PLoS ONE: Bevis for, at RASSF1C Stimulering af Lung Cancer Cell Proliferation Afhænger IGFBP-5 og PIWIL1 Expression Levels

Abstrakt

RASSF1C er en stor isoform af RASSF1 genet, og fremstår som et onkogen. Dette er i modsætning til den RASSF1A isoformen, som er en etableret tumor suppressor. Vi har tidligere vist, at RASSF1C fremmer lungekræft celledeling og har identificeret RASSF1C målgener med vækstfremmende funktioner. Her vi yderligere rapportere, at RASSF1C fremmer lungekræft celle migration og forbedrer lungekræft celle tumor sfære formation. Vi viser også, at RASSF1C overekspression reducerer de inhibitoriske virkninger af anti-cancer middel, betulinsyre (BA), på lungekræft celleproliferation. I tidligere arbejde, viste vi, at RASSF1C opregulerer

piwil1

genekspression, som er en stamcelle selvfornyelse gen, der er over-udtrykt i flere humane kræftformer, herunder lungekræft. Her rapporterer vi om virkningerne af BA på

piwil1

genekspression. Celler behandlet med BA show faldt

piwil1

udtryk. Der vises også interaktion af IGFBP-5 med RASSF1C at forhindre RASSF1C fra opregulering PIWIL1 proteinniveauer. Disse resultater tyder på, at IGFBP-5 kan være en negativ modulator af RASSF1C /PIWIL1 vækstfremmende aktiviteter. Desuden fandt vi, at hæmning af ATM-AMPK vej opregulerer RASSF1C genekspression

Henvisning:. Reeves ME, Firek M, Chen ST, Amaar YG (2014) Dokumentation for, at RASSF1C Stimulering af Lung Cancer Cell Proliferation Afhænger IGFBP-5 og PIWIL1 Expression Levels. PLoS ONE 9 (7): e101679. doi: 10,1371 /journal.pone.0101679

Redaktør: Pierlorenzo Pallante, Institut for Eksperimentel Endokrinologi og Onkologi ‘G. Salvatore ‘(IEOS), Italien

Modtaget: 10 juni, 2013; Accepteret: 11 juni 2014; Udgivet: 9 jul 2014

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Arbejdet er finansieret af Loma Linda Cancer Center. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

RASSF1 gen spiller en vigtig rolle i den menneskelige vækst kræftcelle og progression. Det koder flere isoformer, de store foretagender, som er RASSF1A og RASSF1C. RASSF1A er den hyppigst inaktiveret tumor suppressor i humane kræftformer hovedsageligt ved hjælp af specifik promoter methylering. Det hæmmer cellevækst og migration, og fremmer apoptose. På den anden side er RASSF1C isoform godt udtrykt i de fleste humane cancere, og synes at fungere som et onkogen. I modsætning til RASSF1A fremmer det cancercelleproliferation og migration, og dæmper apoptose [1] – [13]. Således RASSF1 genet synes at spille en vigtig dobbeltrolle i cancer, fungerer alternativt som en tumorsuppressor og som et onkogen [1] – [15]. I overensstemmelse med dette koncept, seneste undersøgelser viser, at ekspressionen af ​​RASSF1C opreguleres i humane lungecarcinom væv sammenlignet med matchede normale væv, og er associeret med cancer progression og dårlig prognose [13]. Desuden RASSF1C overekspression (men ikke RASSF1A overekspression) i humane cancerceller øger ophobning af β-catenin onkogen, en central aktør i Wnt signalvejen, hvilket fører til øget transkriptionel aktivering og celledeling [16].

