Abstrakt
thymosin β
10 (Tp
10) regulerer actin dynamik som en cytoplasma G-actin sekvestrerende protein. Vi har tidligere vist, at Tp
10 formindsker tumorvækst, angiogenese og proliferation ved at afbryde actin og ved at hæmme Ras. Men lidt er kendt om dens virkningsmekanisme og biologisk funktion. I den foreliggende undersøgelse, vi etablere en ny genterapi model ved anvendelse af en genetisk modificeret adenovirus, benævnt Ad.TERT.Tβ
10, der kan overudtrykke Tp
10-genet i cancerceller. Dette blev opnået ved at erstatte den native Tp
10-genpromotoren med den humane TERT-promotor i Ad.TERT.Tβ
10. Vi undersøgte kræft undertrykkelse aktivitet Tp
10 og fandt, at Ad.TERT.Tβ
10 påfaldende induceret kræft-specifikke udtryk for Tp
10 samt apoptose i en co-kultur model af menneskets primære æggestokkene cancerceller og normale fibroblaster. Derudover Ad.TERT.Tβ
10 faldt mitochondriemembran potentiale og øget reaktive ilt arter (ROS) produktion. Disse virkninger blev amplificeret ved co-behandling med anticancer lægemidler, såsom paclitaxel og cisplatin. Disse resultater viser, at stigningen i ROS produktion på grund af actin forstyrrelser af Tp
10 overekspression øger apoptose af humane ovariecancerceller. Faktisk kræft-specifikke overekspression af Tp
10 ved Ad.TERT.Tβ
10 kunne være et værdifuldt anti-cancer terapeutisk til behandling af ovariecancer uden toksicitet for normale celler.
Henvisning : Kim YC, Kim BG, Lee JH (2012) thymosin β
10 Expression Drevet af Human TERT Promoter inducerer Kræft i æggestokkene-Specific Apoptose gennem ROS Production. PLoS ONE 7 (5): e35399. doi: 10,1371 /journal.pone.0035399
Redaktør: Yoshiaki Tsuji, North Carolina State University, USA
Modtaget: December 20, 2011; Accepteret: 16 marts 2012; Udgivet: 18. maj 2012 |
Copyright: © 2012 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Finansieringen kilde er den koreanske regering. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
thymosiner er en familie af små proteiner, der oprindeligt blev isoleret fra kalvethymus, og er inddelt i tre klasser (α, p og y) baseret på deres isoelektriske [1] punkt. P-thymosiner, som har en gennemsnitlig molekylmasse på ca. 5 kDa, er højt konserverede sure proteiner, der findes i næsten alle eukaryote celle. P-thymosiner inhiberer modhager ende actinpolymerisation ved sekvestrering actinmonomerer [2], [3]. Som en af de mest udbredte p-thymosiner i pattedyrarter, thymosin β
10 (Tp
10) påvirker metastase og spredning i mange cancerceller [4] – [6]. De anti-cancer effekter af Tp
10 synes at være tæt forbundet med sin funktion som en regulator af actin dynamik i tumorceller [7], [8]. Actin dynamik kan forstyrres ved tilsætning af actin-stabiliserende lægemidler eller indførelse af mutationer, der forårsager ændringer i cellulær arkitektur og indre cellulær bevægelse. Endvidere har de seneste rapporter indikeret, at ændringer i actin dynamik kan resultere i frigivelsen af reaktive ilt arter (ROS) fra mitokondrier og efterfølgende celledød, understreger vigtigheden af at opretholde den dynamiske regulering af actincytoskelettet [9] – [14].
for nylig telomerase er blevet anerkendt som en bred vifte tumor markør og er nu betragtes som en af de vigtigste terapeutiske mål for kræftbehandling. Human telomerase revers transkriptase (hTERT), den katalytiske subunit af telomerase, detekteres hos ca. 90% af cancerceller fra tumorvæv, men er ikke detekterbar i normale væv [15] – [17]. Tidligere undersøgelser har vist, at hTERT-promotoren kan regulere ektopisk ekspression af gener af interesse i telomerase-positive cancerceller, hvilket indikerer, at hTERT-promotoren er en lovende kandidat til generering cancerspecifikke adenovira [18] – [22].
