PLoS ONE: Målrettet Sletning af metastaser-Associated fosfatase Ptp4a3 (PRL-3) Undertrykker Murine Colon Cancer

Abstrakt

Ptp4a3

(almindeligvis kendt som PRL-3) er en gådefuld medlem af

Ptp4a

familie af prenylerede protein tyrosinphosphataser der er stærkt til udtryk på mange menneskelige kræftformer. Trods stærke korrelationer med tumor metastase og dårlig patient prognose, der er meget begrænset forståelse af dette gen familiens rolle i malignitet. Derfor skabte vi et gen-målrettet murine knockout model for

Ptp4a3

, den mest undersøgte

Ptp4a

familiemedlem. Mus mangelfuld for

Ptp4a3

var groft normal. Færre homozygote-null hanner blev observeret ved fravænning, men, og de opretholdt en nedsat kropsmasse. Selvom

Ptp4a3

normalt forbundet med sen-fase kræft og metastaser, vi observerede øget

Ptp4a3

udtryk i tyktarmen af ​​vildtype mus umiddelbart efter behandling med det kræftfremkaldende stof azoxymethan. For at undersøge den rolle,

Ptp4a3

i malignitet, vi brugte det mest almindeligt undersøgte murine colitis-associeret tyktarmskræft model. Vildtypemus behandlet med azoxymethan og dextrannatriumsulfat udviklet ca. 7-10 tumorer per mus i den distale colon. Den resulterende tumorvæv havde 4 gange mere

Ptp4a3

mRNA i forhold til normal colon epitel og øget PTP4A3 protein.

Ptp4a3-

null mus udviklede 50% færre kolon tumorer end vildtype mus efter udsættelse for azoxymethan og dextran natriumsulfat. Tumorer fra

Ptp4a3

-null mus havde forhøjede niveauer af både IGF1Rβ og c-myc forhold til tumorer fyldt med

Ptp4a3,

antyder en forbedret celle signalvejen engagement i fravær af fosfatase. Disse resultater giver det første endegyldige bevis implicerer

Ptp4a3

i tyktarmen tumorigenese og fremhæve den potentielle værdi af phosphatase som et terapeutisk mål for tidligt ondartet sygdom

Henvisning:. Zimmerman MW, Homanics GE, Lazo JS (2013) Målrettet Sletning af metastaser-associerede Phosphatase

Ptp4a3

(PRL-3) Undertrykker Murine tyktarmskræft. PLoS ONE 8 (3): e58300. doi: 10,1371 /journal.pone.0058300

Redaktør: Manlio Vinciguerra, University College London, England

Modtaget: November 22, 2012; Accepteret: 1. februar, 2013; Udgivet: 28 Mar 2013

Copyright: © 2013 Zimmerman et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Det var finansieret af National Institutes of Health tilskud AA10422 og fællesskab F31AA019597A. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

proteintyrosinphosphatase-4a3 (

Ptp4a3

), sammen med

Ptp4a1

og

Ptp4a2

, omfatter 4a-familien af ​​protein tyrosinphosphataser. Dette beskedne genfamilien almindeligvis benævnt phosphataser af regenererende lever (PRL), på grund af opdagelsen af ​​

Ptp4a1

i regenererende levercellerne hos mus efter partiel hepatektomi [1]. Den signifikant homologi ( 75% aminosyreidentitet) findes blandt

Ptp4a

familiemedlemmer kan betegne lignende enzymologi men alle tre familiemedlemmer er bevaret i hele pattedyrarter, hvilket antyder ikke-redundante biologiske roller for hver.

in vivo

egenskaber og funktioner af disse gådefulde fosfataser fortsat bemærkelsesværdigt dårligt forstået.