Vi har tidligere vist, at overekspression af RASSF1C opregulerer (og lyddæmpning af RASSF1C nedregulerer) udtryk for PIWIL1, en stamcelle selvfornyelse gen [12]. Den Piwil-genfamilien er en underfamilie af Argonaute proteiner, der spiller en central rolle i stamcelle selvfornyelse, gametogenese og transkriptions- gendæmpning i en lang række forskellige arter. De Argonaute proteiner binder små RNA’er og de er karakteriseret ved aminoterminale (N), PAZ (Piwil-Argonaute-Zwille), MID (midten), og PIWI domæner [17]. Hos mennesker tre Piwil (Piwil 1 (også kaldet Hiwi), Piwil2, og Piwil3) gener er blevet identificeret. Piwi proteinekspressionsplasmider profiler har for nylig fået megen opmærksomhed for deres potentiale funktionelle involvering i onkogenese i en række humane cancere og Piwil1 og Piwil 2 har vist sig at være uafhængige prognostiske faktorer i gastrisk cancer [17] – [19]. De PIWIL proteiner og deres samvirkende små RNA’er (piRNAs) kan spille en rolle i tumorigenese ved at øge gen methylering og nedregulering af cyclinafhængige kinaseinhibitorer og tumorsuppressorer. De PIWIL proteiner og deres samvirkende små RNA’er (piRNAs) kan spille en rolle i tumorigenese ved at øge gen methylering og nedregulering af cyclinafhængige kinaseinhibitorer og tumorsuppressorer [17] – [19]. Nylige undersøgelser viser, at overekspression af PIWIL1 fremmer sarcomagenesis og nedregulerer en række tumorsuppressorer, herunder insulin-lignende vækstfaktor bindende protein 5 (IGFBP-5) [20]. IGFBP-5 er et medlem af IGF-bindende protein familie involveret i reguleringen af ​​de mitogener IGF I og II. IGFBP-5 er kritisk vigtigt i human cancer progression [21]; og vi har tidligere vist, at RASSF1C er en bindende partner af IGFBP-5 [20].

Derfor ønskede vi at bestemme, om RASSF1C formidler dens virkninger på kræftceller via interaktioner med IGFBP-5 og PIWIL1. For at gøre dette, vi designet eksperimenter for at bestemme virkningerne af RASSF1C på lungekræft proliferation, migration og tumor sfære formation. Fordi anticancermiddel, betulinsyre (BA), har vist sig at nedregulere PIWIL1 genekspression [22], studerede vi effekterne af BA og RASSF1C /IGFBP-5 interaktion på PIWIL1 genekspression og β-catenin-proteinniveauer . Vi fandt, at RASSF1C fremmer dannelse kræft cellevandring og tumor sfære, og reducerer inhibering af proliferation af BA. Desuden interaktion af IGFBP-5 med RASSF1C forhindrede RASSF1C-medieret opregulering af PIWIL1. Endelig silencing af PIWIL1 genekspression faldt β-catenin-proteinniveauer, hvilket indikerer, at PIWIL1 kan bidrage til Wnt signalering. Således RASSF1C, IGFBP-5, PIWIL1 og Wnt vej kunne fungere sammen som en ny akse, der påvirker lungekræft cellevækst og progression.

Materialer og metoder

Cell kultur

De humane lungecancer-cellelinjer NCI-H1299 og A549 blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). A549 er RASSF1A negativ, p16 negativ, og p53 positive mens NCI-H1299 er RASSF1A negativ, p16 negativ, og p53 negativ. Celledyrkning blev udført som anbefalet af ATCC.

Gene ekspressionsvektorer

RASSF1C, IGFBP-5, og RASSF1A var overudtrykt i humane lungecancerceller under anvendelse inducerbar murint leukæmivirus (MLV) -baserede retrovirale vektorer som tidligere beskrevet [12].

Cell nummer tælle

NCI-H1299-celler stabilt transduceret med MLV-rygrad (BB) og MLV-HA-RASSF1C (1C) blev behandlet med 1 ug /ml doxycyclin i 72 timer og derefter celler blev talt under anvendelse af et hæmocytometer. Forsøgene blev gentaget mindst 3 gange.

Alamar Blå assay

Celleproliferation /levedygtighed blev målt ved Alamar Blue-assayet som tidligere beskrevet [11], [12]. Forsøgene blev gentaget mindst 3 gange og data blev analyseret under anvendelse af t-test.

In vitro

celleinvasion assay

BD BioCoat Matrigel Invasion Chamber (BD Biosciences, Bedford, MA) blev anvendt til at udføre lunge cancercelleinvasion assays. NCI-H1299-BB (kontrol) eller NCI-H1299-1C (over-udtrykkende RASSF1C) celler blev podet ved en densitet på 25.000 celler i Matrigel kamre og dyrket i serum-frit RPMI-1640 i 24 timer. Kamrene indeholdende NCI-H1299-BB og NCI-H1299-1C celler blev derefter overført til den brønd, der indeholder medium suppleret med 10% kalv bovint serum i 24 timer. Cellerne på den nedre overflade af membranen blev fikseret med methanol og farvet med 1% toluidinblåt. De farvede membraner blev fotograferet gennem mikroskop og invaderende celler blev talt. Forsøgene blev gentaget mindst 3 gange.