Her beskriver vi en rekombinant adenovirus, Ad.TERT.Tβ
10, som blev konstrueret ved indsættelse af Tp
10-genet under kontrol af hTERT-genpromotoren i adenovirus p-shuttle plasmid for at inducere tumorspecifikt Tp
10 genekspression. Vi har også etableret en co-kultur model af primære humane ovariecancerceller og normale fibroblaster og efterfølgende behandlet denne co-kultur med Ad.TERT.Tβ
10 at belyse cancer-specifikke effekter af Ad.TERT.Tβ
10. Derudover undersøgte vi den mekanisme af Tp
10-induceret apoptose i 2774 humane ovariecancerceller, der blev behandlet med Ad.TERT.Tβ
10. Disse eksperimenter viste tegn på, at Ad.TERT.Tβ
10 inducerer cancer-specifikke udtryk for Tp
10, hvilket resulterer i cancer-specifik apoptose gennem ROS produktion. Tilsammen indikerer disse resultater, at kræft-specifikke overekspression af Tp
10 ved Ad.TERT.Tβ
10 kunne faktisk være en værdifuld anti-cancer terapeutisk til behandling af ovariecancer uden toksicitet for normale celler og eventuelt andre maligniteter .
Resultater
thymosin β
10 udtrykkes ved lave niveauer i kræft i æggestokkene
i vores tidligere undersøgelse, rapporterede vi, at Tp
10 mRNA-niveauer var forhøjet i normale ovarier, sammenlignet med andre væv, såsom milt, thymus, prostata, testikel, tyndtarm, colon og perifere blodleukocytter, men mRNA niveauer af Tp
10 blev nedsat i ovariecancere [23]. Vi har derfor bekræftet mRNA og protein ekspressionsniveauer af thymosin β
10 (Tp
10) i serøs typen ovariecancer og mucinøs typen ovariecancer, såvel som i livmoderhalskræft og udødeliggjort æggestokkene kræft cellelinjer, såsom som 2774, OVCAR3, og SKOV3. Vores resultater, at mRNA (figur 1A) og protein (figur 1B) niveauer af Tp
10 var høj i normale ovarievæv, men faldt i alle serøs Carcinoma, mucinous carcinom og de immortaliserede ovarian cancer cellelinjer, var i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse. Men vi var ude af stand til at detektere ændringer i normal cervikal væv, adenokarcinomer, og planocellulært karcinom. Især høje ekspressionsniveauer af Tp
10 er karakteristiske for normale ovarier, men disse niveauer reduceres i ovariecancer, hvilket antyder, at Tp
10 spiller en rolle i æggestokkene cancerudvikling.
(A) mRNA ekspressionsniveauer af Tp
10 blev bestemt ved real-time PCR under anvendelse af totalt RNA isoleret fra humane normale og cancer væv, herunder ovarietumorer cancercellelinjer, såsom serøs carcinom (serøs. C) og mucinøs carcinom (mucinøs. C), udødeliggjort humane ovarie cancer cellelinier (2774, OVCAR3, og SKOV3), og adenocarcinom (Adeno. C) og planocellulært karcinom (planocellulært. C) i livmoderhalsen. Dataene er angivet som middelværdi ± SE for n = 3 separate prøver pr celletype gruppering og udtrykkes i procent af normalt ovarie. Væsentlige forskelle mellem grupperne er angivet med en stjerne (*), P 0,05; en dobbelt stjerne (**), P. 0,01 (B) Proteinet ekspressionsniveau af Tp
10 blev bestemt ved immunhistokemi i normalt ovarie væv og sammenlignes med den i serøse og mucinous typer ovariecancer henholdsvis
kræft-specifikke ekspression af thymosin β
10 af Ad.TERT.Tβ
10
for at belyse den rolle Tp
10 i human ovariecancer, vi etableret en ny fysiologisk model ved samdyrkning primære ovariecancerceller med normale fibroblaster og anvendelse af en cancer-specifikt gen afgivelsessystem omfattende en genetisk modificeret adenovirus. Vi konstruerede rekombinant adenovirus, Ad.TERT.Tβ
10, ved at erstatte Tp
10-genpromotoren med hTERT-promotoren, og vi bekræftede integritet Ad.TERT.Tβ
10 ved polymerasekædereaktion ( PCR) under anvendelse af Ad-TERT, Tp
10, og E1a-primere (figur 2A). For at bekræfte niveauet for Tp
10 genekspression behandlede vi 2774 celler med Ad.TERT.Tβ
10 ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 10 og overvåges så ændringer i Tp
10 ekspression under anvendelse immuncytokemi (ICC) og RT-PCR. Vores resultater viste, at Ad.TERT.Tβ
10 forhøjet Tp
10 ekspression i cytosolen (figur 2B).