Interessen for

Ptp4a3

kan tilskrives dens betydeligt potentiale som biomarkør og som en terapeutisk målet for maligne cancere. Mange humane cancere udtrykker høje PTP4A3 niveauer, herunder tumorer i colon [2], bryst [3], ovarie [4], lever [5], mave [6], og stroma [7], og forhøjede PTP4A3 ekspression ofte korrelerer med øget tumorindtrængen og dårlig prognose [8]. Derudover ektopisk PTP4A3 overekspression øger tumorcellemigration og invasion

in vitro

[9]. Mens mangler endegyldige beviser,

Ptp4a3

er blevet foreslået at modulere flere signalveje involverer SRC [10], Rho GTPaser [9], og PI3K-Akt [11] i forskellige former for kræft. Kompleksiteten af ​​pathway ændringer ses, når

Ptp4a3

er overudtrykt kan også afspejle dens evne til at fungere som en phosphatidylinositol 5-phosphatase [12]. Ingen rapporter har endegyldigt vist en rolle for

Ptp4a3

i fysiologi normale celler eller væv.

azoxymethan (AOM) er en procarcinogen at når metaboliseres i tyktarmen er mutagene og driver tumorigenese. AOM i kombination med det inflammatoriske middel dextran natriumsulfat (DSS) frembringer et udbredt murin model, der trofast replikerer kolon maligniteter drevet af kroniske inflammatoriske tilstande, såsom ulcerativ colitis [13]. Adskillige signalveje er impliceret i patogenesen af ​​AOM-induceret coloncancer herunder KRAS [14], β-Catenin [15], c-MYC [16], Insulin-like Growth Factor-1 Receptor β (IGF1Rβ) [17], og transformerende vækstfaktor β (TGFp) [18]. Interessant,

Ptp4a3

er blevet identificeret som en direkte regulerende mål for TGF signalering i tyktarmskræft [19].

I den aktuelle undersøgelse, brugte vi et gen-targeting tilgang til at generere mus mangler

Ptp4a3

afhøre den potentielle rolle

Ptp4a3

i tyktarmen tumorigenese. AOM eksponering akut forøget

Ptp4a3

udtryk i tyktarmen.

Ptp4a3

-null mus var resistente overfor colon tumorigenesis implicerer dette gen i patogenesen af ​​malign sygdom. Desuden tumorer stammer fra

Ptp4a3

-null mus overexpresssed kræft forbundet IGF1Rβ og c-myc tyder inddragelse af disse onkogene signalveje.

Resultater

Oprettelse af Ptp4a3 mutant mus

Vi forstyrret

Ptp4a3

genomisk locus ved hjælp af Cre-lox system stedsspecifik rekombination baseret på positionen af ​​to indsatte loxP sites (fig. 1A og yderligere detaljer i fig. S1) . Mutante mus blev tilbagekrydset til C57BL /6J-stammen i mindst fem generationer. Den knockout allelen blev skabt ved at krydse

Ptp4a3-

floxede mus med transgene mus, der udtrykker CRE-rekombinase drevet fra en generel promotor (EIIA) at rekombinere målområdet og skabe globale knockout-mus [20]. Insertion af 3’loxP ødelagt en endogen Hindlll-sted øge størrelsen af ​​det genomiske DNA-fragment fremstillet ved restriktionsspaltning fra 5,6 til 10,2 kb. Efterfølgende deletion af målsekvensen reduceret restriktionsfragmentet størrelse fra 10,2 til 6,4 kb. Tydelige band størrelser svarende til hver allel er observeret, når analyseres ved Southern blot hybridisering med en ~300 bp probe svarende til exon 6 (fig. 1B).

A)

Ptp4a3

floxede allel var skabt ved indsættelse loxP-steder (røde pilespidser) omkring exon 2. Denne mutation resulterede i afbrydelse af et HindIII sekvens, der øger størrelsen af ​​DNA-fragmentet produceret ved restriktionsspaltning fra 5,6 til 10,2 kb. Efter ekspression af Cre-rekombinase sekvensen mellem loxP-steder fjernes efterladende en enkelt loxP-sted og mindske størrelsen af ​​restriktionsfragmentet til 6,4 kb. Denne mutation resulterer i deletion af initieringskodonet forårsager et rammeskift mutation fremstilling af et ikke-funktionelt proteinprodukt. B) Southern blot-analyse af genomisk DNA blev anvendt til at overvåge disse genetiske ændringer og genotype mus indeholdende vildtypen, floxet, eller knockout alleler. Hver bane er fra en individuel mus. C) Kvantitativ RT-PCR-analyse på total mRNA fra føtal hjerte væv viste ingen ændringer i

Ptp4a1

og

Ptp4a2

mRNA-niveauer, mens

Ptp4a3

blev reduceret og ikke påviselige i heterozygot og homozygot-nul væv hhv. (* = P 0,05; n = 4 /genotype). D) Det PTP4A3 protein produkt var påvises ved western blot i hele proteinlysater fra vildtype og heterozygot føtale hjerte væv, men ikke i homozygot

Ptp4a3-

null prøver.