Tumor sfære dannelse

A CD133 mikroperle Kit (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) blev anvendt til at isolere A549 side befolkning (SP, CD133

+, cancerstamceller) og ikke-SP (CD133

-) celler under anvendelse af en ved hjælp af flowcytometri protokollen fra leverandøren. SP celler blev isoleret fra A549 transduceret med enten kontrol MLV-backbone (A549-BB) eller MLV-HA-RASSF1C (A549-1C). SP og ikke-SP-celler blev derefter inkuberet i serumfrit medium suppleret med EFG (20 ng /ml) og FGF (10 ng /ml) for at fremme SP-celler til dannelse af tumor sfærer for tre wk. Tumor sfærer blev fotograferet, opsamlet og udpladet på medier suppleret med 10% kalveserum, og cellerne blev dyrket til 70% konfluens. Derefter blev celler anvendt til Western blot-analyse for at kontrollere for ekspression af exogent HA-RASSF1C.

RNA-isolering og RT-PCR-analyse

Totalt RNA fra humane lungecancer-cellelinjer blev isoleret fra kulturer og revers transkriptase (RT) -PCR blev udført under anvendelse PIWIL1 genspecifikke primere som tidligere beskrevet [12]. PCR blev udført under anvendelse af HotStart mastermix (Qiagen, Valencia, CA), og PCR reaktioner blev kørt med de følgende betingelser: 95 ° C i 15 min, 95 ° C i 1 min, 60 ° C i 30 sekunder, og 72 ° C i 30 sek i 35 cykler. Amplifikation af cyclophyllin hjælp genspecifikke PCR-primere blev anvendt som en loading kontrol. RT-PCR reaktioner blev udført i triplikater og folden ændring blev beregnet under anvendelse af 2

-ΔΔCT metode [23]. De RT-PCR-kørsler blev gentaget mindst 3 gange.

Betulinsyre (BA) behandling

BA (Enzo Life Sciences, New York, NY) blev opløst i DMSO ved 5 mg /ml . A549 og NCI-H1299-celler blev udpladet ved 5000 celler /brønd i 96-brønds plader. Næste dag blev cellerne behandlet med 25 ug /ml BA i 24 timer. Celleproliferation blev derefter analyseret under anvendelse af Alamar Blå assayet. Forsøgene blev gentaget mindst 3 gange.

Silencing af Piwil1 ekspression i lungecancerceller

lungecancerceller (NCI-H1299) blev udpladet ved 5000 /brønd i plader med 96 brønde 24 timer . før infektion og celler blev inficeret med Mission uden for målgruppen shRNA Kontrol Transduction Partikler eller med flere Mission Lentivirale shRNA Transduction Partikler (NMID: NM_004764) for silencing RASSF1C (Sigma, St. Louis, MO) som tidligere beskrevet [14]. Celler blev behandlet med polybren (Sigma, ST. Louis, MO) i to timer før tilsætning Lentiviral partikel ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 5. Knockdown validering af

piwil1

ekspression blev vurderet ved Western blot og QRT -PCR hjælp RASSF1C antistof og RASSF1C specifikke primere, henholdsvis. Forsøgene blev gentaget mindst 3 gange.

Western blot-analyse

Western blot-analyse blev udført under anvendelse af Odyssey Infrared System (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) og anti-β- catenin antistof # 9582 (Cell Signaling, Danvers, MA), anti-PIWIL1 antistof ab12337 (Abcam, Cambridge, MA), anti-HA-antistof klon 16B12 (Covance, Berkeley, CA), monoklonalt beta actin antistof AC-74 (Sigma, St. Louis, MO), og fluorescens-mærkede sekundære antistoffer IRDye 680RD infrarøde farve (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE). Forsøgene blev gentaget mindst 3 gange. Protein niveauer blev normaliseret til actin niveauer (lastning kontrol) med standardafvigelser.

Transkriptomet PCR Array skærm

SureFind Transkriptomet PCR Array blev opnået fra Qiagen (katalog nr 336611. Den bestod af 90 cDNA prøver afledt af brystcancer MCF7 behandlet med 90 forskellige kemiske inhibitorer, der regulerer forskellige signalveje. PCR arrayet blev screenet med RASSF1C genspecifikke primere. Dataanalyse blev udført ved at importere Ct-værdier i SureFind Transkriptomet PCR Array data Analysis Software på https://www.sabiosciences.com/tpadataanalysis.php (Qiagen). Kemikalierne identificeret som RASSF1C genekspression regulatorer blev anvendt til behandling af lungecancerceller at bekræfte deres virkninger på RASSF1C genekspression anvendelse af RT-PCR.

