PLoS ONE: dosisafhængig ATP Udtømmelse og Kræft Cell Død efter Calcium Elektroporation, relative effekt af Calcium Koncentration og Electric Field Strength

Abstrakt

Baggrund

Elektroporation, en metode til at øge permeabiliteten af membraner til ioner og små molekyler, der anvendes i klinikken med kemoterapeutiske lægemidler til behandling af kræft (electrochemotherapy). Elektroporation med calcium forårsager ATP (adenosin trifosfat) udtømning og kræft celledød og kunne være en ny kræftbehandling. Denne undersøgelse har til formål at forstå forholdet mellem anvendt elektrisk felt, calcium koncentration ATP udtynding og effekt

Metoder

I tre humane cellelinjer -. H69 (småcellet lungekræft), SW780 ( blærekræft), og U937 (leukæmi), blev bestemt levedygtighed efter behandling med 1, 3 eller 5 mM calcium og otte 99 ps pulser med 0,8, 1,0, 1,2, 1,4 eller 1,6 kV /cm. Montering analyse blev anvendt til at kvantificere celle-drab effekt i nærvær af calcium. Post-behandling intracellulære ATP blev målt i H69 og SW780 celler. Post-behandling intracellulære ATP blev observeret med fluorescens konfokal mikroskopi af quinacrin-mærkede U937-celler.

Resultater

Både H69 og SW780 celler viste dosisafhængig (calcium koncentration og elektrisk felt) fald i intracellulær ATP (p 0,05) og nedsat levedygtighed. Den 50% effektive celledrab blev fundet ved 3,71 kV /cm (H69) og 3,28 kV /cm (SW780), reduceret til 1,40 og 1,15 kV /cm (henholdsvis) med 1 mM calcium (lavere EC50 for højere koncentrationer af calcium). Quinacrine fluorescensintensitet af calcium-elektroporerede U937-celler var en tredjedel lavere end i kontrollerne (p 0,0001).

Konklusioner

Calcium elektroporation dosisafhængigt reduceret celle overlevelse og intracellulær ATP. Stigende ekstracellulært calcium tillader anvendelsen af ​​en lavere elektrisk felt.

generel betydning

Denne undersøgelse understøtter brugen af ​​calcium elektroporering til behandling af cancer og muligvis sænke det påførte elektriske felt i fremtidige forsøg.

Henvisning: Hansen EL, Sozer EB, Romeo S, Frandsen SK, Vernier PT, Gehl J (2015) dosisafhængig ATP Udtømmelse og Kræft Cell Død efter Calcium elektroporation, relative effekt af Calcium Koncentration og elektrisk feltstyrke. PLoS ONE 10 (4): e0122973. doi: 10,1371 /journal.pone.0122973

Academic Redaktør: Boris Rubinsky, University of California i Berkeley, UNITED STATES

Modtaget: December 29, 2014 Accepteret: 11 februar 2015; Udgivet: April 8, 2015

Copyright: © 2015 Hansen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. ELH blev støttet af et legat fra dansk Cancer Society (R81-A5208-13-S7) og ved en bevilling fra COST Action “europæiske netværk for udvikling af Electroporation- baserede teknologier og behandlinger “(TD1104-010414-042351). SR blev støttet af en bevilling fra COST Action (TD1104-040514-041263). JG var en svensk Royal Academy of Sciences Research Fellow støttes af en bevilling fra Acta Oncologica Foundation (2009-2014). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne erklære patentet “Terapeutiske anvendelser af calcium elektroporation til effektivt fremkalde tumor nekrose” (PCT /DK2012 /050.496, co-opfindere SKF og JG) er indsendt. Andre forfattere erklærer nogen interessekonflikt. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Elektroporation er en metode, der anvendes til at generere øget porøsitet af cellemembraner ved at anvende permeabilising elektriske impulser [1]. Fremgangsmåden kan anvendes til at inducere passage af ellers ikke-gennemtrænger narkotika [2-5] eller ioner såsom calcium [6,7] ind i celler gennem cellemembranen [8].

