PLoS ONE: GLI2 Regulerer TGF-β1 i Human CD4 + T-celler: Konsekvenser i kræft og HIV Pathogenesis

Abstrakt

Forhøjede niveauer af immunregulerende cytokin TGF-β1 i kræft og HIV-infektion har været forbundet med undertrykkelsen af beskyttende immunreaktioner. Den transkriptionelle regulering af TGF-β1 er kompleks og stadig ikke helt forstået. Vi rapporterer her for første gang, at transkriptionsfaktoren GLI2 regulerer ekspressionen af ​​TGF-β1 i humant CD4

+ T-celler.

I silico

screening afslørede fem nye formodede GLI bindingssteder i den menneskelige

TGF-β1

promotor. Mindst to af disse steder i det menneskelige

TGF-β1

promotor er reguleret af GLI2 aktivator som knockdown af

GLI2

i regulerende CD4

+ CD25

hi T-celler, høje producenter af TGF-β1, faldt betydeligt

TGF-β1

transskription. Derudover naive CD4

+ T-celler, lave producenter af TGF-β1, øget deres basale niveau af

TGF-β1

mRNA efter lentiviral infektion med GLI2. Den transkriptionelle regulering af

TGF-β1

ved GLI2 er en ny udvidelse til Sonic Hedgehog (SHH) og

TGF-β1

cross-regulering og kan give indsigt i den skadelige elevation af TGF-β1 fører til patogenese i kræft og HIV-infektion

Henvisning:. Furler RL, Uittenbogaart CH (2012) GLI2 Regulerer TGF-β1 i human CD4

+ T-celler: Konsekvenser i kræft og HIV patogenese. PLoS ONE 7 (7): e40874. doi: 10,1371 /journal.pone.0040874

Redaktør: Derya Unutmaz, New York University, USA

Modtaget: 26 juli, 2011; Accepteret: 18 juni 2012; Udgivet: 31 juli, 2012 |

Copyright: © Furler, Uittenbogaart. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health AI-081.636 og AI-028.697 (University of California Los Angeles, center for aIDS Research), et Jonsson Omfattende Cancer center Seed Grant og en Stein Oppenheimer Endowment Award. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

transformerende vækstfaktor-β1 (TGF-β1) er et pleiotropisk cytokin, som regulerer immunresponset i mange sygdomme, herunder cancer og HIV-infektion og spiller en vigtig rolle i forebyggelsen af ​​patogenese [1] – [5]. Det er produceret af flere celletyper, herunder CD4

+ CD25

hi regulatoriske T-celler, makrofager, såvel som af fibroblaster. TGF-β1 nedsætter proliferation af T- og B-lymfocytter, effektorfunktioner af mange celler i immunsystemet og inducerer perifere regulatoriske T-celler [6]. Skønt TGF-β1 er kritisk i hele pattedyrs udvikling og for at forhindre afvigende aktivering af værtens immunsystem, høj ekspression af TGF-β1 kan dæmpe beskyttende immunresponser på tumorer og infektioner.

Aberrant høj produktion af TGF-β1 ved maligne celler blev vist at forøge metastase samt at forhindre en beskyttende immunrespons hos værten til tumorer [7]. Ved kronisk HIV-infektion, er TGF-β1 forhøjet i flere rum, herunder lymfoide væv, blod og cerebrospinalvæske [8] – [10]. Forøgede niveauer af TGF-β1 kan inducere udvikling af induceret (i) Treg observeret i kronisk HIV-infektion [11], [12], og kan bidrage til dysfunktion af immunsystemet under sent i sygdomsforløbet. HIV-1-Tat-protein inducerer TGF-β1 i humane leukocytter [13] – [15], chondrocytter [16], og også i murine CD2

+ T-celler fra en Tat-transgen musemodel [17]. Mekanismerne i tumorinduceret og Tat-medieret TGF-β1 induktion er ukendte. Cancer og AIDS er kun to af de mange sygdomme, hvorved TGF-β1 spiller en rolle i patogenesen.