Dorsomorphin og Trichostatin A behandling

H1299 lungecancerceller blev behandlet med Dorsomorphin, også kendt som forbindelse C, (10 uM) eller Trichostatin A (10 uM) i serumfrit medium i 24 timer før celler blev opsamlet til RNA isolering. Kontrolceller blev behandlet med Dimethylsulfoxid (DMSO). RT-PCR-analyse under anvendelse RASSF1C, PIWIL1, og cyclophyllin genspecifikke primere blev udført som nævnt ovenfor. Dorsomorphin blev opnået fra Phoenix Pharmaceutical, Inc. (Burlingame, CA) og Trichostatin A blev opnået fra Reagenser Direct (Encinitas, CA). Forsøgene blev gentaget mindst 3 gange.

Statistisk analyse

t-test blev anvendt til at beregne betydningen af ​​dataene.

Resultater

RASSF1C overekspression øger lungekræft celle migration

lungekræft cellelinje NCI-H1299 blev transduceret med retroviral vektor som beskrevet tidligere [12], [13] for at skabe en stabil cellelinie, der over-udtrykker RASSF1C. Vi fandt, at en stabil RASSF1C overekspression ikke kun øget lungekræft celleproliferation (figur 1), hvilket er i overensstemmelse med vores tidligere resultater ved anvendelse transient overekspression af RASSF1C [11], men også fremmet cellevandring (figur 2).

NCI-H1299-celler stabilt transduceret med MLV-rygrad (BB) eller MLV-HA-RASSF1C (1C) blev behandlet med 1 ug /ml doxycyclin i 72 timer, og derefter celler blev talt. RASSF1C overekspression (1C) steg celledeling med 2,5 gange sammenlignet med kontrol (BB). Data er repræsentative for mindst 3 uafhængige forsøg, og værdierne repræsenterer middelværdien ± SEM. * P. 0,05

. RASSF1C fremmer lungekræft celle migration. (A) BD BioCoat Matrigel Invasion Chamber blev anvendt til at vurdere celleinvasion /migration af NCI-H1299-celler stabilt transduceret med tom MLV-rygrad (BB) eller MLV-HA-RASSF1C (1C). Celler behandlet med doxycyclin på 1 ug /ml blev co-inkuberet med serum-holdige medier. Efter 24 timer blev de nederste sider af filtrene fikseret og farvet, og celler i fire mikroskopiske felter blev talt. Den gennemsnitlige celletal optælling blev afbildet. (B) NCI-H1299-celler overudtrykker RASSF1C viste en højere antal celler invaderer Matrigel kammeret og migrerer til den anden side af filteret sammenlignet med kontrol NCI-H1299-BB-celler. Data er repræsentative for mindst 3 uafhængige forsøg, og værdierne repræsenterer den gennemsnitlige celle optælling af kolonier. * P. 0,05, bestemt ved t-test

RASSF1C forbedrer lunge tumor sfære dannelse

Det er blevet påvist, at CD133-positive celler fra A549-cellelinje kan give anledning til tumor kugler og kan fungere som tumor-initierende celler [24], [25]. Således ønskede vi at vurdere effekten af ​​RASSF1C overekspression på lungekræft tumor sfære formation. Vi isoleret A549 side befolkning (SP, CD133

+ -celler), som udviser stamcelle-lignende egenskaber, og ikke-SP CD133

– celler ved anvendelse CD133 flowcytometri [24], [25]. SP celler blev isoleret fra A549 transduceret med enten MLV-skelet (A549-BB) eller MLV-HA-RASSF1C (A549-1C). Celler blev dyrket i serumfrit medium suppleret med EFG og FGF at forårsage SP-celler til dannelse af tumor sfærer (figur 3A). RASSF1C-SP-CD133

+ -celler dannes mere og større tumor sfærer sammenlignet med kontrolgruppen BB-SP-CD133

+ -celler (figur 3A). For at vise, at svulsten sfære afkom stadig overudtrykt RASSF1C, tumor kugler blev isoleret, dyrket og anvendt til Western blot-analyse. SP celler gjorde faktisk over-express RASSF1C (figur 3B). Alt dette tyder på, at RASSF1C kan forstærke lungecancer stamcelleproliferation, og det er muligt, at dette sker gennem opregulering af PIWIL1 gen, et stamcelle selvfornyelse genet [12].