Vendbar elektroporering, hvor celler membraner gentætne efter transient permeabilisering, anvendes i klinikken i kombination med kemoterapeutiske lægemidler til lokal behandling af maligne tumorer (electrochemotherapy) [9-11]. Substitution calcium for kemoterapeutiske midler i denne procedure (calcium elektroporation) kunne være en roman, effektiv og billig kræftbehandling [6].

Det er af stor klinisk interesse at undersøge muligheden for at minimere det elektriske felt størrelsesorden under behandling både i undgåelse af muskelsammentrækninger og i udviklingen af ​​elektroder, der kan behandle dybtliggende tumorer. Udsætter celler at opdele doser elektroporering har vist sig at øge celle følsomhed over for electrochemotherapy, et fænomen kaldet electrosensitation [12]. Vores undersøgelse har til formål at undersøge en mulig stigning i følsomhed også irreversibel elektroporation behandling, når stigende ekstracellulært calcium. Irreversible elektroporation (IRE) [13] er en anden elektroporation baseret terapi, hvor stærkere elektriske felter bruges til at dræbe kræftceller gennem irreversibel membran permeabilisering. Forøgelse elektrode terapeutiske område ved at reducere det elektriske felt er et særligt problem i IRE, samt andre elektroporation terapier [14]. For IRE, kan tilsætning af calcium øger behandlingen radius og virkning.

Calcium er et allestedsnærværende second messenger involveret i talrige cellulære processer, herunder kontrolleret nekrose (necroptosis) [15-18]. Koncentrationsgradienten for calcium over cellemembranen reguleres stramt for at opretholde cellulær homeostase. I normale celler opretholdes den intracellulære koncentration af ioniseret calcium omkring 100 nM, væsentligt lavere end den ekstracellulære koncentration, som typisk overstiger 1 mM [16,19]. Gradienten opretholdes gennem talrige membranpumper, såsom Ca

2 + -ATPases, der forbruger ATP (adenosin trifosfat) for energi til enten udvise overskydende calcium fra cellen eller overføre det til cellulære rum, såsom det endoplasmatiske reticulum eller mitokondrier [20-22].

Vi har tidligere vist, at cellulære ATP-niveauer drop efter calcium elektroporering [6]. Når en dramatisk stigning i intracellulært calcium forekommer, eventuelt ved calcium elektroporering, en forøget aktivitet af Ca

2 + -ATPases hastigt forbruger cellulære ATP [19]. En stigning i calcium påvirker også mitokondrier, der fører til tab af ATP-produktion [20]. Endvidere skabelsen af ​​transiente porer i plasmamembranen kan forårsage lækage af ATP ud af cellen [23]. Samlet, cellulære ATP formindskes, når et toksisk niveau af calcium induceres ind i cellen, eventuelt gennem disse mekanismer. Denne ATP udtynding kan bidrage til initiering af celledød [6,24].

Calcium elektroporation kan sammenlignes i effektivitet til at electrochemotherapy

in vitro

[7], og er i øjeblikket i den første kliniske forsøg i et randomiseret dobbelt blindet fase II noninferioritetsundersøgelse (ClinicalTrials.gov-ID NCT01941901). Mere viden om mekanismen af ​​calcium elektroporation er nødvendig for yderligere at forstå og udnytte denne antitumor modalitet.

For at undersøge forholdet mellem calcium koncentration og pulserende elektriske felter i at få ATP udtynding og tilstrækkelig celle kill

in vitro

anvendte vi cellelinjer kendt for at have forskellige modtagelighed over for calcium elektroporation behandling

in vivo

: H69 human småcellet lungecancer med høj følsomhed (77-100% nekrose i tumorer 6 dage efter calcium elektroporation; [ ,,,0],9]) og SW780 human blærecancer-cellelinie med lav følsomhed (1-60% nekrose i tumorer 6 dage efter calcium elektroporation, upublicerede data). Vi udforskede også de kortsigtede effekter af calcium elektroporation på ATP indholdet af en menneskelig leukæmi cellelinie (U937) ved hjælp af konfokal billeddannelse med den fluorescerende markør quinacrine.

