PLoS ONE: TRPV6 Bestemmer Effekt af vitamin D3 på prostatakræft cellevækst

​​

Abstrakt

På trods af bemærkelsesværdige fremskridt i behandlingen og forebyggelsen af ​​prostatakræft er det stadig den anden dødsårsag af kræft i de industrialiserede lande. Mange terapier oprindeligt vist at være gavnlig for patienterne blev opgivet på grund af den høje modstand lægemiddel og udviklingen hastigheden af ​​tumorerne. En af de potentielle terapeutiske agenter endda brugt i den første fase kliniske studier, 1,25-dihydroxyvitamin D3, viste sig at være enten uforudsigelig eller ineffektiv i mange tilfælde. Vi har allerede vist, at TRPV6 calcium kanal, som er det direkte mål for 1,25 dihydroxyvitamin D3-receptoren, positivt styrer prostatakræft proliferation og apoptose modstand (

Lehen’kyi et al.

, Oncogene, 2007). Men hvordan de kendte 1,25 dihydroxyvitamin D3 antiproliferative virkninger kan være forenelig med opregulering af pro-onkogen TRPV6 kanal forbliver et mysterium. Her demonstrerer vi, at 1,25-dihydroxyvitamin D3 i lav steroid betingelser opregulerer ekspressionen af ​​TRPV6, enchances proliferationen ved at øge antallet af celler, der indgår i S-fase. Vi viser, at disse pro-proliferative virkninger af 1,25-dihydroxyvitamin D3 er direkte medieres via overekspression af TRPV6 kanal, som øger calcium optagelse i LNCaP-celler. Den apoptose modstand androgenafhængige LNCaP celler knyttet TRPV6 kanal er drastisk inversed når 1,25 dihydroxyvitamin D3 effekter blev kombineret med den succesfulde TRPV6 knockdown. Desuden anvendelsen af ​​androgen-deficient DU-145 og androgen-ufølsom LNCaP c4-2 cellelinier tilladt antyder, at evnen for 1,25 dihydroxyvitamin D3 til at inducere ekspressionen af ​​TRPV6 kanal er en afgørende faktor for succes eller fiasko for 1,25 dihydroxyvitamin D3-baserede terapier

Henvisning:. Lehen’kyi V, Raphaël M, Oulidi A, Flourakis M, Khalimonchyk S, Kondratskyi A, et al. (2011) TRPV6 Bestemmer Effekt af vitamin D3 på prostatakræft cellevækst. PLoS ONE 6 (2): e16856. doi: 10,1371 /journal.pone.0016856

Redaktør: Janine Santos, University of Medicine og Dentistry of New Jersey, USA

Modtaget: September 15, 2010; Accepteret: 16 Januar 2011; Udgivet: 11 februar 2011

Copyright: © 2011 Lehen’kyi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Ministère de l’Education nationale et Ligue nationale Contre le Cancer. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er stadig den mest almindelige noncutaneous menneskelig malignitet og den anden mest dødbringende tumor blandt mænd med den højeste forekomst i industrialiserede lande [1]. Androgenreceptoren og andre steroider regulerer vigtige aspekter af prostata cellulær vækst og funktion, herunder proliferation, differentiering, apoptose, lipidmetabolisme, og sekretorisk indsats [2]. Androgen suppression har været den førende behandling og i øjeblikket den mest succesfulde [3]. Men prostata karcinom i sidste ende blive androgen-uansvarlige, og kræften er refraktære over for hormonbehandling -. Den vigtigste årsag til prostatakræft dødelighed [4]

Forskellige nukleare receptorer er blevet målrettet til terapi og blandt dem en, 25-dihydroxyvitamin D3, som udøver en lang række antitumoraktiviteter mod dyrkede prostatacancerceller og xenotransplantater [5]. Normale og maligne prostata-epitelceller udtrykker vitamin D3-receptoren (VDR), og aktivering af VDR af 1,25-dihydroxyvitamin D3 generelt resulterer i hæmning af proliferation og cellecyklusstop [6]. Men for at forebygge eller behandle prostatacancer, skal overvejes interaktionerne mellem andre nukleare receptorer og signalvejen [7].