(A) Ikke -SP-1C CD133

-, SP-BB CD133

+, og SP-1C CD133

+ -celler isoleret fra A549 lungecancer-cellelinje blev dyrket i serumfrit medium suppleret med 10 ng /ml EGF og 20 ng /ml FGF at fremme tumor sfære formation til tre wk. (B) A549-celler repopulerede fra tumor sfærer blev kontrolleret for HA-RASSF1C ekspression under anvendelse HA-antistof. Som forventet, SP-1C CD133- og CD133 + udtrykte HA-RASSF1C, mens SP-BB celler ikke gjorde. Dataene er repræsentative for mindst 3 uafhængige forsøg.

RASSF1C reducerer følsomheden af ​​lungekræft celler til anti-cancer middel betulinsyre

Betulinsyre (BA) er en anti-inflammatorisk og anti-cancer middel, der har vist sig at fremme apoptose og inhibere celleproliferation og migration. Det sker, i det mindste delvis, ved nedregulering PIWILI, cyclin B1, cyclin D1, BCL2 og opregulering bax genekspression i flere typer af cancerceller, herunder A549 [22], [26], [27]. Vi har tidligere vist, at RASSF1C overekspression opregulerer PIWIL1 genekspression og dermed vi ønskede at bestemme, om RASSF1C overekspression vil mindske de anti-proliferative virkninger af BA på lunge kræftceller. Vores eksperimenter viste, at A549 og NCI-H1299-celler overudtrykker RASSF1C var mindre følsomme over for BA anti-proliferative virkninger sammenlignet med kontrolceller (figur 4), yderligere underbygger en vækstfremmende rolle for RASSF1C i lungecancerceller.

A549 (A) og NCI-H1299 (B) lungecancerceller overudtrykker RASSF1C blev behandlet med betulinsyre (BA) i 24 timer. Celler blev derefter analyseret for celleviabilitet /proliferation. RASSF1C overekspression betydeligt reduceret følsomhed af celler til BA. Data er repræsentative for mindst 3 uafhængige forsøg, og værdierne repræsenterer middelværdien ± SEM. * P 0,05: for 1C i forhold til BB

Effekter af BA på PIWIL1 udtryk i lunge kræftceller

Det er blevet rapporteret, at BA behandling af humane gastrisk adenocarcinom AGS celler ned. -regulates PIWIL1 genekspression [26]. Derfor ønskede vi at vurdere effekten af ​​BA på PIWIL1 genekspression i lunge kræftceller. RT-PCR-data (figur 5) viser, at

piwil1

mRNA niveauer blev nedsat i A549 og H1299 celler efter BA behandling. Den nedregulere effekt af BA på

piwil1

mRNA niveauer i lunge kræftceller er i overensstemmelse med den observeret i gastrisk adenocarcinom AGS celler [26].

Piwil1

mRNA-ekspression blev vurderet i nærvær og fravær af serum og BA i lungen cancercellelinier A549 (A) og NCI-H1299 (B). RT-PCR-data viser, at

piwil1

udtryk blev nedreguleret ved BA i fravær og tilstedeværelse af serum. PCR-reaktioner blev sat tredobbelt og Cyclophillin blev anvendt som en intern loading kontrol og anvendes til at normalisere de relative ekspressionsniveauer under anvendelse af 2

-ΔΔ metode (26). RT-PCR-reaktionen blev kørt ved tre uafhængige gange.

PIWIL1 knock-down fører til reduktion af β-catenin-ekspression

RASSF1C har tidligere været knyttet til Wnt signalvejen, som RASSF1C overekspression stigninger og dæmpning eller RASSF1C formindsker β-catenin akkumulering i lungecancerceller [16]. Vi har tidligere vist, at knock-down af RASSF1C ekspression resulterer i nedregulering af PIWIL1 genekspression [12]. Således ønskede vi at afgøre, om PIWIL1 gen knock-down vil påvirke β-catenin udtryk. Knock-down af PIWIL1 genekspression ved anvendelse af en shRNA-lentiviral vektor resulterede i lavere niveauer af β-catenin-mRNA og protein (figur 6). Vores resultater tyder på, at PIWIL1 kan modulere β-catenin-niveauer, og at RASSF1C og PIWIL1 kan spille en central rolle i Wnt vej signalering at fremme tumorigenese.