Denne undersøgelse undersøger forholdet mellem anvendt elektrisk felt, koncentration calcium , cellelinje følsomhed og effekten på ATP-indhold og overlevelse.

Materialer og metoder

Tre humane cellelinjer blev brugt til eksperimenter. Eksperimenter analysere ATP-indhold og levedygtighed udføres på Rigshospitalet Herlev brugte H69 human småcellet lungekræft og SW780 menneskelig blære kræft cellelinjer. U937 human leukæmi cellelinje blev anvendt til eksperimenter på Frank Reidy Research Center for Bioelectrics.

Celledyrkning

H69 humane småcellet lungecancer-cellelinie stabilt transfekteret med forstærket grønt fluorescerende protein (EGFP) reguleret af cytomegalovirus promotor [25] blev venligst stillet til rådighed af Department of Radiation Biology, Rigshospitalet. Den SW780 human blære overgangsordning celle karcinom blev venligst stillet til rådighed af Dr. Lars Dyrskjøt Andersen, Institut for Molekylær Medicin, Århus Universitetshospital [26]. Den U937 menneskelige histiocytisk lymfom monocyt cellelinje (ATCC CRL-1593,2) blev venligst stillet til rådighed af Olga Pakhomova, Frank Reidy Forskningscenter for Bioelectrics, Old Dominion University.

Alle cellelinjer blev opretholdt i RPMI 1640 dyrkningsmedium indeholdende 10 % føtalt kalveserum (Gibco, Invitrogen), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C og 5% CO

2.

Elektroporation protokol

Celler i HEPES puffer (10 mM HEPES (Lonza), 250 mM saccharose, 1 mM MgC

2 i sterilt vand) med slutkoncentration 6,1 × 10

6 celler /ml, blev afkølet på is i 5 min. For calcium elektroporation (CAEP), 20 pi HEPES buffer indeholdende CaCI

2 blev tilsat til elektroporation kuvetter med 4 mm elektrode separation (Molecular BioProducts Inc., San Diego, CA, USA), hvilket gav en slutkoncentration på 0 mM, 1 mM, 3 mM, eller 5 mM CaCl

2 efter tilsætning 180 pi cellesuspension. Kuvetterne blev holdt på is i 5 minutter før elektroporering (EP). EP bestod af 8 impulser af 99 mikrosekunder med 0,8 kV /cm, 1,0 kV /cm, 1,2 kV /cm, 1,4 kV /cm eller 1,6 kV /cm henholdsvis leveres ved en frekvens på 1 Hz under anvendelse af en BTX T820 firkantbølge elektroporator ( BTX Harvard Apparatus). Efter 20 minutters inkubation ved 37 ° C og 5% CO

2, cellerne blev fortyndet i 5 ml dyrkningsmedium (slutkoncentration 2,4 × 10

5 celler /ml).

ATP assay

Cellular ATP-niveauet blev målt i H69 og SW780 celler behandlet med calcium med eller uden elektroporering under anvendelse ATP luminescens-assay (Enliten ATP assay; Promega) efter cellelyse. For ATP assay 11,5 × 10

4 celler /ml H69 celler eller 4,6 × 10

4 celler /ml SW780 celler i 100 pi kulturmedium var i 96-brønds plader i overensstemmelse med indledende optimering.

Celler blev behandlet ifølge elektroporation protokollen. Celler elektroporeret med HEPES-buffer, ikke-elektroporeret celler med calcium og ubehandlede celler blev anvendt som kontroller. Celler tre gange optøet og frosset, derefter sonikeret (Ultrasonisk bad Branson 1200), blev anvendt som kontrol (døde celler). Efter centrifugering af plader med 96 brønde supernatant blev fjernet. Cellular ATP indhold 1, 2, 4 og 8 timer efter behandling blev bestemt ved at lysere cellerne (30 min), derefter tilsætte 100 pi rl /l reagens og måling lysemissionen ved anvendelse af et luminometer (LUMIstar, Ramcon).