En analyse af 500 unger, som blev produceret af heterozygote parring par angivet alle potentielle genotyper blev observeret i den resulterende afkom. Mens kvinder blev observeret ved den forventede Mendelsk nøgletal, bemærkede vi et signifikant fald (p 0,05) i antallet af

Ptp4a3

-null hanner ved fravænning i forhold til den forventede frekvens (tabel 1). I betragtning af denne konklusion, er det muligt, at knockout hanner enten besad en overlevelse ulempe eller at

Ptp4a3

-null kønsceller havde en fordom fænotype.

Ptp4a3

-null hanmus udviste en omtrentlig 10% reduktion i kropsmasse (p 0,003) og 7% fald i BMI (p 0,004) sammenlignet med vildtype-kuld på 6 wk alder (Fig. S2). Denne fænotype syntes også at være begrænset til hanmus som kvindelig

Ptp4a3

-null mus ikke udviser et signifikant fald i kropsmasse eller body mass index.

Fordi føtalt hjerte væv havde tidligere blevet foreslået at have et højt niveau af

Ptp4a3

udtryk [21], vi næste udført kvantitativ RT-PCR på total RNA-prøver fra føtale hjerte væv (E19.5) at bestemme den relative mRNA-niveauer af

Ptp4a1

,

Ptp4a2

og

Ptp4a3.

Mens

Ptp4a1

og

Ptp4a2

niveauer forblev ens mellem genotyper,

Ptp4a3

mRNA blev reduceret i heterozygot væv og ikke påvises i prøver fra

Ptp4a3

-null føtalt hjerte væv (fig. 1C). Således kompensation for

Ptp4a3

tab ved opregulering af enten familiemedlemmer

Ptp4a1

eller

Ptp4a2 dele på mRNA niveau blev udelukket. Proteinlysater fra føtalt hjertevæv blev analyseret ved Western blot for tilstedeværelse af PTP4A3 proteinprodukt. Mens påviselig i prøver fra vildtype embryoner, PTP4A3 var lavere i lysater fra heterozygote embryoner og homozygot-nul væv indeholdt ingen detekterbar PTP4A3 (fig. 1D). Bortset fra de førnævnte fænotypiske observationer, mus uden funktionelle

Ptp4a3

optrådte groft normal i forhold til vildtype søskende.

Expression og knockout af Ptp4a3 i muse væv

Fordi ekspressionen af ​​endogene PTP4A3 protein i normale væv er ikke blevet godt karakteriseret, vi undersøgte væv protein prøver fra vildtype og

Ptp4a3

-null mus. Først, vi analyseret adskillige vævstyper for PTP4A3 proteinekspression ved Western blot (Fig. S3). Fosterhjerte, føtal tarm, voksen hjerte, skeletmuskel, pancreas, lunge, milt, hjerne, thymus, colon og tyndtarmen alle udtrykt detekterbare niveauer af PTP4A3 i modsætning til lever og nyrer, som ikke havde nogen påviselig PTP4A3 protein. Disse resultater bekræfter også effekten af ​​den globale gendeletion tilgang, da ingen PTP4A3 protein kunne påvises i nogen af ​​lysater fra

Ptp4a3

-null mus. Histologisk analyse blev også udført på vildtype og

Ptp4a3

-null vævsprøver (fig. S4). Ved at undersøge flere vævstyper, blev der ikke åbenlyse abnormiteter observeret, og alle prøver viste sig kvalitativt normal.

Ptp4a3 ekspression øges umiddelbart efter AOM eksponering

Da lave niveauer af PTP4A3 var påviselige i den normale colon epitel, vi analyseret

Ptp4a3

genekspression umiddelbart efter behandling med intestinal procarcinogen AOM (12,5 mg /kg) eller saltvand kontrol i vildtype C57BL /6J mus. Mus blev aflivet 8 og 24 timer efter AOM injektion og kolonepitelceller blev opsamlet til analyse. Totalt mRNA blev isoleret og kvantitativ RT-PCR blev udført til analyse for

Ptp4a3

genekspressionsniveauer. Interessant,

Ptp4a3

blev opreguleret med 78% ved 8 timer og 60% ved 24 timer i AOM-behandlede normale epitel i forhold til at styre (Fig. 2C). Proteinlysater fra AOM behandlede mus tyder på, at PTP4A3 proteinniveauer også øges i disse væv (fig. 2D). Mens rolle

Ptp4a3

i tyktarmskræft er traditionelt menes at involvere sene tumorer og metastaser, dette fund tyder på en potentiel rolle i den tidlige fase sygdom og tumorigenese.