(A) Skematisk diagram over det rekombinante adenovirus, Ad.TERT.Tβ
10, genereret ved rekombination af pSuttle.TERT.Tβ
10 og rygraden plasmid pAdEasy-1 i BJ5183. Det modificerede pShuttle plasmid, benævnt pSuttle.TERT.Tβ
10, blev klonet ved velordnet insertion af det humane TERT-promotor og Tp
10 gen til at generere en rekombinant adenovirus. Integritet Ad.TERT.Tβ
10 blev bestemt ved polymerasekædereaktion (PCR) under anvendelse af primere Ad-TERT, Tp
10, og E1a. (B) Subkonfluerende 2774 ovariecancerceller blev inficeret med 10 MOI Ad.TERT.LacZ eller Ad.TERT.Tβ
10. Efter 24 timer blev Tp
10-protein og mRNA-niveauer bestemmes ved immunocytokemi og RT-PCR, hhv. (C) Subkonfluente primære humane ovariecancer celler co-dyrket med fibroblastceller blev udsat for 10 MOI på Ad.TERT.LacZ i 7 dage. β-galactosidase ekspressionsniveau blev bestemt ved β-gal-farvning (blå farve). Pil i midten af figuren viser en primær ovariecancer cellemasse. (D) Subkonfluente primære humane ovariecancer celler co-dyrket med fibroblastceller blev også udsat for 10 MOI på Ad.TERT.Tβ
10 i 24 timer. Tp
10 ekspressionsniveau blev bestemt ved immunocytokemi (grøn farve). Pile nederst figuren indikerer primære æggestokkene cancerceller.
Vi har også evalueret kræft-selektiv induktion af genekspression ved rekombinant adenovirus, Ad.TERT.Tβ
10 og Ad.TERT.LacZ , på vores co-kultur model af primære ovariecancerceller og normale fibroblaster. På dag 7 efter behandling med 10 MOI på Ad.TERT.LacZ, vi observeret, at ovariecancerceller var vokset godt på laget dannet af normale fibroblastceller som at blive observeret i ubehandlede gruppe. Endvidere X-gal-positive celler, hvilket indikerer β-galactosidase-ekspression ved Ad.TERT.LacZ påvistes kun i primære ovariecancerceller (figur 2C). På dag 1 efter behandling med Ad.TERT.Tβ
10, grøn fluorescens, hvilket indikerer Tp
10 ekspression blev detekteret i primære ovariecancerceller men ikke i normale fibroblastceller (figur 2D), hvilket antyder, at TERT-promotoren giver æggestokkræft-specifik genekspression.
virkninger af thymosin β
10 på kræft i æggestokkene Cell Migration
Tidligere rapporter viste, at de anti-cancer effekter af Tp
10 er tæt relateret til dets rolle i reguleringen af actin dynamik i tumorceller [7], [8]. Vi har derfor undersøgt den rolle, Tp
10 i kræftcellen migration og invasion. Vi fandt, at både kræft cellemigration og invasion var betydeligt reducerede i 2774 celler inficeret af Ad.TERT.Tβ
10, i sammenligning med 2774 celler inficeret med Ad.TERT.LacZ og uinficerede 2774-celler (figur 3A). I forhold til cellemigrering blev cellebevægelse også estimeret ved sårheling assay. 2774 cellemotilitet på en plastoverflade var signifikant reduceret med Ad.TERT.Tβ
10 behandling (figur 3B).
