparallelle), trefork (alle haler parallel) eller væske (kæder peger i tilfældige retninger) [32]. Inde lipiddobbeltlag, vil så righoldige konformationer ikke blive gentaget, fordi når ved grænsefladen, pakningen af ​​haler på en AT-molekyle ville være tvunget til at være parallel med dobbeltlaget normal. Men når en AT-molekyle er i centrum af dobbeltlaget, kan dens acylkæder splay. Vi har opdelt TIL konformationer i tre typer afhængig af vinklen mellem tilgrænsende par af haler.

θ

1-2

blev defineret som vinklen mellem SN1 og SN2 haler, og

θ

2-3

blev defineret som vinklen mellem SN2 og SN3 haler. Linjen mellem glycerol perle til den sidste acyl hale perle beskrevet hver hale vektor. Vi klassificeret TIL konformationer som helt spredte, delvis spredte eller ikke spredte afhængigt af

θ

1-2

θ

2-3

: Den overordnede brøkdel af unsplayed, fuldt spredte, og delvist spredte til molekyler er vist i fig. 3. Omfanget af splaying var korreleret til positionen af ​​et til polære glycerolrygrad inde i membranen. Som forventet, acyl haler var mere spredte i centrum af dobbeltlaget i alle simuleringer. I modsætning til intuition imidlertid kæderne er delvist spredte mere end 20% af tiden, og fuldt spredte 5% af tiden, når den polære rygrad til molekyler bor ved grænsefladen. Fraktionen af ​​fuldt spredte og delvist spredte til molekyler er næsten identiske i alle systemer i midten af ​​membranen. I 5,2% til systemer, de overordnede spredte fraktioner er højere, fordi TO molekyler tilbringe mere tid i midten af ​​membranen. For reference, vinklen mellem POPC acylkæder var større end 90 grader mindre end 4,5% af tiden i alle CG simuleringer (data ikke vist). Den høje andel af udspredte haler på dobbeltlaget center antyder en isotropisk at aggregere.

De fraktioner af TO spredte haler i CG simuleringer. For definitioner af splaying henvises til teksten. De haler af en TIL molekyle er mere spredte, når det er i nærheden dobbeltlaget center, hvilket tyder på en isotropisk miljø i at sammenlægge.

hydrering niveauer af glycerol Beads

I

13C-NMR-spektre af aT i æg-PC unilamellare liposomer, var det muligt at skelne mellem de to toppe, som stammer fra de to a-carbonyler og β-carbonylgruppen [17]. Den højere carbonyl resonansfrekvens β-carbonyl indikerede, at det var mindre hydrogenbundet til vand, og derfor sad dybere i lipid-vand-grænsefladen [17]. I fig. 4a, vi har vist profilerne densitet for de tre glycerolperler fra CG simuleringer langs dobbeltlaget normal. For overskuelighedens skyld er kun data fra den lille 2,3% til systemet rapporteret. Sn2 (eller β) carbonylgruppe er lidt dybere i dobbeltlaget end de to andre (sn1 og SN3) carbonyl perler. Hydreringen af ​​perlerne blev beregnet ud fra den radiale fordelingsfunktion af vand perler rundt hver glycerolrygraden perle (fig. 4b). Den β eller SN2 perle er den mindst hydratiseret del af glycerol backbone, i god overensstemmelse med NMR-data.

(a) Density fordeling af de to α og en β glycerol backbone perler af TO. For kortheds skyld er kun én monolag vist. Den β vulst ligger dybere i dobbeltlaget end de to a-perler. (B) radial fordelingsfunktion af vand omkring perlerne. Den β glycerol perle klart mindre hydreret end både a- perler, i meget god aftale med

13C-NMR [17].

De strukturelle egenskaber af dobbeltlaget (område pr lipid, tykkelse , order parametre) er præsenteret i den bærende information. Områderne og tykkelser er opstillet i figur S2, og ordren parametre præsenteres som tekst S1.