A) AOM -DSS behandling paradigme anvendt i denne undersøgelse har en enkelt dosis af AOM efterfulgt af 3 behandlingscykler med DSS i drikkevandet. B) Histologisk repræsentation af normal colon væv i forhold til tumorvæv demonstrerer effektiviteten af ​​AOM-DSS-model. Efter en cyklus af DSS behandling, krypt dysplasi og mononukleær celleinfiltration var synlige. Tumorvæv var til stede på både 12 og 16 wk endepunkter. Før aflivning blev musene behandlet med BrdU i 4 timer og celleproliferation blev visualiseret ved farvning med et BrdU antistof. C) Kvantitativ RT-PCR blev anvendt til at analysere

Ptp4a3

genekspression i normal colon epitelvæv efter behandling med enten AOM eller saltvand kontrol.

Ptp4a3

blev forhøjet 73% i colon væv efter målt 8 timer efter injektion og 60% ved 24 timer (* = p 0,001; n = 6 /behandlingsgruppe, barer = SEM). D) Western blot af kolon lysater angivet en stigning i PTP4A3 protein efter AOM eksponering. E) Kvantitativ RT-PCR indikerede ændringer i genekspression niveauer af

Ptp4a

familiemedlemmer i normal colon og tumorvæv.

Ptp4a3

blev forhøjet 3,7 gange (** = p 0,01), mens

Ptp4a1

og

Ptp4a2

niveauer blev signifikant reduceret (* = p 0,0001 og p 0,05, henholdsvis) (n = 15, barer = SEM). F) Western blot-analyse, der viste højere PTP4A3 proteinniveauer i colontumorer sammenlignet med normalt væv. G) Western blot kombineret med QRT-PCR-analyse viste også, at når man sammenligner

Ptp4a3

mRNA-niveauer (anført ovenfor hver bane) til PTP4A3 proteinindhold, højt genekspression syntes at svare til højere protein niveauer.

Knockout af Ptp4a3 undertrykker tarm tumordannelse

at udforske en potentiel funktionel rolle for

Ptp4a3

i tumor dannelse, vi udsættes mus til en udbredt AOM-DSS modellen for colitis-associerede tyktarmskræft. Vildtype og

Ptp4a3

– null mus blev injiceret med en enkelt dosis af AOM (12,5 mg /kg) efterfulgt af tre cyklusser af 2,5% DSS forbrug (figur 2A.). Denne model frembringer tydelige histologiske ændringer i forhold til normale kontroller, herunder inflammation svarende til DSS behandling, og efterfølgende dysplasi (fig. 2B). Tumorer var visuelt indlysende i den distale colon af vildtypemus ved aflivning 12 eller 16 wk efter den indledende AOM behandling og var (fig. 2B og 3A). Som angivet i figur 3B,

Ptp4a3

-null mus udviser et fald på 54% i tumor nummer (p 0,004) efter 16 uger af behandlingen. Selv i gennemsnit færre tumorer blev observeret ved 12 uger i

Ptp4a3

-null mus i forhold til vildtype, dette var ikke statistisk signifikant (p 0,2). Interessant, at antallet af tumorer (p = 0,05) samt tumor diameter (P 0,001) var signifikant forøget den 12.-16 uger, mens

Ptp4a3

-null tumorer ikke signifikant stigning i antallet eller størrelsen. Den gennemsnitlige diameter af tumorer fremstillet ved denne model var 3-4 mm (fig. 3C).