Funktionen af ​​ionkanaler er blevet diskuteret i relation til proliferation og apoptose. For nylig butikken drives Ca

2 + kanaler og Ca

2+ pool i det endoplasmatiske reticulum er også blevet relateret til udvikling af prostatacancer [8]. Proliferation af prostata cancer cellelinjer LNCaP og PC3 blev hæmmet af TH-1177, et stof, som blokerer Ca

2 + post [9]. Ændringer i Ca

2+ pool og cytosol Ca

2+ er ikke kun blevet beskrevet for at øge udbredelsen og sarcoendoplasmatic Ca

2 + -ATPase (SERCA) udtryk i LNCaP celler [10], men også til at fremkalde apoptose [11]. Således Ca

2+ homøostase er kritisk involveret i kræft udvikling og progression.

Vores opmærksomhed er blevet tegnet af den observation, at en forbigående receptor potentiel meget Ca

2 + -selektiv kanal underfamilie V medlem 6, er TRPV6 stærkt til udtryk i fremskreden prostatacancer og væsentligt korrelerer med Gleason 7 grading repræsenterer en stærk markør for tumorprogression og efterfølgende invasion ind i de sunde væv [12], [13]. Vi har tidligere vist, at TRPV6 former stærkt calcium selektive kanaler i prostataceller, hvis aktuelle amplitude og inaktivering adfærd er stramt reguleret af den intracellulære calciumkoncentration [10], [14]. Udover vi allerede har vist, at TRPV6 kanal er involveret i kontrollen af ​​prostatacancer proliferation og apoptose resistens [15]. Men den nøjagtige rolle TRPV6 i prostata patofysiologi forbliver uvirkelig, og dens regulering af androgen – contradictive [16]. Desuden VDR er en direkte aktivator af

trpv6

promotor [17], og 1,25-dihydroxyvitamin D3 en meget anvendt anticancer behandling har gennemført en spændende hypotese for TRPV6 regulering og betydning i prostatakræft. Vores undersøgelser var baseret på det faktum, at 1,25-dihydroxyvitamin D3, der allerede anvendes i den første fase af kliniske forsøg viste sig at være enten uforudsigelig eller ineffektiv i mange tilfælde, og det faktum at TRPV6 som positivt styrer prostatakræft proliferation og apoptose resistens [15] er et direkte mål for 1,25 dihydroxyvitamin D3 [17]. Spørgsmålet hvordan de kendte 1,25 dihydroxyvitamin D3 antiproliferative virkninger kan være forenelig med opregulering af pro-onkogen TRPV6 kanal var formålet med vores undersøgelse.

Materialer og metoder

Cell kultur

Humant LNCaP (lymfeknude kræft i prostata), blev LNCaP c4-2, og DU-145-cellelinier opnået fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket i RPMI-medium (Gibco-BRL, CergyPontoise, Frankrig ) suppleret med 10 eller 2% føtalt kalveserum (FCS) og indeholdende kanamycin (100 pg /ml) og L-glutamin (2 mM). Celler blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO

2 i luft. Mediet blev skiftet tre gange om ugen, og kulturer blev opdelt ved behandling af cellerne med 0,25% trypsin (i PBS) i 5 minutter ved 37 ° C, før de når konfluens. Til eksperimenterne blev celler podet i 6-brønds plader for PCR og western-blotting og onto dækglas til immunocytokemi og calcium imaging. For 1,25-dihydroxyvitamin D3 blev undersøgelser celler behandlet med EtOH som en kontrol for 1,25-dihydroxyvitamin D3. Kul-stribet føtalt kalveserum (2%) blev tilsat til phenolrødtfrit RPMI-medium sammen med kanamycin og L-glutamin som ovenfor for at inkubere cellerne for at skabe steroid-berøvet betingelser.