Ekspression af aktiv TGF-β1 reguleres stramt på det transskriptionelle, translationelle og posttranslationelle niveau. Selvom TGF-β1 udtryk har været fokus for intens efterforskning, vi er stadig langt fra at forstå dette cytokin komplekse regulering.

I silico

analyse af TGF-β1-promotorområdet er anført flere formodede bindingssteder for kendte transkriptionsfaktorer. Nogle af disse transkriptionsfaktorer, som Sp-1 og Zf9, har tidligere vist sig at mediere

TGF-β1

transkription, men disse faktorer alene er ikke tilstrækkeligt til at inducere mRNA-ekspression [18], [19]. undersøgte derfor vi som andre transkriptionsfaktorer inducerer TGF-β1 mRNA.

Vi fandt seks formodede bindingssteder (fem tidligere urapporteret) for de menneskelige GLI transkriptionsfaktorer ved

i silico

kortlægningen af ​​det humane

TGF-β1

promotor. Den GLI2 transskriptionsfaktoren er et af de vigtigste nedstrømseffektorer af Sonic Hedgehog (SHH) pathway, som blev vist at spille en rolle i funktionen af ​​det adaptive immunsystem [20], [21]. Den SHH vej modulerer aktivering [22], proliferation [23], [24], og cytokin regulering [25] i CD4

+ T-celler. Da flere interaktioner mellem TGF-β1 og SHH veje eksisterer (tabel 1), vi fokuseret på regulering af TGF-β1 ved SHH pathway familiemedlemmer, dvs. GLI proteiner, i immunsystemet.

Vi godtgøre, at mindst to af de seks formodede GLI-bindingssteder er nødvendige for GLI2 transkriptionel regulering af den humane

TGF-β1

promotoren. Mindst en af ​​disse to sites skal være funktionelt at observere TGF-β1 regulering af GLI2. Desuden ved at banke ned

GLI2

i human CD4

+ CD25

Hej Treg, viser vi, at GLI2 er nødvendig for TGF-β1 udtryk. Den transkriptionelle regulering af

TGF-β1

af GLI2 er endnu ikke beskrevet og øger vores forståelse af de komplekse

TGF-β1

regulering.

Materialer og metoder

Etik Statement

brugen af ​​anonyme mononukleære celler fra perifert blod at opnå T-celler og den epiteliale 293T cellelinje blev gennemgået af UCLA Institutional Review Board (IRB), som konkluderede, at denne aktivitet ikke indebar mennesker, og derfor ikke kræver IRB gennemgang eller certificering.

i Silico Screening

Screening for formodede GLI bindingssteder i den menneskelige

TGF-β1

initiativtagere blev gjort ved

i silico

analyse ved hjælp af softwareprogrammet Matlnspector (https://www.genomatix.de). En række tyve kilobaser omgiver det første menneske

TGF-β1

promotoren blev anvendt til at screene for formodede transkriptionsfaktor-bindingssites. Alle seks formodede GLI bindingssites inden den første kilobase af

TGF-β1

promotor # 1 (fem potentielle steder) eller promotor # 2 (en potentielt sted) havde en matrix lighedsscore lig med eller større end 0,8. Bindingssteder fundet inden for den første proksimale promotor-regionen er nye og er i fokus i denne undersøgelse