(A) Subkonfluente 2774 humane ovariecancerceller blev inficeret med 10 MOI Ad.TERT .LacZ eller Ad.TERT.Tβ
10 for 12 timer. Efter resuspension blev cellerne yderligere inkuberet i 12 timer i det øvre kammer af en Transwell® plade overtrukket med et kollagen monolag for migration assay eller med dobbelt lag af kollagen og matrigel for invasionen assay. Resultaterne udtrykkes som en procentdel af kontrol køretøjet og er gennemsnit ± SE (søjler) af tre eksperimenter. Betydelige forskelle fra køretøj kontrolgruppen er angivet med en stjerne (*), P 0,05; to stjerner (**), P 0,01 (B) De virusinficerede celler blev også yderligere inkuberet i en 35 mm μ-Dish, lav, med en kultur-Insert (Ibidi) for 12 timer, og efterfulgt af observation af retningen og hastigheden af cellemigrering under sårheling. De sårhelende Resultaterne er udtrykt som en procentdel af kontrol køretøjet og er gennemsnit ± SE (søjler) af tre eksperimenter. Betydelige forskelle fra køretøj kontrolgruppen er angivet med en dobbelt stjerne (**), P. 0,01
Induktion af kræft-specifikke Apoptose af Ad.TERT.Thymosin β
10
for at undersøge effekten af overekspression af Tp
10 om kræft cellelevedygtighed blev subkonfluente 2774 ovariecancerceller inficeret med Ad.TERT.LacZ eller Ad.TERT.Tβ
10 ved en MOI på 10, og MTT-bioassayet blev udført dagligt i 6 dage. Vi fandt, at Tp
10 faldt betydeligt ovariecancer cellelevedygtighed, sammenlignet med mediekontrolenheder med eller uden Ad.TERT.LacZ (figur 4A). Dernæst undersøges, om faldet i cellelevedygtighed skyldtes apoptose, udførte vi FACS analyse for Annexin V-FITC og fundet at overekspression af Tp
10 induceret apoptose, men ikke nekrose, i 2774 ovariecancer cellelinje (figur 4B). Desuden på dag 1 efter behandling af Ad.TERT.Tβ
10 i co-kultur model af primær human ovariecancer med normale fibroblaster, vi klart observeret nuklear fragmentering (blå fluorescens) kun i ovariecancerceller der overudtrykt Tp
10 (grøn fluorescens). Desuden var vi ikke registrere nukleare fragmentering eller Tp
10 udtryk over baggrundsniveauer den normale fibroblast. Disse resultater indikerer, at cancer-specifikke overekspression af Tp
10, hvilket lettes ved TERT-promotoren, stimulerer kræftspecifikke nuklear fragmentering som en af de morfologiske kendetegn for apoptose (figur 5A). Derudover observerede vi slående morfologiske ændringer af ovariecancerceller behandlet med Ad.TERT.Tβ
10 for over 90 timer ved anvendelse af en real-time imaging mikroskop. Efter 10 timers behandling med Ad.TERT.Tβ
10 observerede vi typiske apoptotiske morfologiske ændringer i ovariecancerceller såsom plasma membranblæredannelse, tab af celle-celle-interaktioner, cytoplasmatisk vakuolisering, og celle krympning grund af den hurtige dehydrering. Apoptotiske celler gradvist forsvundet ved celledød, mens normale fibroblastceller syntes at være upåvirket af Ad.TERT.Tβ
10 for over 90 timer (figur 5B, Movie S1)
(A) Subkonfluente 2774 i æggestokkene. cancerceller blev opretholdt i 5 dage i komplet dyrkningsmedium indeholdende Ad.TERT.LacZ eller Ad.TERT.Tβ
10 ved en MOI på 10 eller 100, og MTT-bioassayet blev udført dagligt. (B) På den anden dag efter virusinfektion blev en FACS Annexin V /propidiumiodid (PI) assay udført ifølge fabrikantens (Clontech) protokol. Repræsentative scatter plots viser fordelingen af annexin V og PI-farvede celler. I toppaneler, X-aksen (FL1-H) indikerer annexin V-FITC-fluorescens detekteret ved 518 nm, og Y-aksen (FL2-H) angiver PI-fluorescens detekteret ved 620 nm. Som det nederste venstre (LL) kvadrant viser levende celler, øverst til venstre (UL) kvadranter indikerer nekrotiske celler, øverst til højre (UR) quadrats indikerer sent apoptotiske celler, og nederste højre (LR) kvadrant viser tidlige apoptotiske celler (top paneler) er resultaterne udtrykt som en procentdel af det samlede celleantal og er gennemsnit ± SE (søjler) af tre individuelle eksperimenter. Betydelige forskelle fra køretøj gruppe er angivet med en stjerne (*), P 0,05; to stjerner (**), P. 0,01