MTS levedygtighedsassay

levedygtighed H69 og SW780 celler behandlet med calcium, med eller uden elektroporering blev bedømt under anvendelse MTS (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (carboxymethophenyl) -2- (4-sulfonyl) -2H-tetrazolium) assay (Cell Titer 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation assay, Promega). MTS-analysen er en kolorimetrisk metode, der anslår hastigheden af ​​stofskiftet i levedygtige celler. Efter behandling 100 pi cellesuspension (2,4 x 10

5 celler /ml) blev podet i plader med 96 brønde. Efter 24 timers inkubation 20 pi MTS /PMS reagens blev tilsat til hver brønd (slutkoncentrationer på 333 ug /ml MTS og 25 uM PMS). Efter 1 times inkubation ved 37 ° C og 5% CO

2 cellelevedygtigheden blev vurderet ved måling af optisk densitet (OD) ved anvendelse Multiscan-Ascent ELISA-læser (ThermoLabsystems, Finland) ved 490 nm med baggrundsmålingerne ved 690 nm.

Montering relationer mellem eksperimentelle parametre og celle overlevelsesdata

data analyse blev udført ved hjælp af MATLAB (Natick, MA, USA) software. Overlevelsen celle (udtrykt som procentdel af kontrol) af H69 og SW780-cellelinier ved 24 timer efter behandlingen blev plottet mod det elektriske felt amplitude ved hver calciumkoncentration overvejes. Den bedst tilpassede kurve blev derefter afledt. Fra beslaget kurver, blev den elektriske feltstyrke (E

50), der kræves for at dræbe mindst 50% af celler ved hver koncentration calcium ekstraheret, for at kvantificere effektiviteten af ​​celledrab af elektroporering i fravær eller i nærvær af calcium.

ATP imaging

Brug konfokal scanning billeddannelse med en Leica TCS SP8 mikroskop, blev ATP indhold efter elektroporation vurderet i U937-celler ved hjælp af fluorescerende farvestof quinacrine (Sigma-Aldrich, USA), en ikke specifik markør med høj affinitet for adeninnukleotider [15]. Fire betingelser blev udforsket: Celler behandlet med 3 mM ekstern calcium; celler udsat for elektroporering pulser (1 kV /cm, 8 × 99 mikrosiemens, 1 Hz); celler udsat for både 3 mM ekstern calcium og elektroporering pulser; og ubehandlede kontrolprøver. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter i vækstmedium indeholdende 10 uM quinacrin, efterfulgt af fremgangsmåden beskrevet i afsnit 2.2 elektroporation protokol. (Samme cellekoncentration anvendes, men køling udelukket, og cellerne blev elektroporeret i 1 mm kuvetter i nærvær af 10 uM propidiumiodid). Umiddelbart efter elektroporering blev cellerne overført til dækning glaskamre til afbildning indeholdende RPMI 1640 medium, 1,6 uM quinacrin og 1,25 uM propidiumiodid (Molecular Probes, USA; en indikator for membran permeabilisering) med 1: 6 fortynding af begge celler og farvestoffer (celle koncentration 1 x 10

6 celler /ml) og til 96-brønds plader for levedygtighed assay. Vi filmede den quinacrine fluorescens 15 minutter efter behandlingen. Fluorescensintensiteten blev målt i 9 billeder pr tilstand. I hvert billede blev fluorescens af tyve tilfældigt udvalgte celler integreres og gennemsnit ved hjælp af MATLAB software (180 celler i alt).

Resazurin levedygtighed assay

levedygtighed U937-celler blev vurderet ved hjælp resazurin assay (Life Technologies , USA) udført 24 timer efter eksponering. Ti mikroliter reagens (Prestoblue, Molecular Probes) blev tilsat til hver brønd indeholdende 90 pi cellesuspension (cellekoncentration 2,4 × 10

5 celler /ml). Efter 1 times inkubation ved 37 ° C og 5% CO

2 blev cellelevedygtighed vurderet ved måling af fluorescens under anvendelse Synergy 2 mikropladelæser (BioTek Instruments, USA).