Knock-down af

piwil1

udtryk resulterede i en reduktion i β-catenin-mRNA og protein niveauer. (A) Western blot analyse af H1299 lungekræft celler inficeret med Mission Lentiviral-shRNA-kontrol partikler (shRNA-fortsat) og Mission Lentiviral-shRNA-

piwil1

(shRNA-

piwil1

) til stilhed endogene

piwil1

udtryk. Western blot analyse under anvendelse af anti-PIWIL1 antistof-shows reduceret PIWIL1 proteinniveauer i shRNA-PIWIL1 celler sammenlignet med shRNA-cont celler. Silencing af

piwil1

genekspression resulterede i en reduktion i β-catenin-proteinniveauer bestemt under anvendelse β-catenin antistof. Normaliseret PIWIL1 protein niveauer til actin (lastning kontrol) er også vist, data repræsenterer tre uafhængige blots. (B)

Piwil1

og

β-catenin

mRNA niveauer blev også vurderet i shRNA-cont og shRNA-

piwil1

celler og RT-PCR data viser nedregulering af både

piwil1

og

β-catenin

mRNA-niveauer, der er i overensstemmelse med den Western blot-analyse. RT-PCR-forsøg blev udført mindst 3 uafhængige gange.

Intracellulær IGFBP-5 ser ud til at modulere RASSF1C funktion i lunge kræftceller

Nyt arbejde viser, at PIWIL1 overekspression ned -regulates et antal tumorsuppressorgener, herunder IGFBP-5, i humane mesenkymale stamceller [18]. Tidligere arbejde i vores laboratorium har vist, at RASSF1C binder til IGFBP-5 og kan regulere osteosarkom celleproliferation og apoptose [20]. Således ønskede vi at undersøge effekten af ​​RASSF1C /IGFBP-5 interaktion på PIWIL1 genekspression i lunge kræftceller. Interessant, fandt vi, at co-ekspression af RASSF1C og IGFBP-5 reducerede PIWIL1 mRNA og protein niveauer i lungekræft-cellelinjer, mens co-ekspression af RASSF1A-RASSF1C ikke havde en stor effekt på PIWIL1 mRNA-niveauer sammenlignet med celler overudtrykker RASSF1C (figur 7). PIWIL1 proteinniveauer blev også reduceret i lungecancerceller co-udtrykkende RASSF1C-IGFBP-5 sammenlignet med celler overudtrykker RASSF1C (figur 8). Endvidere fandt vi, at lungecancerceller coudtrykker RASSF1C og IGFBP-5, men ikke celler co-udtrykkende RASSF1A og RASSF1C, var som sensibiliseret over for BA inhibering som kontrolcellerne (figur 9). Vi bør ikke at RASSF1A overekspression alene forstærkede ikke de væksthæmmende effekter af BA (data ikke vist). Disse resultater tyder på, at intracellulær IGFBP-5, men ikke RASSF1A, negativt påvirker RASSF1C funktioner. Sammenkædning RASSF1C /IGFBP-5 interaktion til modulering af PIWIL1 genekspression og celledeling er en roman fund, der kræver yderligere undersøgelse.

Piwil1

mRNA ekspression blev vurderet i H1299 celler stabilt transduceret med MLV Ha-rygraden (BB), MLV-HA-RASSF1C (1C), MLV-HA-RASSF1A og 1C (1A-1C) og MLV-HA-1C og IGFBP-5 (1C-BP5). RT-PCR-data viser, at

piwil1

mRNA-ekspression i celler co-udtrykkende 1C og BP5 var reduceret sammenlignet med celler over-udtrykkende 1C og 1A and1C. Data er repræsentative for mindst 3 uafhængige forsøg, og værdierne repræsenterer middelværdien ± SEM. * P 0,05: for 1C i forhold til BB