A) Billede af, fremkomsten af ​​vildtype og

Ptp4a3

-null kolon væv efter 16 wk behandling med AOM-DSS. B) Det gennemsnitlige antal af tumorer blev indspillet i mus ved genotype efter 12 og 16 uger af behandlingen. Det gennemsnitlige antal af tumorer steget betydeligt i vildtypemus mellem 12 til 16 wk tidspunkter (* = p = 0,05). I denne periode antallet af tumorer observeret i

Ptp4a3

-null mus var den samme (p = 0,70). Ved 12 wks, vildtype mus (n = 6) ikke havde signifikant flere tumorer per mus end

Ptp4a3

-null (n = 5) mus (p = 0,27). Ved 16 wk, vildtypemus (n = 14) viste signifikant færre tumorer per mus end

Ptp4a3

-null mus (n = 7) (** = p 0,005). C) Tumor size (målt ved gennemsnitlig tumordiameter for hver mus) blev bestemt på hvert tidspunkt. Tumor diameter blev observeret signifikant stigning i vildtype-mus fra 12 til 16 wks (* = p 0,001). Ingen signifikant forskel blev observeret i

Ptp4a3

-null mus fra 12 til 16 wks, eller mellem genotyper ved hver tidspunkt. Bars = SEM.

Ptp4a3 er forhøjet i AOM-afledte kolon tumorer

Da høj ekspression af PTP4A3 er blevet rapporteret i humane primære kolon tumorer [22] undersøgte vi

Ptp4a3

ekspression i musemodellen for tyktarmskræft. Først blev totalt mRNA ekstraheret fra tumorvæv fra vildtypemus og kvantitativ RT-PCR blev anvendt til assay for ekspressionsniveauet af hver

Ptp4a

familiemedlem (fig. 2E). I forhold til normal colon epitel,

Ptp4a3

blev forhøjet 3,7 gange i gennemsnit (p 0,01). Mens betydelig heterogenitet i

blev observeret Ptp4a3

udtryk, der spænder fra 1,4 til 6,7 gange opregulering,

Ptp4a3

mRNA-niveauer i tumorvæv var konsekvent højere end normalt væv for hver prøve testet (n = 15 ). Interessant, genekspressionsniveauer af

Ptp4a1

og

Ptp4a2

var begge nedreguleret 64% og 36% (p 0,0001 og p 0,05), henholdsvis i colontumorer i forhold til normalt væv. PTP4A3 proteinniveauer i normale colonepitelceller lysater var meget lav, når analyseret ved Western blotting (fig. 2F). I modsætning hertil PTP4A3 var let påviselig, men variabel i colon tumor prøver. Som det kunne forventes, at der syntes at være en vis sammenhæng mellem PTP4A3 proteinniveauer og mRNA-niveauer (fig. 2G). Manglen på funktionelle antistoffer til PTP4A1 og PTP4A2 udelukkede evaluere tumor protein niveauer for disse familiemedlemmer.

Tab af Ptp4a3 øger IGF1Rβ og c-myc-ekspression i tumorer

Vi næste undersøgt lysater opnået fra både vildtype og

Ptp4a3

-null kolon tumorer. Vi brugte første omvendt fase protein array til analyse niveauerne af over 130 forskellige proteinprodukter, der er indeholdt i vildtype og

Ptp4a3

-null tumorer (fig. S5). Mens protein niveauer i disse tumorer udstillet betydelig heterogenitet, to kendte onkogene signalproteiner, den receptortyrosinkinase-IFG1Rβ og transskription faktor c-myc blev udtrykt ved højere niveauer i

Ptp4a3

-null tumorer (fig. 4A). Efter kvantificering, IGF1Rβ protein var i gennemsnit 2,1 gange højere (p 0,001) og c-myc blev omkring 2,5 gange højere (p 0,02) i

Ptp4a3

-null forhold til vildtype tyktarmstumorer (fig. 4B-C). I modsætning hertil har vi ikke observere en signifikant forskel i AKT aktivering mellem genotyper (Fig. 4D). Dette resultat tyder på, at tumorer potentielt kan kompensere for

Ptp4a3

mangel selvom ændrede signalveje.