Luciferase Promotor Studies

Den menneskelige

TGF-p1

promoter-luciferase reporter-konstruktioner, phTG5 og phTG1, blev venligst stillet til rådighed af S.J. Kim [18]. Vildtype phTG5 konstruktion blev muteret ved putatitve GLI bindingssteder (site A, B, eller A og B) under anvendelse af site-directed mutagenese (SITE A: 5′-CAGCCCCCCCATGCC-3 ’til 5′-CAGCaaCaaaATGC-3′, SITE B: 5′-GAGCCCGCCCACGCGA-3 ’til 5′-GAGCaaGaaaACGCGA-3′, muterede baser i små bogstaver). Vildtype phTG1 konstruktion blev muteret ved formodede GLI-bindingssted E under anvendelse af site-directed mutagenese (SITE E: 5′-CCCACCACCCACGAA-3 ‘for 5’CCaAaaAaaaACGAA-3’, muterede baser i små bogstaver). Vildtype-promotoren, de muterede promotorer, eller en pGL3 tom-vektorkontrol blev individuelt cotransficeret med den konstitutive aktivator vektor pGLI2ΔN (venligst tilvejebragt af E. Roessler [26]) eller kontrol pcDNA3 med Lipofectamine 2000 under anvendelse af standardprocedurer ind 293T-celler, en human epitelcellelinje indeholdende Adeno og SV-40 virale DNA-sekvenser, opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). Den pGLI2ΔN plasmid indeholder et konstitutivt aktiv GLI2 gen skyldes en aminoterminal trunkering. Den aminoterminale domæne af den humane GLI2 genet har en undertrykkende funktion, og det er udsendelse er blevet vist at forøge transskription af nedstrøms målgener, såsom GLI1 [26]. Den 293T cellelinje blev valgt på grund af dens transfektion effektivitet og lave niveauer af GLI1 udtryk, som er vores udlæsning for GLI2 aktivering. Luciferaseekspression blev målt til 48 timer efter transfektion

Cell Isolation, Kultur, Stimulation

naive CD4

+ T-celler, der udtrykker CD4, CD31, CD45RA, og CD62L, blev oprenset og isoleret fra humane mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) under anvendelse negativ selektion. CD4

+ CD25

hi regulatoriske T-celler blev beriget fra humant blod ved hjælp RosetteSep og Robosep kits fra Stem Cell Technologies. Primære celler blev dyrket i serumfrit medium bestående af Iscoves modificerede Dulbeccos medium suppleret med delipideret BSA (Sigma-Aldrich) ved 1100 ug /ml, human transferrin (Sigma-Aldrich) ved 85,5 ug /ml, 2 mM glutamin og penicillin /streptomycin ved 25 U /25 ug /ml. Alle stimuleringsbetingelser af primære T-celler blev udført med aCD3 /αCD28-coatede M-450 perler fra Invitrogen. Celleoverfladen og intracellulære immunfænotyper blev valideret ved flowcytometri som tidligere [27] beskrevne. Til påvisning af intracellulær foxp3 blev celler først farvet for celleoverflademarkører, faste og permeabiliserede med eBioscience anbefalede puffere efter producentens anvisninger, derefter inkuberet med FITC eller eFluor 450 konjugerede monoklonale antistoffer mod foxp3 (eBioscience, klon PCH101).

siRNA Knockdown

Knockdown af

GLI2

i primære humane regulatoriske T-celler blev udført ved hjælp Accell siRNA designet og valideret af ThermoFisher /Dharmacon. En ikke-targeting siRNA blev anvendt som en negativ kontrol. En positiv kontrol siRNA for GAPDH blev anvendt til at verificere knockdown. Knockdown af GLI2 blev udført ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt og valideret siRNA fra Dharmacon (A-006.468-14 – Target sekvens – 5 ‘GGUUUGAAUCUGAAUGCUA 3’). En separat uafhængig negativ kontrol ved hjælp af en kodet

GLI2

siRNA sekvens (5’AAGGUAUGCGCUUAAUUU-3 ‘) blev anvendt til at løse off-target effekter.

GLI2

knockdown blev verificeret ved at vurdere

GLI1

mRNA-ekspression efter stimulering. GLI1 har tidligere vist sig at være transciptionally reguleret af GLI2 og er den positiv kontrol for

GLI2

knockdown.