Statistiske analyser

Forskelle i ATP luminescens intensitet mellem grupper testet med ATP luminescens assay blev valideret og analyseret med en eksponentiel fald model med Bonferroni korrektion ved hjælp af SAS-software (version 9.2). Luminescens værdier log transformeret inden analyse. To-vejs ANOVA (Variansanalyse) med Bonferroni korrektion blev anvendt til at vurdere forskelle i levedygtighed mellem grupper testet med MTS proliferation assay også bruger SAS 9.2-software. T-test blev anvendt til vurdering af forskellene mellem grupper testet med resazurin levedygtighed assay og for filmede grupper analyseret med MATLAB software.

Resultater

Cellular ATP og levedygtighed efter calcium elektroporation

kun calcium (ingen elektroporering).

eksponering af celler for at øge ekstracellulære koncentrationer af calcium i fravær af elektroporation havde ingen tilsyneladende virkning på cellulær ATP niveau eller levedygtighed sammenlignet med kontroller i en af ​​de to cellelinjer (fig 1A og 1B, 2A og 2B)

Cellular ATP-niveauer bestemmes 1, 2, 4 og 8 timer efter calcium elektroporation behandling af to humane cellelinier (H69, en småcellet lungecancer-cellelinie (a).; og SW780, en blærecancer-cellelinie (B)). Ekstracellulære koncentrationer på 0 mM, 1 mM, 3 mM eller 5 mM calcium og anvendte elektriske felt på 0,8 kV /cm, 1,0 kV /cm, eller 1,2 kV /cm. Resultater er illustreret som procent af kontrol (ingen elektroporering, ikke tilsat calcium). . Normaliseres til kontrolværdier ved hvert tidspunkt (%), middelværdi S.A., n = 6.

Levedygtighed, vurderet ved anvendelse MTS assay af H69, en human småcellet lungecancer-cellelinie (A); og SW780, en human blærecancer-cellelinie (B) 24 timer efter behandling med calcium elektroporering. Endelige koncentrationer ekstracellulære calcium af 0 mM, 1 mM, 3 mM eller 5 mM og anvendt elektrisk felt af enten 0,8 kV /cm, 1,0 kV /cm, eller 1,2 kV /cm. Celler tre gange optøet og frosset, så lydbehandledes blev brugt som kontrol (døde celler). Resultater er illustreret som procent af kontrol (ingen elektroporation, ikke tilsat calcium), elektroporation (EP), middelværdi + standardafvigelse, n = 6.

Elektroporation (ingen calcium).

Forøgelse det elektriske felt havde ingen signifikant effekt på ATP indhold H69-celler, når udsætte dem for elektroporering alene (fig 1A). ATP i elektroporerede kun for H69 prøver forøget over tid under inkubation som tidligere observeret [6]. Der var ingen signifikant nedgang i levedygtighed H69 celler behandlet med pulserende elektrisk felt alene (Fig 2A).

Forøgelse af elektriske felt 0,8-1,2 kV /cm ikke havde en signifikant effekt på ATP indholdet af SW780 celler, når udsætte dem for elektroporering alene (fig 1B). Som vist i fig 2B, var der en 28% nedgang i levedygtighed SW780 celler behandlet med 0,8 kV /cm elektrisk felt angiver, at elektroporering alene forårsagede celledød, skønt ikke statistisk signifikant.

Calcium elektroporation-H69 celle ATP . Salg

ATP-niveauer faldt i H69-celler med stigende calciumkoncentrationer og stigende elektrisk felt (fig 1A). Calcium elektroporation hjælp 0,8 kV /cm faldt betydeligt det intracellulære ATP niveau, når det kombineres med 5 mM calcium sammenlignet med ubehandlede kontroller (p 0,05). Ved brug 1,0 kV /cm og 1,2 kV /cm, alle testet calciumkoncentrationer (1, 3, og 5 mM) faldt betydeligt det intracellulære ATP niveau sammenlignet med ubehandlede kontroller og calcium alene (p 0,001). Forøgelse af elektriske felt fra 0,8 til 1,0 kV /cm i calcium elektroporering med 1 mM calcium faldt betydeligt ATP niveau (p 0,05). Yderligere forøgelse af feltet fra 1,0 til 1.2 kV /cm ikke havde nogen yderligere virkning på ATP-niveau.