(A) Co-kulturer af subkonfluente primære humane ovariecancerceller og fibroblaster blev udsat for 10 MOI på Ad.TERT.Tβ
10 i 24 timer, og derefter immunocytokemi blev udført for at observere de nukleare morfologiske forandringer som følge af Tp
10 udtryk. Differential interferens kontrast (DIC) billede blev fusioneret med 4,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) farvning (blå) og Alexa 488 farvning (grøn) til at vurdere nukleare fragmentering af Tp
10 udtryk. Pile angiver nukleare fragmenteringer. (B) co-dyrket subkonfluente primære humane ovariecancerceller og fibroblaster blev udsat for 10 MOI på Ad.TERT.Tβ
10 for over 90 timer, og morfologiske ændringer blev derefter observeret ved anvendelse af en real-time imaging system. Hvide pile angiver selektive morfologiske træk ved apoptose, såsom celle plasma membranblæredannelse, cytoplasmatisk vakuolisering, og celle krympning (efter 10 timer), efterfulgt af tab af celle-til-celle interaktioner (efter 15 timer). Og sorte pile sporing en af fibroblaster indikerer, at fibroblaster er aktivt at bevæge sig rundt selv indtil 90 timer.
Forholdet mellem thymosin β
10 og Fas Expression
For at undersøge, om æggestokkene cancer-specifik apoptose skyldes apoptose-fremmende genekspression og efterfølgende signaltransduktion, vurderede vi FAS udtrykkelse og caspase 3-aktivering med primære ovariecancer celler co-dyrket med normale fibroblaster samt 2774 ovariecancer cellelinie. Vi fandt, at Ad.TERT.Tβ
10 induceret Fas-mRNA og proteinekspression i 2774 ovariecancerceller (figur 6A). I den primære co-kulturmodel, blev Fas-ekspression påvist i primære ovariecancerceller men ikke i normale fibroblaster. Disse resultater er i overensstemmelse med kræft-specifikke udtryk for Tp
10 efter infektion med Ad.TERT.Tβ
10 (figur 6B). Vigtigere, Tp
10 steg caspase 3-aktivitet ligesom Cytochalasin D (Cyt D), en potent inhibitor af actinpolymerisation. Den øgede caspase 3-aktivitet blev også inhiberet ved tilsætning af caspase inhibitor Z-VAD-FMK. Desuden er disse data er i overensstemmelse med de levedygtighed celle resultater fra den alarmar Blå assay (figur 6C).
(A) Subkonfluerende 2774 humane ovariecancerceller blev udsat for Ad.TERT.LacZ eller Ad.TERT. Tp
10 ved en MOI på 10 i 48 timer og efterfulgt af næste eksperimenter såsom RT-PCR og Western blotting for at detektere FAS (CD95) mRNA og proteinekspression, hhv. (B) Subkonfluerende primære humane ovariecancer celler co-dyrket med fibroblaster blev også udsat for 10 MOI på Ad.TERT.Tβ
10 i 24 timer og efterfulgt af immunocytokemi. Specifik FAS /CD95 antistof farvning (Alexa 488, grøn) blev fusioneret med differential interferens kontrast (DIC) billeder og nuklear farvning billeder (DAPI, blå) ved hjælp af imaging software. Hvid og orange pile angiver fibroblaster og ovariecancerceller hhv. (C) Celler blev eksponeret for Ad.TERT.LacZ eller Ad.TERT.Tβ