Renset CD4

+ CD25

hiFoxP3

+ regulatoriske T-celler blev inkuberet med siRNA og serumfrit Accell medium (Dharmacon) i 72 timer før stimulering med aCD3 /αCD28 coatede perler. Fireogtyve timer efter stimulering blev celler opsamlet for at måle

TGF-p1

mRNA-niveauer ved RT-PCR. TGF-p1 niveauer var normaliseret til

18S rRNA

og sammenlignet med ikke-stimulerede celler.

RT-PCR

Taqman genekspression primer /probe sæt til

TGF-β1 , GLI1

, 18S rRNA, og

GAPDH

fra Applied Biosystems Inc. blev anvendt til måling transkripter niveauer i forskellige forhold. Udtrykket af

TGF-β1, GLI1

, og

GAPDH

blev normaliseret til 18S rRNA niveauer og relative udtryk mellem betingelser blev beregnet til at vurdere opregulering /nedregulering af transskription.

lentiviral Infektioner

GLI2ΔN

transgen blev placeret i en tredje generation HIV-1 vektor på UCLA Vector Core. Størstedelen af ​​HIV viral kodende sekvens blev fjernet og erstattet af transgenet. LTR’erne blev modificeret til at være “selv-inaktiverende”, og transkriptionen af ​​vektorgenomet i pakkecellerne var drevet af en ikke-HIV-promotoren. Virus blev fremstillet ved anvendelse af 293T celler, som var co-transficeret med vektor-plasmidet og tre andre plasmider kodende a) de virale enzymer og strukturelle proteiner, bortset Env, B) Rev, som er involveret i HIV-RNA transport, og C) VSV glycoprotein, som er en pan-tropisk kuvert, der tillader virus indtræden i næsten enhver celletype. naive CD4

+ T-celler blev inficeret med 100 ng p24 pr million celler i serum-frit medium i 96 timer. RNA blev isoleret til bestemmelse af ændringer i genekspression ved anvendelse af RT-PCR. en GFP-holdige lentivirus blev anvendt som en negativ kontrol og også til at måle infektion effektivitet.

chromatin Immunfældning (chip)

chip-analyse blev udført for at bestemme, om GLI2 binder sig til

TGF-β1

promotor. Regulatory CD4

+ CD25

hi T-celler blev negativt isoleret som beskrevet ovenfor. cellerne blev stimuleret med aCD3 /αCD28-belagte kugler natten over. Den GLI2 ExactaChIP kit (R 290 bp fragment).

Bcl2

promotor-regionen blev registreret som en positiv GLI-bindende kontrol ved anvendelse af primere fra ExactaChIP kit. En 238 bp region af

IL-10

promotor, der ikke indeholdt nogen formodede GLI2 bindingssted blev målt som en negativ kontrol (5′-TGATTTCCTGGGGAGAACAG-3 ‘og 5′-CCCACCCCCTCATTTTTACT-3’).

Der er to rapporterede initiativtagere i den menneskelige

TGF-β1

gen.

I silico

kortlægningen af ​​det humane

TGF-β1

proximale promoter områder med den Genomatix software program afslørede fem tidligere uidentificerede formodede GLI-bindingssteder (A til E) i et højt konserveret region af humane genom. Websted F i den anden promotor er tidligere blevet identificeret og undersøgt [28]. Sites A og B (der overlapper C), alle ligger inden for den luciferase-reporterkonstruktion phTG5 anvendes i promotoren mutageneseundersøgelser. Websted E er til stede i phTG1 konstruktionen. Omtrentlige basepar positioner af potentielle GLI bindingssteder vises i forhold til de to indberettede transskription start- sites for mennesket

TGF-β1

gen.