Calcium elektroporation-H69 cellelevedygtighed.

Som det ses i fig 2A, calcium elektroporation forårsagede signifikant fald i H69 levedygtighed celle for alle testede doser over 1 mM calcium med 0,8 kV /cm (p 0,05). Yderligere stigninger i elektrisk felt eller calcium-koncentration ikke havde en betydelig ekstra effekt på H69 levedygtighed (Fig 2A).

Calcium elektroporation-SW780 celle ATP.

Som vist i figur 1B, 1, 3 eller 5 mM calcium elektroporation faldt betydeligt ATP niveauer i alle puls betingelser sammenlignet med ubehandlede kontroller samt calcium alene (p 0,05). Forøgelse af elektriske felt fra 0,8 til 1,0 kV /cm, og fra 1,0 til 1.2 kV /cm i behandling med 1 mM calcium elektroporering faldt betydeligt ATP niveau (p 0,0001). Tilføjelse calcium i elektroporation procedure signifikant reduceret ATP i alle puls betingelser (p 0,0001)..

Calcium elektroporation-SW780 cellelevedygtighed

Som skematisk vist i figur 2B, calcium elektroporation forårsagede signifikant fald i SW780 cellelevedygtighed for alle testede doser over 1 mM calcium med 0,8 kV /cm (p 0,0001) (fig 2B). Forøgelse af elektriske felt fra 0,8 til 1.2 kV /cm signifikant påvirket SW780 levedygtighed i nærværelse af calcium (p 0,001). Maksimal SW780 celle kill krævede 1,2 kV /cm og 5 mM calcium ført til lavere værdier i MTA analysen end frysning og optøning af cellerne tre gange med efterfølgende lydbehandling (p 0,001).

Montering analyse af celle overlevelsesdata

efter analyse med MATLAB kurvetilpasning værktøj, fandt vi, at den bedst tilpassede funktion for forholdet mellem celleoverlevelse efter 24 timer, og det elektriske felt amplitude på faste calciumkoncentrationer, var en to-parameter eksponentiel funktion,

y (x) = a · exp (-b · x)

hvor

x

er det elektriske felt amplitude og

y (x)

er procentdelen af ​​celleoverlevelse. Resultater på SW780-celler er rapporteret i Fig 3. E

50 parameter ved hver calciumkoncentration betragtede blev ekstraheret under anvendelse af fundet funktion. Resultaterne, der skematisk er angivet i tabel 1 for både H69 og SW780-cellelinien, tilladt os at kvantificere den øgede celledrab effektivitet elektroporering i nærvær af calcium. I begge cellelinier, og for alle calciumkoncentrationer testet, det elektriske felt skal halvere celleoverlevelse ved 24 timer efter behandling i nærvær af ekstracellulært calcium var to- til tre gange lavere end i tilfældet med elektroporering alene. Forskellige responser blev opnået mellem de to cellelinier. Den H69-cellelinjen kræves højere elektrisk felt amplitude (ca. 20%) end SW780 celler for at opnå en reduktion i cellelevedygtighed 50%, med en ekstracellulær koncentration af calciumchlorid fra 1 til 5 mM. Den SW780 cellelinje kan være mere følsomme over for behandling med lave doser af calcium end H69 celler

in vitro

.

Cell overlevelse (%) versus elektrisk felt (E) på calcium elektroporation hjælp 0, 1, 3 eller 5 mM calcium i SW780 humane blære cancerceller vurderet ved anvendelse MTS-assay 24 timer efter behandling. Elektrisk felt amplitude på 0,8 kV /cm, 1,0 kV /cm, 1,2 kV /cm, 1,4 kV /cm, eller 1,6 kV /cm blev anvendt. Montering kurver blev udledt ved hjælp af MATLAB software. Resultaterne er illustreret som procent af kontrol (ingen elektroporation, ikke tilsat calcium), gennemsnit ± SD, n = 6.