10 ved en MOI på 10 med eller uden caspaseinhibitor (zVAD, 40 uM), og actin polymerisationsinhibitor (cytochalasin D, 1 ug /ml) i 48 timer. De 2774 ovariecancerceller blev derefter farvet i henhold til den kommercielle caspase 3-assay kit protokol (Thermo) og afbildet under anvendelse af et Thermo Scientific Cellomics ArrayScan højinformativ screening (HCS) læser. I søjlediagrammet, er de værdier, der repræsenterer en procentdel af vehikelkontrol efterfulgt af forholdet mellem arealet af caspase 3-aktivering og området af kernen. Og resultaterne er gennemsnit ± SE (søjler) af tre forskellige eksperimenter. Betydelige forskelle fra køretøj gruppe er angivet med en dobbelt stjerne (**), P 0,01 (venstre søjlediagram). Cytotoksicitet under de samme betingelser blev bestemt i dyrkede ovariecancerceller hjælp af Alamar Blå (AB) assay som en
in vitro
alternativ model. Resultaterne udtrykkes som en procentdel af kontrol køretøjet og er gennemsnit ± SE (søjler) af tre eksperimenter. Betydelige forskelle fra køretøj kontrolgruppen er angivet med en stjerne (*), P 0,05; to stjerner (**), P 0,01 (højre søjlediagram)
Virkningerne af thymosin β
10 om mitokondriel dysfunktion og ROS Production
Tidligere rapporter har indikeret at afbrydelse af actincytoskelettet inducerer ekstracellulære generation af ROS, især O
2
-, som forstærker Fas-afhængig apoptose [13], [24]. Desuden faldt actin dynamik årsag depolarisering af den mitokondriske membran og en stigning i ROS produktion, hvilket resulterer i celledød [14]. Taget sammen, vi hypotese, at inhibering af actin-polymerisation af Tp
10 åbner mitokondriske membran porer eller kanaler i længere tid, hvilket resulterer i reduktion af det mitokondrielle membranpotentiale (MMP) og en stigning i frigivelsen af ROS ind i cytoplasmaet. Derfor målte vi Tp
10-inducerede ændringer i MMP ROS-niveauer og fandt, at oprindeligt høje niveauer af MMP markant reduceret med henholdsvis Tp
10 overekspression (figur 7A). Desuden blev ROS produktion steg med Tp
10 overekspression, hvilket er i overensstemmelse med resultatet af MTT bioassay.
(A) Celler blev udsat for Ad.TERT.LacZ (10 MOI), Ad. TERT.Tβ
10 (10 MOI), og actin polymerisationsinhibitor (cytochalasin D, 1 ug /ml) i 48 timer, og derefter en mitokondrie membranpotentiale (MMP) blev udført. MMP-assay blev udført under anvendelse af MMP-assay kit protokol (Thermo), og resultaterne blev afbildet under anvendelse af et Thermo Scientific Cellomics ArrayScan højinformativ screening (HCS) læser. (B) Celler blev eksponeret for Ad.TERT.LacZ (10 MOI), Ad.TERT.Tβ
10 (10 MOI) med eller uden anti-cancermidler, såsom paclitaxel (taxol, 5 ug /ml) og cisplatin (platin, 10 ug /ml), i 48 timer. Resultaterne blev sammenlignet med dem fra andre behandlinger, fx hver anticancermiddel eller actin polymerisationsinhibitor (cytochalasin D, 1 ug /ml). Niveauerne af intracellulære reaktive oxygenarter (ROS) blev påvist ved en fluorescens ELISA-system med oxidationsfølsomme fluorescerende probe 2, 7-dichlorofluorescein diacetat (DCF-DA). Ud over den ROS assayet blev en MTT-bioassay også udført under de samme betingelser. De alle resultater udtrykkes som en procentdel af kontrol køretøjet og er gennemsnit ± SE (søjler) af tre eksperimenter. Betydelige forskelle fra køretøj kontrolgruppen er angivet med en stjerne (*), P 0,05; to stjerner (**), P. 0,01
Det er blevet rapporteret, at cellulære ROS niveauerne stiger under forhold med stress ved behandling med anticancer midler såsom taxol (paclitaxel) og platin (cisplatin) . Denne ROS stigning fører til induktion af proapoptotiske molekyler, såsom p53 og mitogenaktiverede proteinkinaser (MAPK’er), hvilket fører til cellulær apoptose [25] – [30]. Vi anvendte Ad.TERT.Tβ
10 som en co-behandling med to klasser af anticancermidler, og fandt, at co-behandling resulterede i synergistiske virkninger, forøgelse ROS-generering og faldende cellelevedygtighed (figur 7B). Disse resultater tyder på, at kræft i æggestokkene apoptose induceret af Tp
10 overekspression skyldes ROS produktion som reaktion på faldet MMP.