Co-Immunpræcipitation

Co-immunopreciptation blev udført for at vurdere bindingen af ​​humant GLI2 til HIV-1-Tat. Dual transfektioner blev udført i 293T-celler under anvendelse af tre forskellige sæt af plasmider: (GLI2-6xMYC + HIV-1 Tat-flag), (GLI2-6xMYC + pCDNA3 kontrol), (HIV-1 Tat-FLAG + pCDNA3 kontrol). Otteogfyrre timer efter transfektion blev cellerne lyseret, og de frigivne proteiner blev opsamlet til co-IP (Pierce Co-IP Kit fra Thermo Scientific). Agarose resin blev overtrukket med en af ​​tre antistoffer: Sigma F1804 anti-FLAG M2-antistof (til at binde Tat til vulst), CST 71D10 anti-MYC-antistof (til at binde GLI2 til vulst), eller et isotypekontrolantistof. Efter co-IP blev elueringer kørt på en SDS-PAGE-gel efterfulgt af vestlige Blotting.

Statistik

Alle analyser blev foretaget af UCLA AIDS Institute Biostatistik Core eller med GraphPad Prism 5 Software . Variabler blev udtrykt som betyder med standardfejl på middelværdien. ANOVA og to-halet Wilcoxon Rank sum test, parret når det er hensigtsmæssigt, blev anvendt til at analysere forskelle mellem populationer. En p-værdi lavere end eller lig med 0,05 blev betragtet som signifikant.

Resultater

Seks Formodede GLI Bindende steder ligger inden for menneskelige

TGF-β1

Promoters

Gennem

i silico

analyse ved hjælp Matlnspector (https://www.genomatix.de) vi fundet seks formodede GLI bindingssteder inden de to rapporterede menneskelige

TGF-β1

initiativtagere, herunder en tidligere rapporteret site inden den anden promotor [28] Ud over fem steder, som tidligere var ukendt. Både Genomatix software og UCSC genom (www.genome.ucsc.edu) programmer indikerer en høj grad af sekvenskonservering omkring

TGF-β1

promotorregion i pattedyr, som antyder den funktionelle relevans af den humane

TGF -β1

initiativtagere. Den konsensus bindende sekvens for GLI transskriptionsfaktorer er blevet identificeret som 5′-TGGGTGGTC-3 ‘[29], [30]. De seks formodede GLI bindingssteder rapporteret i denne undersøgelse har en høj grad af matrix lighed

43 og er angivet i figur 1. Den overflod af mulige GLI bindingssteder inden for de første tusinde basepar af transkriptionsstartstedet af

TGF-β1

promotor antyder, at dette proksimale promotor region kan reguleres af GLI transkriptionsfaktorer.

GLI2 Aktiverer det første menneske

TGF-β1

promotor Gennem mindst to af det formodede GLI-bindende steder i

​​det formodede GLI bindingssted i den anden TGFp-1-promotoren er blevet rapporteret at være ikke-responsiv til SHH stimulering med Eichenmuller

et al.

[28]. Imidlertid har ikke tidligere været rapporteret, de fem putative steder i den første promotor reguleres af GLI proteiner. Vi anvendte en reporterkonstruktion der indeholder de første 500 basepar af det humane TGF-β1-promotoren, som blev anbragt opstrøms for ildflue-luciferase-genet af Kim

et al.

(PhTG5) [18]. Denne ekspressionsvektor blev cotransficeret ind i 293T-celler sammen med en konstitutiv GLI aktivator konstruere pGLI2ΔN [26] eller en pcDNA3-plasmid-kontrol til vurdering GLI2-medieret regulering af promotoren for det humane TGF-β1-gen.

human

TGF-β1

promotorregion blev anbragt i en pGL3-basisk luciferase vektor. (A) De tre GLI bindingssites inden denne region (websteder A, B og C) var muteret separat eller sammen (WT = vildtype

TGF-β1

promotor phTG5, MUT-A = sted A mutation , MUT-B = sites B /C-mutationen, MUT-A /B = sites A /B /C-mutationen, pGL3 = kontrolvektor). Disse