RT- PCR

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse ekstraktionsproceduren thiocyanat-phenol-chloroform guanidium. Efter DNase I (Life Technologies) behandling for at fjerne genomisk DNA blev 2 ug totalt RNA revers transkriberet til cDNA ved 42 ° C under anvendelse af tilfældige hexamerprimere (Perkin Elmer) og MuLV revers transkriptase (Perkin Elmer) i et 40 pi slutvolumen, efterfulgt af real time kvantitativ PCR.

kvantitativ realtids-PCR

kvantitativ realtids-PCR af TRPV6 og HPRT-mRNA-transkripter blev udført ved anvendelse MESA GREEN qPCR MasterMix Plus for SYBR Assay (Eurogentec, Frankrig ) på Biorad CFX96 Real-Time PCR Detection System. Sekvenserne af primerne er vist i tabel 1. HPRT-genet blev anvendt som en endogen kontrol for at normalisere variationer i RNA-ekstraktioner, graden af ​​RNA-nedbrydning, og variabilitet i RT effektivitet. For at kvantificere de resultater, vi brugte den sammenlignende tærskel cyklus metode ΔΔC (t)

Western-blotting

semikonfluent LNCaP celler blev behandlet med en iskold lysis buffer indeholdende:. 10 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl, 1 mM PMSF, 1% Nonidet P-40, og protease inhibitor cocktail fra Sigma. Lysaterne blev centrifugeret 15.000 x g ved 4 ° C i 20 minutter, blandes med en prøve buffer indeholdende: 125 mM Tris-HCI pH 6,8, 4% SDS, 5% β-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0,01% bromphenolblåt, og kogt i 5 minutter ved 95 ° C. Totale proteinprøver blev underkastet 8, 10, og 15% SDS-PAGE og overført til en nitrocellulosemembran ved halvtørre Western blotting (Bio-Rad Laboratories). Membranen blev blokeret i 5% mælk med TNT-buffer (Tris-HCI, pH 7,5, 140 mM NaCl og 0,05% Tween 20) natten over, derefter probet med specifikt rabit polyklonalt anti TRPV6 antistof (Alomone Labs Ltd., 1/200) , anti-PCNA (Santa-Cruz, 1/1000), anti-β-actin (Lab Vision Co, 1/1000) antistoffer. Båndene på membranen blev visualiseret under anvendelse forøget kemiluminescens-metoden (Pierce Biotechnologies Inc.). Densitometrisk analyse blev udført under anvendelse af en Bio-Rad billede erhvervelse systemet (Bio-Rad Laboratories).

Immuncytokemi

Cellerne dyrkes på dækglas blev vasket en gang med PBS og eventuelt inkuberet med koleratoksin-underenhed B Alexa Fluor® 488 konjugat (Molecular Probes, 1/2000) i 15 min, derefter vasket en gang med PBS og fikseret i 3,5% paraformaldehyd i PBS. PBS-glycin (30 mM) blev anvendt for at standse reaktionen med efterfølgende permeabilisering med 0,1% Triton X-100. Cellerne blev vasket igen i PBS og underkastet konventionel procedure immunfarvning. Alexa Fluor® 546 gede-anti-kanin IgG (Molecular Probes, 1/4000) blev anvendt som et sekundært antistof til TRPV6 farvning. Fluorescens analyse blev udført under anvendelse Carl Zeiss Laser Scanning Systems LSM 510 forbundet til et Zeiss Axiovert 200 M med 63 × 1,4 numerisk apertur olieimmersionslinse linse ved stuetemperatur. Begge kanaler var begejstrede opsamlet separat og derefter fusioneret ved hjælp af software Carl Zeiss LSM billede Examiner.