(A) Western blot analyse af NCI-H1299 og A549 celler stabilt transduceret med MLV-backbone (BB), MLV-HA-RASSF1C (1C. ), MLV-HA-IGFBP-5 (BP5), og co-transduceret med både MLV-HA-RASSF1C og -IGFBP-5 (1C-BP5) og behandlet med 1 ug /ml doxycyclin i 48 timer. Den anti-HA-tag-antistof detekteres en HA-RASSF1C og HA-IGFBP-5 fusionsproteinet i celler, som over-udtrykte hver alene og dem, der co-udtrykte dem begge. Fusionsproteinet blev visualiseret under anvendelse af fluorescerende mærkede sekundære antistoffer. (B) Western blot-analyse af A549 og H1299 lungecancerceller stabilt transduceret med MLV-backbone (A549-BB og H1299-BB), MLV-HA-RASSF1C (A549-1C og H1299-1C), MLV-HA-IGFBP- 5 (A549-BP5 og H1299-BP5), og MLV-HA-RASSF1C /MLV-HA-IGFBP-5 A549-1C-BP5 og H1299-1C-BP5). Den anti-PIWIL1 antistof blev anvendt til at probe Western blot. PIWIL1 er opreguleret i A549 og NCI-H1299-celler overudtrykker RASSF1C, men ikke i celler, som udtrykker IGFBP-5 eller co-udtrykker både IGFBP-5 og RASSF1C. (C) Viser normaliserede PIWIL1 protein niveauer til actin (lastning kontrol) med standardafvigelser, data repræsenterer tre uafhængige blots.

. H1299-BB, H1299-1C, H1299-1A-1C, og H1299-1C-BP5 celler blev behandlet med betulinsyre (BA) i 24 timer. Celler blev derefter analyseret for celleviabilitet /proliferation. Celler coudtrykker RASSF1C-IGFBP-5 var mere følsomme over for BA sammenlignet med celler over-udtrykkende RASSF1C eller co-udtrykkende RASSF1A-RASSF1C. Data er repræsentative for mindst 3 uafhængige forsøg, og værdierne repræsenterer middelværdien ± SEM. * P 0,05: for 1C i forhold til BB

Hæmning af ATM-AMPK pathway inducerer RASSF1C genekspression

I øjeblikket intet vides om de opstrøms signalleringskaskader involveret i reguleringen RASSF1C gen. udtryk. Derfor udførte vi en transkriptom PCR-array undersøgelse for at identificere kemiske inhibitorer og tilhørende signalvej (e), der modulerer RASSF1C udtryk. PCR matrix bestod af cDNA fra brystcancer MCF7 behandlet med 90 forskellige kemiske inhibitorer, der regulerer forskellige signalveje. Grupperingen blev screenet med RASSF1C genspecifikke primere og flere kemiske inhibitorer, der synes at opregulere og nedregulerer RASSF1C ekspression med ≥ 1,5 gange, blev identificeret. De mest bemærkelsesværdige reagenser er Dorsopmorphin (AMPK inhibitor) og KU60019 (ATM-hæmmer), som opregulere RASSF1C udtryk med 2,8 og 2,4 fold henholdsvis; og Trichostatin A (HDAC inhibitor og AMPK aktivator) nedregulerer RASSF1C ekspression med 2 gange (tabel 1). Vi efterfølgende bekræftet virkningen af ​​Dorsomorphin og Trichostatin på RASSF1C ekspression i H1299 lungecancerceller (figur 10). Disse resultater er hidtil ukendte og tyder på, at ATM-AMPK pathway kan modulere RASSF1C ekspression /funktion i lungecancerceller. Salg

H1299 lungecancerceller blev behandlet med Dorsomorphin og Trichostatin A ved en koncentration på 10 uM at validere PCR Array data. RT-PCR-analyse viser, at Dorsomorphin markant opreguleret RASSF1C genekspression mens lidt opregulering PIWIL1 genekspression. Trichostatin A behandling signifikant nedreguleret RASSF1C og PIWIL1 mRNA-niveauer. De præsenterede data er et gennemsnit af tre uafhængige RT-PCR-forsøg udført i tre eksemplarer, * = P. 0,05

Diskussion

RASSF1 synes at være et gen med dobbelt funktionalitet, både som en tumor suppressor protein (RASSF1A isoform), og som et onkoprotein (RASSF1C isoform) [11] – [16]. I denne artikel, rapporterer vi, at overekspression af RASSF1C ikke kun forbedrer lungekræft celledeling, men også fremmer celle migration. Dette er i overensstemmelse med vores tidligere fund i brystkræftceller [13]. Desuden RASSF1C overekspression reducerer også virkningen af ​​det anti-cancer middel, betulinsyre, som vides at nedsætte lungecancer celleproliferation [22]. Dette understøtter yderligere vækstfremmende og apoptose formildende handlinger RASSF1C.