TGF-β1

promotor: luciferase konstruktioner blev co-transficeret ind i 293T celler med den konstitutive GLI aktivator (GLI2dN) og normaliseret til den negative kontrol (pcDNA3). Den GLI aktivator inducerede en fire-dobling af luciferaseaktivitet i phTG5 over kontrollen. Mutation af begge GLI bindingssteder (phTG5AB) ophævet denne induktion (n = 10, * p = 0,0011, ** p = 0,0033). (B) Det formodede GLI-bindingssted E blev muteret i reporterplasmidet phTG1 (WT = vildtype TGF-1 promotor phTG1, MUT-E = websted E mutation, pGL3 = kontrolvektor). Den GLI aktivator inducerede en seks-dobling af luciferaseaktivitet i phTG1 over kontrollen. Mutation af GLI bindende site E faldt denne induktion næsten to gange (n = 12, *** p = 0,0025).

Efter samtidig transfektion af GLI2ΔN og phTG5 i 293T-celler, observerede vi en ca. 4 gange stigning af luciferaseekspression forhold til kontrollerne (figur 2). Som promotor regionen phTG5 indeholder tre af de seks formodede GLI bindingssteder (A, B, C) brugte vi mutagenese at mutere disse formodede GLI bindingssteder enkeltvis eller i kombination (betegnet phTG5A, phTG5B, og phTG5AB henholdsvis ). Selvom mutation af et enkelt site kun moderat reduceret luciferaseekspression, mutation af både lokaliteter reduceret reportergenekspression ned til kontrolniveauer. Disse fund indikerer, at GLI2 kan aktivere transkription ved den humane

TGF-β1

promotor og at binde til mindst et af disse sites er nødvendig for at dette kan ske. Mutation ved site E, som ligger længere opstrøms for transkriptionsstartsitet, blev gjort for at vurdere dens rolle i GLI2-induceret TGF-β1-ekspression. Vi anvendte en luciferase-reporterkonstruktion phTG1 indeholdende -1362 til +11 baser nær transskriptionsstartstedet af det humane TGF-β1-promotor [18]. Efter mutation af den mulige GLI-bindingssted, blev luciferaseekspressionen faldt cirka to gange efter cotransfektion med den konstitutive GLI2 aktivator. vil være behov for yderligere analyse for at undersøge, om formodede GLI bindende andre end sites sites A, B og E er også funktionelle.

naive humane CD4

+ T-celler blev isoleret ved negativ selektion og inficeret med en lentivirus indeholdende en GLI2ΔN aktivator konstrukt eller en GFP-kontrol. 72 timer efter infektion blev cellulært RNA opsamlet for at måle

TGF-p1

transkripter. (A) Relativ

TGF-β1

mRNA blev målt ved RT-PCR og normaliseret til 18S rRNA.

TGF-β1

mRNA blev signifikant forøget (n = 6, * p = 0,0313) i celler inficeret med GLI2ΔN sammenlignet med celler inficeret med GFP kontrol. (B) Den infektionseffektivitet blev målt til 69% ved anvendelse af en GFP udtrykkende kontrol lentivirus. (C 3D).

CD4

+ CD25

+ foxp3

+ treg blev beriget fra PBMC og derefter inkuberet i 72 timer med ikke-targeting (NT) eller

GLI2

siRNA. Cellerne blev derefter stimuleret (1 aCD3 /αCD28 bead: 1 celle) i yderligere 24 timer. RT-PCR blev anvendt til måling

TGF-p1

mRNA-niveauer. Relativ

TGF-β1

eller

GLI1

mRNA blev normaliseret til 18S rRNA. (A)

GLI2

knockdown i treg faldt betydeligt

TGF-β1

transskription (n = 7, * p = 0,0189). (B)

GLI1

mRNA blev også målt som en kontrol GLI2 reguleret gen; viser, at knockdown af

GLI2

i treg også formindsket

GLI1

mRNA (n = 5, ** p = 0,0278). (C) Sekvens af

GLI2

siRNA var krypteret (Scram) som en ekstra

GLI2

siRNA negativ kontrol og var ikke signifikant forskellig fra den ikke-targeting kontrol.