Diskussion
SS-thymosin familiemedlemmer, thymosin ß
4 (Tp
4), thymosin ß
10 (Tp
10), og thymosin ß
15 (Tp
15) er blevet undersøgt i carcinogenese. De er blevet impliceret i actin binding. Men funktionen af p-thymosiner er stort set ukendt, og deres rolle i neoplastisk sygdom progression forbliver kontroversiel.
Den forhøjede ekspression af Tp
4 og Tp
10 er blevet betragtet som en egenskab ved menneskelig carcinogenese. Overekspression af Tp
4 forekommer i en lang række humane carcinomer. Tp
4 påvirker angiogenese og kræft cellemigration i mange cancer celletyper [31] – [34]. Ligeledes overekspression af Tp
10 er blevet rapporteret i adskillige humane carcinomer, herunder melanomer [1], carcinomer i nyrerne, pancreas [35], og mave [36], samt medullære thyroid carcinomer [37].
Paradoksalt nok Tp
4 og Tp
10 kan være involveret i kræft degeneration, som rapporter har vist, at Tp
4 har tumor undertrykkende effekter i myelom [38], og Tp
10 er dereguleret i renalcellecarcinom [39] og ovariecancer [40]. Desuden Tp
10 inhiberede cellevandring og kapillær-lignende rør-dannelse af humane koronare arterie endotelceller [6]. Vores resultater også implicere Tp
10 i kræft degeneration, som det høje niveau af Tp
10 udskrifter i normal ovarie blev bemærkelsesværdigt reduceret i ovariecarcinomer. Desuden blev ektopisk ekspression af Tp
10 i ovariale carcinoma cellelinier, reduceret cellulær proliferation og bevægelse, og apoptose accelereret. Derfor Tp
10 overekspression i normale ovarieceller synes at virke som en negativ regulator af carcinogenese, selvom den nøjagtige mekanisme er uklar. Men som Tp
4 induceres i ovariecancer [34] og spiller en rolle i actin binding ligesom Tp
10, ektopisk ekspression af Tp
10 i vores eksperimentelle system kan føre til øget aktivitet af ß- thymosiner og efterfølgende forstyrrelse af actin dynamik. Dette koncept understøttes af rapporter om, at Tp
4 og Tp
10 lov om udvikling fartøj på en komplementær måde in vivo [6], og at ubalancen af G-actin og F-actin forårsager celle afrunding og død [41 ]. Således betragtes vi en mulig strategi for kræftforskning og genterapi med Tp
10. Vi har derfor fremstillet et rekombinant adenovirus, Ad.TERT.Tβ
10, der skal bruges til human genterapi og til at belyse mekanismen af Tp
10 i forebyggelse ovariecancer.
rekombinant adenovirus systemer er alsidige til genekspression undersøgelser og terapeutiske anvendelser og mange forskere har anvendt rekombinante adenovira med stor succes gennem årene. Men deres lave specificitet er en ulempe begrænser nytten af disse vektorer som
in vivo Salg terapeutiske midler. Vektorer, der kombinerer høj infektivitet med kræftcelle-specifik ekspression er derfor nødvendig. Flere undersøgelser har vist, at human telomerase revers transkriptase (hTERT) er højt udtrykt i de fleste tumorvæv, men ikke i normale væv. For eksempel hTERT-promotoraktiviteten er højere i humane og murine cancerceller afledt af lunge, tyktarm, lever, bryst, ovarie, og hjerne [42] – [47]. Omvendt har de vist, at hTERT-promotoren er inaktive i normale humane fibroblaster [42], og normale humane epitelceller fra luftrøret [42], mammary [47], og ovarie [45], [48]. Derfor undersøgte vi rollen som Tp
10 i kræft i æggestokkene ved hjælp af en rekombinant adenovirus (Ad.TERT.Tβ
10). Ad.TERT.Tβ
10 blev konstrueret ved insertion af Tp
10-genet under kontrol af hTERT-promotoren i adenovirus p-shuttle-plasmid til opnåelse af cancer-specifik ekspression, og det blev sammenlignet med Ad.TERT .LacZ som kontrol. I en co-kultur model af primære humane ovariecancerceller og normale fibroblaster, β-galactosidase, der drives af hTERT-promotoren blev udtrykt i ovariecancerceller kun men ikke i normale fibroblaster. Cytotoksiske og apoptotiske morfologiske ændringer var fraværende fra normale fibroblaster behandlet med 10 MOI på Ad.TERT.LacZ over en 7-dages periode, i modsætning til den ovariecancer-specifik apoptose induceret af behandling af celler med 10 MOI på Ad.TERT. Tp
10 over en 10-timers periode. Desuden fandt vi, at kræft-specifikke udtryk for Tp
10 fra Ad.TERT.Tβ
10 blev ledsaget af den forhøjede udtryk for Fas, hvilket resulterer i cancer-specifik apoptose. Derfor vi fandt, at anticancervirkning af Ad.TERT.Tβ banke
10 at være forbundet med overekspression af Tp
10 frem for ikke-specifik viral toksicitet.