Diskussion

Brug omfattende CG simuleringer opsummering til mere end 1,8 millisekunder, vi bevis for tilstedeværelsen af et stort at aggregere på dobbeltlaget center på en koncentration højere end grænsefladeteknik opløselighed TO. Som simuleringssystemet størrelse stiger, størrelsen af ​​den samlede øger også proportionalt. I de største simuleringer vi gennemført (1400 nm

2 plaster), det samlede indsuges meste af molekyler fra grænsefladen til membranen centrum (fig. 5). Aggregatet var skiveformet og omkring 17 nm i diameter. I 16×5 og 9×5 simuleringer blev flere aggregater oprindeligt dannet i membranen, der efterfølgende coalesced sammen til dannelse af større aggregat. Det er ikke klart, om størrelsen af ​​den samlede vil fortsætte med at stige som stadig større dobbeltlag patches er simulerede, men finite-size effekter er vigtige i det nuværende system. For de mindre UNI5 og RAND5 simuleringer blev en betydelig tæthed af AT detekteret ved dobbeltlaget interface. Men som simuleringen størrelse blev forøget med 4X, 9X og 16X, det meste af AT opdelt i samlet efter dobbeltlaget centrum.

Simulation snapshot fra den største systemet 16×5 simuleret, indeholdende en 37 × 37 nm dobbeltlag lappe. (A) set fra siden, hvor to periodiske billeder i langs dobbeltlaget normale er blevet vist. (B) Ovenfra er kun den centrale simulation celle vist. De blå linier repræsenterer de centrale simulering celle grænser. Farvekodning ligner fig. 2. Det samlede i midten er ~17 nm i diameter.

Når, og på hvilket kritisk størrelse (hvis nogen) vil TO aggregater forlader dobbeltlaget og fase adskilt? Triglycerid er uopløseligt i vand og fase separerer med en stor grænsefladespænding

γ

O /W

= 35-50 mN /m. Når amfifiler, f.eks overfladeaktive midler eller lipider, der indføres i opløsningen grænsefladespændingen er stærkt formindsket fører til mikro-faseseparation af vand og olie. Dette er forårsaget af berigelse af olie-vand-grænsefladen med et monolag af amfifiler. Grænseflade-fri energi (

F

jeg

) af en sådan selv-samlet amfifile interface er skal ændres til at omfatte bøjning elastisk energi [38] Her

H

m

er middelværdien krumning af den amfifile monolag og er den spontane krumning af grænsefladen.

κ

m

er den bøjning stivhed [39], og

En

er grænseflade-område. For uopløselige amfifiler (som lipider, såsom POPC) grænsefladespændingen

γ

er forsvindende og den ovennævnte ligning fører til en karakteristisk smådråbestørrelse med radius 1 /. For en sfærisk formet selv-samlet monolag den spontane krumning kan estimeres ud fra den kritiske pakning parameteren

P = v /al

[40], [41]:

Her

l

er den molekylære længde,

v

er den molekylære volumen og

en

er den tværsnitsareal af hovedgruppen. For POPC, er omkring 13,9 nm. Dette er den klassiske droplet mikroemulsion billede af den ternære blanding af olie, vand og lipider [42]. Den nuværende arbejde har vist, at et andet scenario er muligt i ved lave koncentrationer af olie. De lipider danner dobbeltlag strukturer, der op til en vis opløselighedsgrænsen

c * Hotel (3% for TO i POPC) tillader inkorporeringen af ​​triglycerid i dobbeltlaget. Når [TO]

c

*

, TO skillevægge mellem en konfiguration i midten af ​​dobbeltlaget og en grænseflade-konfiguration med en fordelingskoefficient på omkring ~0.27. Når [TO]

c

*

, det overskydende til fase adskiller i membranen struktur, for at danne en ren oliefase i midten af ​​dobbeltlaget som set i vores simuleringer. Svarende til den ovennævnte beskrivelse af dråben mikroemulsion, triglycerid blister dannes med et lipid monolag ved olie-vand-grænseflade, med den samme foretrukne krumning. den samlede størrelse af blisterne kan imidlertid være mindre på grund af grænsebetingelser virkninger mellem dobbeltlaget og blisterpakningen. Bidraget fra sådanne grænse virkning på formen og stabiliteten af ​​sådanne blærer er for nylig blevet beskrevet af Zanghellini et al. [43] i en fænomenologisk model. Det er også muligt, at blærer inden lipiddobbeltlag kan dannes ved andre carbonhydrider samt, og denne mulighed er værd at undersøge i fremtiden.