GLI2 Regulerer

TGF-β1

Transskription i primære humane CD4

+ CD25

hi treg

Selvom overekspression af transgene GLI proteiner kan modulere

TGF-β1

transkription i naive CD4

+ T-celler, ønskede vi at vurdere den fysiologiske rolle af GLI2 aktivering i primære celler, der udtrykker høje niveauer af TGF-β1. Tidligere undersøgelser har brugt siRNA til knockdown specifikke gener i primær treg [31], [32]. Knockdown af

GLI2

blev gjort ved hjælp kommercielt tilgængelig Dharmacon Accell siRNA at vurdere dets funktion i TGF-β1 transskription i primære humane treg.

GLI2

siRNA knockdown i primære humane CD4

+ CD25

hi treg stimuleret med aCD3 /αCD28 coatede perler faldt udtryk for

TGF-β1

mRNA med ca. 5 gange ( Figur 4A, p = 0,0189). For at vurdere knockdown af GLI2 aktivitet,

GLI1

mRNA-ekspression blev målt ved RT-PCR.

GLI1

gentranskription er en kendt nedstrøms mål for den aktiverede GLI2 transskription faktor. Den faldt udtryk for

GLI1

mRNA understøtter siRNA-medieret knockdown af

GLI2

(figur 4B, p = 0,0278). En separat uafhængig negativ kontrol ved hjælp af en kodet

GLI2

siRNA sekvens (5’AAGGUAUGCGCUUAAUUU-3 ‘) blev anvendt til at løse off-target effekter (figur 4C). Disse resultater indikerer, at GLI2 er vigtig i reguleringen

TGF-β1

transkription i primære humane Treg. Den ordnet treg var CD3

+ CD8

-CD4

+ CD25

hiFoxP3

+ T-celler. Renheden af ​​Treg var mere end 85% (figur 4D).

chromatin immunoprecipitation (chip) blev gjort for at vurdere bindingen af ​​GLI2 til mennesket

TGF-β1

promotoren. Primær menneske regulerende CD4

+ CD25

hi T-celler var negativt isoleret og stimuleret med aCD3 /αCD28-belagte kugler natten. PCR blev udført for at vurdere GLI2 binding. Hele DNA blev anvendt som en positiv kontrol for PCR. GLI2 bundet til

TGF-β1

promotor på ‘site E’ i den menneskelige

TGF-β1

promotor. GLI2 ikke binde sig til en ikke-targeting region i den menneskelige

IL-10

promotor (Lane 8).

GLI2 Binder til Human

TGF-β1

promoter

chromatin immunoprecipitation (chip) blev gjort for at vurdere bindingen af ​​GLI2 til mennesket

TGF-β1

promotoren. Primær menneske regulerende CD4

+ CD25

hi T-celler var negativt isoleret og stimuleret med aCD3 /αCD28-belagte kugler natten. Den stimulerede Treg blev inkuberet med agarose-perler overtrukket med αGLI2 eller αIgG kontrol antistoffer. Som vist i figur 5, GLI2 bundet til

TGF-β1

promotoren. GLI2 binding viste sig at være på ‘site E’ (figur 5) i den menneskelige

TGF-β1

promotor. GLI2 har imidlertid ikke binder til en ikke-målrettet region i det humane

IL-10

promotoren (bane 8).