Vi har tidligere vist, at RASSF1C modulerer PIWIL1 genekspression, en stamcelle selvfornyelse gen. Derfor er det muligt, at RASSF1C kan bidrage til lungekræft stamcelle udvikling og progression. Konsistent med dette har vi fundet, at CD133

+ lungecancerceller (som udviser kræft stamcellelignende karakteristika [24], [25] overudtrykker RASSF1C synes at danne større og mere talrige tumor sfærer sammenlignet med kontrol CD133

+ celler. PIWIL1 genekspression er forhøjet i mange humane cancerceller, og det er blevet foreslået, at PIWIL1 kan være involveret i tumorigenese [17], [18], [26]. For nylig, sh-RNA

piwil1

gen-knockdown i lungekræft stamceller (SSCloAldebr) har vist sig at reducere tumorvækst i nøgne mus, der yderligere implicerer rolle PIWIL1 proteinet i at opretholde cancer stamcelleproliferation [28].

BA har tidligere vist sig at reducere menneskers kræft celledeling og nedregulere

piwil1

mRNA-ekspression i gastrisk adenocarcinom celler [22], [26]. Vi vurderede virkningerne af BA på

piwil1

gen ekspression i lungecancerceller anvendelse af RT-PCR og Western blot-analyse. Mens behandling lungecancerceller med BA resulterede i en reduktion i celleproliferation (figur 4) og i nedregulering af

piwil1

mRNA, der er konsistent med publiceret litteratur.

piwil1

gen er overudtrykt i flere humane kræftformer, og knock-down af

piwil1

aftager (og overekspression af

piwil1

gen stiger) tumorvækst

in vivo

[18], [19], [28]. Men meget lidt er kendt om dets rolle i lungekræft cellevækst og progression. Vi slået ned

piwil1

genekspression for yderligere at lære om dets funktioner i lunge kræftceller. Vi fandt, at

piwil1

gen knock-down resulterede i et fald i endogene β-catenin-proteinniveauer. Vi har vist, at RASSF1C opregulerer PIWIL1 ekspression [12], og andre har vist, at RASSF1C forøger akkumuleringen af ​​β-catenin-proteinniveauer i A549 lungecancerceller [15]. Vores resultater peger på en potentiel sammenhæng mellem RASSF1C og PIWIL1 og den kanoniske Wnt signalvejen, en vej, der spiller en central rolle i ikke blot at holde stamceller i en selvfornyende og udifferentieret tilstand, men også at fremme tumorigenese [19], [ ,,,0],28].

PIWIL1 har for nylig vist sig at hæmme differentiering af sarkom forstadier

in vitro

at fremkalde sarkomer

in vivo Hotel (19). PIWIL1 inducerer sarcomagenesis gennem nedregulering af tumor undertrykkere og cyclinafhængige kinase hæmmere via hypermethylering [19]. En af tumorsuppressorer nedreguleres af PIWIL1 er IGFBP-5, som vi tidligere har vist sig at være et interagerende partner RASSF1C [19]. Derfor ønskede vi at undersøge virkningen af ​​RASSF1C /IGFBP-5 interaktion på PIWIL1 genekspression i lungecancerceller. Interessant, co-ekspression af RASSF1C og IGFBP-5 betydeligt negeret RASSF1C opregulering af PIWIL1 genekspression og også forbedret de hæmmende virkninger af BA i forhold til celler, der enten udtrykkelig RASSF1C eller co-express RASSF1A og RASSF1C (figur 9). Sammen disse resultater tyder på, at IGFBP-5 kan binde og udskille RASSF1C, hvilket forhindrer opregulering af PIWIL1 genekspression ved RASSF1C. Denne kobling af IGFBP-5 /RASSF1C interaktion med modulation af PIWIL1 udtryk er en roman fund og fortjener yderligere undersøgelse og godtgørelse.

I øjeblikket intet vides om, hvordan RASSF1C genekspression er reguleret, og derfor vi udførte en transkriptom PCR vifte skærm og identificerede flere kemiske inhibitorer, der synes at modulere RASSF1C genekspression. Blandt disse kemiske inhibitorer, fandt vi, at den kemiske inhibitoren Dorsomorphin (også kendt som forbindelse C) og KU60019 opregulere RASSF1C 2 fold mens den kemiske Trichostatin A nedregulerer RASSF1C genekspression ved 2 gange i bryst- og lungecancer-celler (tabel 1). Dorsomorphin er blevet vist at inhibere virkningerne af ioniserende stråling (IR) på cellecyklusstandsning og celleproliferation gennem inaktivering af ATM-AMPK-p21

WAF /CIP pathway [29]. Aktivering af ATM-AMPK-p21

WAF /cip vej med Metformin er for nylig blevet vist sig at hæmme væksten og øge IR virkninger på NSCLC celler [30].