Konfokal fluorescens billeddannelse af ATP og permeabilitet

Vi brugte konfokal fluorescens billeddannelse af quinacrin-mærkede celler for at undersøge ændringer i intracellulære niveauer og distribution af ATP [27-30]. Figur 4 viser udvalgte repræsentative billeder taget 15 minutter efter behandlingen. Den gennemsnitlige quinacrin fluorescens af calcium elektroporerede prøver var omkring 30% lavere end i calcium-only prøver (p 0,0001), vist skematisk i fig 5A. Det elektriske felt er nødvendig for at dræbe halvdelen af ​​cellerne (E

50) under de udforskede betingelser i nærvær af 3 mM calcium, blev anslået til 0,70 kV /cm.

U937, en human leukæmicellelinie. Endelige ekstracellulære calcium klorid koncentrationer på 0 mm eller 3 mm, og anvendte elektriske felt på 1,0 kV /cm. Quinacrine fluorescens (øverste række), 10 uM; propidiumiodid fluorescens (midterste række), 7,5 uM; fase kontrast celle billeder (nederste række).

U937, en menneskelig leukæmi cellelinje. (A) Cellulær quinacrine fluorescensintensitet på U937 15 min efter calcium elektroporering. Den ekstracellulære quinacrin koncentration var 10 pM under læsning og elektroporering. Slutkoncentrationer ekstracellulære calcium på 0 mm eller 3 mm, og anvendte elektriske felt på 1,0 kV /cm blev anvendt. Kolonner afbilder gennemsnittet af 180 celler (9 eksperimenter × 20 celler). Arbitrære enheder (AU), betyder + S.D., n = 9. (B) U937 cellelevedygtighed målt 24 timer efter calcium elektroporering. Levedygtighedsprocenten for U937 hjælp resazurin celleproliferationsassay. Ekstracellulære koncentrationer af 0 eller 3 mM calcium. Anvendt elektrisk felt på 1,0 kV /cm. Resultater er illustreret som procent af kontrol (ingen elektroporation, ikke tilsat calcium), betyder + SD, n = 6.

permeabilisering af U937-celler, der er markeret ved tilstrømning af propidiumiodid blev forsinket og mere uregelmæssig efter calcium elektroporation forhold til elektroporation uden calcium (figur 4).

Vi observerede også morfologiske ændringer i calcium elektroporerede celler uregelmæssigt udviser kompromitteret membran integritet, blæredannelse, svind, eller uregelmæssig celle form (figur 4).

Resazurin levedygtighedsassay

resultaterne af levedygtighedsassayet (fig 5B) af U937-celler viser, at der var mere levedygtige celler i prøven behandlet med calcium alene end i calcium-elektroporeret prøve (p 0,0001).

diskussion

Denne undersøgelse udforsker respons i cellulære ATP-niveau og levedygtighed på forskellige elektroporation parametre og calcium-koncentrationer for calcium elektroporation behandling. Både H69 og SW780 cellelinier viste et dosisafhængigt fald i cellulær ATP og levedygtighed med stigende elektrisk felt sammen med stigende calciumkoncentration (Fig 1A og 1B). Resultaterne ikke fuldt afdække, om behandling kan optimeres i henhold til individuel cellelinje følsomhed. Resultaterne viste, at H69-cellelinjen kræves en høj elektrisk felt for at inducere maksimale ATP depletion (Fig 1A) og celle-drab (fig 2A).

Forskellen mellem svarene fra de to cellelinier til udforskes parametre for calcium koncentration og elektrisk felt kan delvis forklares med forskel i cellestørrelse. Den cellulære respons på calcium elektroporation er mindre afhængig af cellestørrelse

in vivo

grund af en generel mangel på ekstracellulære rum, der påvirker cellerne evnen til at “skjule” fra puls eksponering [31], en grund til, at

in vitro

resultaterne på tærskler ikke nødvendigvis forudsige in vivo-effektivitet.