Co-immunfældning blev anvendt til at teste bindingen af ​​HIV-1 Tat til menneskelig GLI2. Dual transfektioner blev udført i 293T-celler (plasmid kombinationer vist til højre) til at udtrykke Tat-FLAG og GLI2-6xMYC proteiner (pcDNA3 = tom kontrol vektor). (A) Perler blev coatet med anti-FLAG-antistof og inkuberet med cellelysater fra transfektioner # 1-3 vist på højre side. Efter vask og elueringstrin blev det bundne protein kørt på en SDS-PAGE-gel efterfulgt af Western blotting for at bedømme GLI2 binding. Anti-myc antistof blev anvendt til at bekræfte binding af GLI2 til Tat når Tat var bundet til perlen. (B) Perler blev overtrukket med anti-myc-antistof og inkuberet med cellelysater fra transfektioner # 1-3 vist på højre side. Efter vask og elueringstrin blev det bundne protein kørt på en SDS-PAGE-gel og Western Blotting blev udført for at lede efter HIV-1-Tat-binding. Bands udviklet ved ca. 27 kDa. Anti-flag antistof blev anvendt til at bekræfte binding af Tat til GLI2 når GLI2 var bundet til perlen.

HIV-1 Tat binder til GLI2

Øget plasma og cerebrospinalvæske ( CSF) niveauer af immunosuppressive cytokiner såsom TGF-β1 påvises under HIV-1 sygdomsprogression [8] – [10] fører til en stigning i iTreg [11], [12]. HIV-1 transaktivator og viralt protein Tat er blevet impliceret som induceren af ​​TGF-β1 i både

in vitro

samt

in vivo

modeller [13] – [17]. Selv om Tat har vist sig at øge TGF-β1, den underliggende transkriptionel mekanisme er endnu ikke klart defineret.

Da vi fandt, at GLI2 regulerer TGF-β1 på det transskriptionelle niveau, testede vi, om HIV-1-Tat binder til menneskelig GLI2 og kan dermed øge eller stabilisere TGF-β1 transskription hjælp co-immunopreciptation (co-IP) for at vurdere bindingen af ​​menneskelig GLI2 til HIV-1 Tat. Dual transfektioner blev udført i 293T-celler med tre forskellige sæt af plasmider: (GLI2-6xMYC + HIV-1 Tat-FLAG), (GLI2-6xMYC + pCDNA3 kontrol), (HIV-1 Tat-FLAG + pCDNA3 kontrol). Otteogfyrre timer efter transfektion blev cellerne lyseret, og de frigivne proteiner blev opsamlet til co-IP (Pierce Co-IP Kit fra Thermo Scientific). Agarose resin blev overtrukket med en af ​​tre antistoffer: Sigma F1804 anti-FLAG M2-antistof (til at binde Tat til vulst), CST 71D10 anti-MYC-antistof (til at binde GLI2 til vulst), eller et isotypekontrolantistof. Efter co-IP blev elueringer kørt på en SDS-PAGE-gel efterfulgt af Western blotting. Som vist i figur 6, HIV-1 Tat bundet specifikt til GLI2 der var bundet til en perle. Den omvendte reaktion viste også specificitet, hvilket indikerer, at disse to proteiner faktisk kan interagere. Bindingen af ​​HIV-1 Tat til GLI2 antyder en potentiel mekanisme for TGF-β1 induktion i HIV-1-infektion. Yderligere forsøg skal gøres for at teste den funktionelle synergi af HIV-1 Tat og GLI2 at påvirke transkription ved TGF-β1-promotoren.

Discussion

Vores resultater viser, at transkriptionsfaktoren GLI2 spiller en hidtil ukendt, men vigtig rolle i den komplekse transskriptionelle regulering af

TGF-β1.

Gennem

in silico

screeningsanalyse vi afslørede seks potentielle GLI-bindingssteder i det humane TGF-β1-promotoren , hvoraf fem var hidtil ukendte. Brug mutationsanalyse af den menneskelige

TGF-β1

promotor, fandt vi, at GLI2 forbedrer

TGF-β1

transskription i mindst tre af de fem formodede GLI-bindingssteder (steder A, B,

7

alle har GLI-responsive elementer i deres promotorer [37] – [39]. Lin

et al.

Fundet en SHH-reagerende element i 5′-opstrøms-promotorområdet af

TGF-β2

[40].