Hvad er den biologiske relevans af den på aggregater? De fleste naturlige dobbeltlag membraner indeholder ikke en meget høj procentdel af tgLS. plasmamembranerne af visse aktiveret eller prolifererende celletyper, herunder cancerceller, makrofager, B og T-celler, kan imidlertid indeholde mere end 5% tgLS, selv om funktionen eller betydningen af ​​tilstedeværelsen af ​​en så høj mængde af tgLS er uklar [ ,,,0],27]. Da grænsefladepolymerisering opløselighed tgLS er mindre end 5%, den konformationelle spektrum af tgLS i plasmamembraner sådanne celler kan diskuteres. Forslag baseret på

1 H-NMR af mobile lipider, tgLS kunne danne 20-30 nm mellemstore mikrodomæner på dobbeltlaget center [26] ikke samle støtte på grund af manglende fysiske beviser på sådanne domæner, som kun har optrådt sporadisk [28 ], [29]. En særskilt mobil lipid

1 H-NMR-signalet som følge af 60 nm intra-membran partikler kunne observeres i TEM billeder fryse-brækkede celler [28]. Partiklerne var adskilt fra calveolae, og signalet blev derfor tilskrevet en mobil lipid partikel bestående af tgLS og sterylestere [28]. Det blev imidlertid efterfølgende drøftet, om en sådan

1H-NMR signal kunne detektere partikler af denne størrelse overhovedet, omend for en anden cellelinje [27]. Baseret på

1H-NMR eksperimenter, Mountford og Wright havde foreslået en membran model, hvor lipid-partikler kunne indpasses i plasma membraner. Mountford og Wright [26] hævdede, at de fleste af de

1 H-NMR-signalet stammer fra membranen, men det har siden [25] blevet bestridt. Simuleringer rapporteret i dette arbejde giver indledende molekylære beviser for strukturer, hvor TO kan faktisk være til stede inde dobbeltlag membraner i frit tumbling form af “mobile lipider”. Størrelsen af ​​de observerede i vores simuleringer aggregater er ikke så stor som 60 nm, simpelthen fordi vi ikke kunne modellere systemer er store nok til en sådan samlet til at danne. Således simuleringer yde støtte til oprindelige model af Mountford og Wright, med den bemærkelsesværdige undtagelse, at vi er tilbageholdende med at kalde vores aggregater “domæner”, fordi deres maksimale størrelse (indtil videre) er begrænset til 17 nm. Endvidere finder vi, at aggregaterne er meget dynamisk karakter, og for molekyler kan udveksle mellem aggregatet og grænsefladen på det tidspunkt omfanget af mikrosekunder.

Lille til dråber kan også findes i cytoplasmaet i flere typer af pattedyr og gærceller, i form af lipiddråber. Lipid dråber (LDS), tidligere anset blot energi depoter, er for nylig blevet anerkendt som cellulære organeller. LD’er har en kerne dannet af neutrale lipider, som f.eks i adipocytter er for det meste tgLS. Kernen er foret med et lipid monolag, som er afledt fra moderen membran af ER. Imidlertid lipidsammensætningen af ​​LD monolag afviger fra ER-membranen. Monolaget er rigeligt i phosphatidylcholin, phosphatidylethanolamin og phosphatidylinositol ligesom ER, men indeholder flere lysolipider og fri cholesterol og mindre sphingomyelin og phosphatidinsyre end moderen membranen [44], [45]. Årsager bag berigelse og udtynding af visse lipid arter i LD monolag er ikke kendt. En af de foreslåede teorier er, at biogenesen af ​​LD’er på ER-membranen forekommer i særlige områder eller domæner.