Calcium elektroporering forårsagede en signifikant kortsigtet reduktion i quinacrine fluorescens i U937-celler, hvilket kan tyde ATP depletion, og behandlingen faldt betydeligt celle levedygtighed efter 24 timer. Flere systematiske undersøgelser at følge kunne bruge en ATP-specifikt assay, såsom luminescens fra luciferin-luciferase.

Irreversible elektroporering (IRE) er en procedure, hvor cellerne udsættes for elektrisk felt parametre stærke nok til at inducere permanent skade af cellemembranen, i sidste ende fører til forstyrret ion homeostase og celledød [14]. IRE forårsager væv ablation med lavere behandling effektivitet i marginen af ​​det målrettede væv, hvor det elektriske felt intensitet er lavest. Evnen til at opnå højere celle dræbe og forårsage væv ablation når øge det elektriske felt er baggrunden for at bruge IRE til kræftbehandling [13], og er i øjeblikket anvendes til behandling af renal [32], hepatiske [33] og pancreas tumorer [34 ], og potentielt for prostata [35] og intrakranielle tumorer [36]. Vi har fundet, at forøgelse af ekstracellulært calcium koncentrationen under elektroporering inducerer større celledrab, hvilket indebærer, at tilsætning af calcium, selv i lave doser, potentielt kunne forbedre den terapeutiske virkning af IRE i nedre områder intensitet målvævet, som resultaterne i tabel 1 demonstrerer . Derfor tilføjer calcium til IRE proceduren kunne potentielt øge behandlingen radius og virkning.

IRE og elektroporering anvendes i kombination med kemoterapeutiske lægemidler er ved at vinde generel anerkendelse som en behandlingsmodalitet for massive tumorer, og anvendes som palliativ behandling for patienter, der er uegnede til operation (NICE klinisk retningslinje 446, March 2013 [2,9-11]). Calcium elektroporation har vist sammenlignelige i effektivitet til at electrochemotherapy

in vitro

[7], og er i øjeblikket undergår den første noninferioritet klinisk forsøg til behandling af kutant metastaser (ClinicalTrials.gov-ID NCT01941901). Effektiviteten af ​​calium elektroporering som en ny cancer behandlingsmodalitet er også ved at blive undersøgt til behandling af tumorer i indre organer [37,38].

Tidligere studier, der undersøger calcium elektroporation har vist, at behandlingen påvirker cellulær ATP og levedygtighed [ ,,,0],6]. Denne undersøgelse bekræfter, at teorien med en demonstration af dosis-afhængighed, og yderligere understøtter brugen af ​​calcium som et effektivt og billigt alternativ til kemoterapeutika i elektroporation procedurer.

Så vidt vi ved forholdet mellem calcium koncentration og elektrisk felt i calcium elektroporation behandling af cancerceller er ikke tidligere blevet undersøgt. Vores data viser, at calcium elektroporation er effektiv med reducerede elektriske felter, hvis koncentrationen af ​​calcium øges. Mere forskning er nødvendig for fuldt ud at forstå, hvordan denne roman kræftbehandling modalitet fremkalder celledød og den rolle, som ATP udtynding og afbrydelse af calcium homeostase spiller i den terapeutiske virkning af calcium elektroporation.

Konklusioner

virkningen af ​​calcium elektroporation er påvirket af individuelle cellelinie svarene og afhænger både af calciumkoncentration og elektrisk felt amplitude. Undersøgelsen viser, at calcium elektroporering reducerer cellulær ATP og cancer celleoverlevelse betydeligt. Resultaterne understøtter yderligere anvendelsen af ​​calcium elektroporation som en terapeutisk modalitet i behandlingen af ​​kræft, samt muligheden for at sænke den anvendte elektriske felt i fremtidige forsøg med elektroporation.

Tak

Forfatterne takker Olga Pakhomova for at stille faciliteter til resazurin levedygtighed assay, og tak Marianne Fregil for at levere fremragende teknisk bistand.