A) Cluster prøve af Heatmap genereret fra RPPA analyse, der blev udført ved hjælp af kolon tumorlysater fra AOM-DSS behandlede vildtype og

Ptp4a3

-null mus. Proteinmål var enten højere (gul), lavere (blå), eller uændret (sort). B) Protein niveauer blev bekræftet ved Western blot analyse kolon tumorlysater fra vildtype og

Ptp4a3

-null mus. IGF1Rβ og c-MYC protein, blev valgt på grund af de syntes at være de mest konsekvent opreguleres proteiner i

Ptp4a3

-null prøver. C) Når kvantificeret, IGFIRβ protein niveauer var 2,1 gange højere i

Ptp4a3

-null tumorer (p 0,001). D) c-myc protein niveauer var 2,5 gange højere i

Ptp4a3

-null tumorer (p 0,02). E) Niveauerne af aktiverede AKT, som indikeret ved phosphorylering af Ser473, var ikke signifikant forskellige ved genotype i forhold til den samlede AKT protein.

Diskussion

En række gener er blevet impliceret i udviklingen og progressionen af ​​kolorektal cancer. Forrige genekspressionsprofilering studier identificeret 144 gener, der opreguleres i metastatiske kolorektale leverprøver [2]. Det eneste gen dog, at konsekvent forhøjet i alle de metastatiske prøver var

Ptp4a3

. Både genamplifikation og forøget transskriptionel aktivitet sandsynligvis kausale for de høje niveauer. Trods den tilsyneladende betydning

Ptp4a3

i tumor biologi, vores forståelse af funktionaliteten af ​​

Ptp4a3

er solidarisk begrænset skyldes til dels mangel af informative dyremodeller. Genet målrettet musemodel for afbrydelse af

Ptp4a3

genomisk locus, som vi har udviklet er nyttig, ikke kun for at studere de fænotypiske forandringer, der sker med den globale tab af fosfatase, men også for fremtidige undersøgelser af væv og tidsmæssige specifik gendeletion og kollaborative interaktioner med andre gener, herunder de to andre medlemmer af

Ptp4a

familie. Vores model fastslår, at mus kan overleve i fravær af en funktionel

Ptp4a3

gen, selv om der var et lidt lavere antal hanmus produceret, og de er i stand til at leve til udløb under normale forhold uden større sundhedsmæssige mangler . Dette er i modsætning til hvad der er blevet rapporteret med mus der mangler den meget homologe

Ptp4a2,

som menes at være den mest allestedsnærværende udtrykte familiemedlem under normale forhold.

Ptp4a2

-null mus udstillet defekt placenta udvikling og begge køn viste retarderet vækst på embryonale og voksne stadier [23].

Ptp4a2

tab nedsætter spongiotrophoblast og decidua lag af moderkagen forringer næringsstof transport og forårsager embryonale væksthæmning. Desuden tab af

Ptp4a2

resultater i AKT inaktivering, hvilket ikke var tydeligt i vores data vedrørende

Ptp4a3

tab. Kollektivt forskellene i de to gendeletion modeller er i overensstemmelse med ikke-overlappende funktioner af disse to nære phosphatase familiemedlemmer.

Deletion af PTP4A3 protein blev bekræftet ved Western blot-analyse under anvendelse af en række forskellige væv lysater fra vildtype og

Ptp4a3

-null mus. Selvom indledende undersøgelser havde foreslået

Ptp4a3

udtryk var begrænset til hjerte, skeletmuskulatur og bugspytkirtel [24], viste vores data en mere allestedsnærværende udtryk mønster. Mens der sås de højeste niveauer af PTP4A3 i føtalt hjerte, proteinet var også detekterbar ved lavere niveauer i voksent hjerte, skeletmuskel, milt, pancreas, hjerne, lunge, thymus, colon og tyndtarmen; ingen PTP4A3 protein kunne påvises i lever eller nyrer.

Da humant PTP4A3 er blevet impliceret i patogenesen af ​​human metastatisk kolorektal cancer, undersøgte vi virkningerne af

Ptp4a3

deletion i en musemodel for colon kræft. Behandling med AOM /DSS er en af ​​de mest populære colontumor musemodeller og C57BL /6J-stammen, som denne model blev tilbagekrydses er særligt modtagelige for colitis-associeret cancer [13], [16], [17].

Ptp4a3

traditionelt klassificeret som et gen forbundet med metastaser og ikke kendt for at være involveret i de tidlige stadier af kræft progression. I den aktuelle undersøgelse, giver vi beviser for, at

Ptp4a3

mRNA og PTP4A3 protein-niveauer øges hurtigt efter udsættelse for AOM, den initierende skridt i vores tyktarmskræft model. Dette er vigtigt tegn på, at PTP4A3 kunne også involveret i præneoplastiske stadium af malignitet.