Tidligere undersøgelser har rapporteret, at et højt ROS har en positiv effekt på udviklingen af kræft og proliferation [49] – [56]. Vi fandt imidlertid, at actin binding ved overekspression af Tp
10 skyldtes den mitokondriel dysfunktion og ROS elevation, hvorved apoptose signalering blev aktiveret. Ideen om, at cancerceller er sårbare over for angreb fra ROS understøttes af den terapeutiske anvendelse af almindeligt accepterede anticancerlægemidler såsom taxol og cisplatin. Begge disse stoffer øger ROS generation i 2774, og samtidig behandling af anticancer midler med Tp
10 resultat i en additiv effekt af ROS elevation og efterfølgende induktion af apoptose. Derfor skæbne cancercellen synes at være bestemt af ROS balance. Mild elevation af ROS kan hjælpe udviklingen af kræft, men overdreven ROS elevation i kræftceller under nogle spændinger som Tp
10 overekspression og behandling af anticancer narkotika synes at stimulere apoptotiske signaler.
Ud over at induktion af apoptose , Tp
10 overekspression kraftigt reduceret motilitet i 2774 ovariecancerceller, og denne virkning var uafhængig af apoptose induktion. I de 2774 ovariecancerceller blev apoptose induceret meget senere end i primære æggestokkene cancerceller. Ad.TERT.Tβ
10-induceret apoptose i primære ovariecancerceller og immortaliserede cancercellelinier, såsom 2774, OVCAR3, og SKOV3, forekom 10- og 48-timer senere hhv. Da analyserne af invasion og migration blev udført forud for observation af apoptose, foreslår vi, at Tp
10 overekspression i kræft i æggestokkene kan have gavnlige celledræbende virkninger af primære tumorceller samt metastatiske celler.
vores resultater viser, at anti-cancer aktivitet af Tp
10 kan skyldes ROS-generering. Endvidere Tp
10 og anticancermidler, såsom taxol og cisplatin, havde en synergistisk virkning på cancer celledød. Vi fandt også, cancer-specifikke overekspression af Tp
10 drives af hTERT-promotoren resulterede i cancer-selektiv apoptose gennem amplifikation af FAS-signalering. Denne undersøgelse giver et indblik i den mekanisme, der ligger til grund anti-cancer effekter af Tp
10 i æggestokkene, hvilket kan vise sig nyttige for udviklingen af effektive æggestokkene kræftbehandlinger uden bivirkninger.
Materialer og metoder
Etik Statement
Arbejdet anvendelse af human prøve blev modtaget skriftligt samtykke fra en patient og godkendt af den koreanske sammenslutning af Institutional Review Board (KAIRB).
cellelinjer og primær cellekultur
den humane ovariecancer-cellelinje 2774 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC), og primære humane ovariecancer og fibroblastceller blev isoleret fra patienter med grad III endometrioide adenocarcinom (kræft) og co-dyrket på glasflader. Celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA), og 100 U /ml penicillin /streptomycin (Invitrogen ).
Virale vektorer
det rekombinante adenovirus, “Ad.TERT.Tβ
10″, blev konstrueret i overensstemmelse med den standard procedure, der anvendes i AdEasy ™ adenovirusvektoren System (Stratagene, La Jolla, CA, USA).
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.