Mus underkastes AOM /DSS model konsekvent udviklede tumorer i det distale område af tyktarmen. Disse primære tumorer vises konsekvent højere niveauer af

Ptp4a3

forhold til normal colon epitel – svarende til det, der ses hos patienter humane coloncancer [22]. Især mus mangelfulde for

Ptp4a3

havde 50% reduktion i tumor dannelse giver yderligere beviser for, at

Ptp4a3

er en central formidler af tyktarmskræft progression. Ikke desto mindre er den fuldstændige mangel på PTP4A3 fosfatase var utilstrækkelig til at afskaffe kolon tumorigenese, hvilket tyder på, at en delmængde af tumorer ikke kan kræve

Ptp4a3

som drivkraft for sygdommen. Dette understøttes af den konstatering, at ikke alle tumorer i denne model havde høj. ( 2 gange opregulering)

Ptp4a3

ekspressionsniveauerne

dyremodel, vi har udviklet en enestående mulighed for at fat på rollen som

Ptp4a3

i tumor biologi. AOM eksponering forårsager DNA-skader og genotoksisk stress. En fremtrædende respons på DNA-skade er induktion af

p53

, som kan fremkalde

Ptp4a3

udtryk [25], og kan give en forklaring på induktion af

Ptp4a3

i tyktarmen af AOM-behandlede mus. Derudover

Ptp4a3

er blevet identificeret som en direkte regulerende mål for TGF signalering i tyktarmen kræftceller. Den aktive TGFp signal inducerer SMAD3 /4-binding til

Ptp4a3

genomiske locus og dermed inhibering af gentranskription [19]. Tab af TGFp er en hyppigt observeret fænomen i human coloncancer [26], samt AOM musemodel for tyktarmskræft [18]. Det er sandsynligt, at denne begivenhed bidrager til forhøjet

Ptp4a3

genekspression i kræft gennem SMAD3 /4 inaktivering. Interessant, en musemodel mangelfuld for

Smad3

er blevet rapporteret spontant udvikle tyktarmskræft [27], og

Smad4

mangel i høj grad forværrer en musemodel for tyktarmskræft [28]. Dannelsen af ​​neoplastiske læsioner i

Ptp4a3

-null mus kan være en følge af indgrebet af yderligere vækstfaktor signalveje eller onkogener, såsom IFG1Rβ og c-myc. c-myc er kendt for at blive forhøjet i tumorer efter AOM /DSS behandling, og både IFG1Rβ og c-myc blev markant forhøjet i

Ptp4a3

-null tumorer i forhold til vildtype afledte tumorer.

Mens

Ptp4a3

gen produkt oprindeligt blev anset for at være involveret i tumormetastaser og sene stadie sygdom, vores resultater bevis for mulige roller på andre stadier af sygdommen, herunder pre-neoplastisk transformation og tidlig carcinogenese. Begrebet terapeutisk målretning

Ptp4a3

kunne derfor være attraktiv på flere stadier af kræft.

Materialer og metoder

Oprettelse af

Ptp4a3

mutant mus

Den betingede gen-targeting vektor blev konstrueret ved hjælp af en fag-baseret

E. coli

rekombination-systemet [29]. Specifikke detaljer vedrørende vektor konstruktion og målretningsstrategi er beskrevet i fig. S1. Vi specifikt målrettet exon 2, fordi den indeholdt det transkriptionelle startsted og var nødvendig for korrekt translation af mRNA-transkriptet. Efter transfektion af konstruktionen i R1 embryonale stamceller [30], blev mus oprettet fra korrekt målrettede kloner under anvendelse af standard kimære dyr produktionsteknikker med C57BL /6J blastocyster. Den nye stamme blev tilbagekrydset til C57BL /6J (The Jackson Laboratory) for 5 generationer og mus til forsøg blev produceret ved hjælp af heterozygote ynglepar. Genotypebestemmelse blev udført ved Southern blot-analyse med et radioaktivt mærket probe svarende til ~300 bp i exon 6, hvilket var uden for gen-targeting vektor. Denne undersøgelse blev gennemført i overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Alle relevante protokoller blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of Pittsburgh.

AOM kræft model

Vildtype og

Ptp4a3

-null mus (mandlig, 6 -8 wks) blev administreret en enkelt dosis af AOM (12,5 mg /kg) (Sigma) i sterilt saltvand ved IP injektion. DSS-opløsning (2,5%) (MP Biomedicals) blev givet

ad libitum

for 7 d efterfulgt af 14 d af den normale drikkevand og denne cyklus blev gentaget i alt 3 gange [13]. Eksperimentelle mus blev aflivet ved 12 eller 16 uger efter indledningen af ​​behandlingen, på hvilket tidspunkt kolon væv blev isoleret, skyllet og åbnede på langs til analyse. Tumor og normalt væv blev enten lynfrosset i flydende nitrogen eller nedsænket i 10% neutral pufret formalin. For hver mus blev individuelle tumorer talt og målt med en digital skydelære og gennemsnitlig tumor tæller og diameter blev bestemt for hver genotype.

Western blot-analyse

Celler og væv blev lyseret ved hjælp RIPA buffer og kvantificeret ved Bradford-assay. En total protein prøve af 40 ug blev separeret under anvendelse af Novex SDS-PAGE-reagenser (Invitrogen) og overført til nitrocellulosemembraner. Membraner blev blokeret i Odyssey puffer (LiCor Biosciences) og inkuberet med primære antistoffer natten over efterfulgt af sekundære fluorescerende antistoffer ifølge producentens anvisninger. Vi brugte følgende kommercielt tilgængelige primære antistoffer: PTP4A3 klon 318 (Santa Cruz Biotechnology), GAPDH, IGF1Rβ, c-myc, p-AKT (S473), og AKT (Cell Signaling Technology)

Kvantitativ RT. PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra væv ved anvendelse af Trizol-reagens som pr fabrikantens protokol (Invitrogen). I alt 500 ng mRNA blev omdannet til cDNA under anvendelse af iScript første streng syntese kit (Bio-Rad). Primerne (Tab. S1), der anvendes til målamplifikation blev fortyndet til en slutkoncentration på 500 pM, og real-time monitorering af PCR-reaktionen blev udført på en Biorad iQ5 thermocycler med 2X Sybr Green Mastermix (Bio-Rad). Følgende program blev kørt i 40 cykler: 95 ° C i 0:30; 58 ° C i 1:00; og 72 ° C i 0:30.

Omvendt fase protein-array

Proteinlysater (100 ug hver) fra kolon tumor prøver (n = 5 /genotype) blev denatureret og sendes frossen til MD Anderson Cancer center (Houston, TX) til analyse. Kort fortalt lysater var dobbelt-seriel fortyndet i 5 fortyndinger og ordnet på nitrocellulose-coatede objektglas, probet med antistoffer og visualiseret ved diaminobenzidin kolorimetrisk reaktion. Relative protein niveauer for hver prøve blev bestemt ved interpolation af hver fortynding kurver fra standardkurven antistof dias. Alle datapunkter blev normaliseret til protein lastning og transformeret til lineær værdi. Lineære værdier blev omdannet til log2 værdi og derefter median-centreret for hierarkisk klyngeanalyse. Den Heatmap blev genereret i Cluster 3.0 som en hierarkisk klynge hjælp Pearson Korrelation og et center metrisk (yderligere oplysninger findes, er Fig. S5).

Statistik

Statistisk analyse af afkom genotype blev beregnet ved Chi-squared test sammenligne observerede og forventede resultater. Data fra cellulære assays, western blot, og QRT-PCR kvantificering blev analyseret under anvendelse af 2-halet t-test. I begge tilfælde blev signifikans defineret som p ≤ 0,05.

Støtte oplysninger

figur S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0058300.s001

(PDF)

Figur S2.

doi: 10,1371 /journal.pone.0058300.s002

(PDF)

Figur S3.

doi: 10,1371 /journal.pone.0058300.s003

(PDF)

Figur S4.

doi: 10,1371 /journal.pone.0058300.s004

(PDF)

Figur S5.

doi: 10,1371 /journal.pone.0058300.s005

(PDF)

tabel S1.

doi:. 10,1371 /journal.pone.0058300.s006

(PDF)

Tak

Forfatterne vil gerne takke Carolyn Ferguson for hendes tekniske ekspertise og bistand