Cell spredning

Cell proliferation blev målt ved hjælp af CellTiter 96 Vandig One Solution celleproliferationsassay (Promega, Madison , WI), på grundlag af den cellulære omdannelse af den kolorimetriske reagens MTS [3,4- (5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium salt] i opløseligt formazan ved dehydrogenaseenzymer findes kun i metabolisk aktive, prolifererende celler. Efter hver behandling blev 20 pi farveopløsning tilsat til hver brønd i 96-brønds plade og inkuberet i 2 timer. Efterfølgende absorbans blev registreret ved 490 nm bølgelængde under anvendelse af en ELISA-pladelæser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Cellular spredning hæmning beregnes som: (

A

control-

A

sample)/(

A

control-

A

blank)×100%.

Cell cyklus og apoptoseassays

flowcytometri assays blev udført på cellepopulationer dyrket i tre eksemplarer 25-cm

2 kolber som oprindeligt beskrevet [18]. Ca. 10

6 celler blev fikseret med 1 ml iskold 70% methanol i 30 min. Efter fiksering blev celler pelleteret ved centrifugering for at fjerne fikseringsmidler, vasket tre gange med phosphatbufret saltvand (PBS) ved 4 ° C, resuspenderet i 100 pi PBS, behandlet med 100 pi RNAse A (1 mg /ml, Sigma), og farvet med propidiumiodid (PI, Sigma) i en endelig koncentration på 50 pg /ml. De farvede celler blev opbevaret ved 4 ° C i mørke og analyseret inden 2 timer. De farvede prøver blev målt på et FACScan flowcytometer (Becton-Dickinson, San Jose, CA). Data blev erhvervet for 7000 arrangementer med en variationskoefficient på mindre end 5%, og rød fluorescens blev målt ved hjælp af en fluorescensdetektor 3 (FL3) på

X

-aksen. Dataene blev opbevaret og analyseret ved hjælp CellQuest software til at vurdere celle-cyklus distributionsmønstre (subG1 (apoptotiske), G0 /G1, S og G2 /M faser).

Calcium Imaging

Celler blev udpladet på dækglas og blev fyldt med 4 pM Fura-02:00 ved stuetemperatur i 45 minutter i vækstmediet. Optagelser blev udført i HBSS indeholdende (i mM): 140 NaCl, 5 KCI, 2 MgCl

2, 0,3 Na

2HPO

3, 0,4 KH

2PO

4, 4 NaHCO

3, 5 glucose og 10 HEPES justeret til pH 7,4 med NaOH. CaCl

2 blev indstillet til 0,07 mM eller 1,8 mM afhængig af eksperimentet. Dækglassene blev derefter anbragt i en perfusion kammer på scenen af ​​mikroskopet. Fluorescensbilleder af cellerne blev optaget med et video billedanalysesystem (Quanticell). Fura-2-fluorescens, ved emissionsbølgelængde på 510 nm, blev indspillet af spændende sonden alternativt ved 340 og 380 nm. Signalet ratio på 340/380 nm blev omdannet til [Ca

2 +]

I-niveau ved hjælp af en

in vitro

kalibrering.

siRNA celle transfektion

LNCaP-celler blev transficeret natten over med 200 nM siRNA-TRPV6 1 og 2 pr brønd af en seks-brønds plade under anvendelse af “Gene porter 2” (Gene Therapy Systems, Inc.) i et slutvolumen på 1 ml. Klar-til-brug siRNA-TRPV6s (forarbejdning option: A4) blev syntetiseret af Dharmacon Research Inc (Lafayette, USA) (se tabel 1)

Reagenser

Alle reagenser blev købt fra Sigma. (Sigma, L’Isle d’Abeau Chesnes, Frankrig), medmindre andet er angivet.

Statistik

data blev udtrykt som gennemsnit ± SD. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Students uparrede

t

-tests. * – P 0,05 eller ** – P 0,01 indikerer statistisk signifikans

Resultater

Effekten af ​​1,25-dihydroxyvitamin D3 på prostatakræft celledeling er blevet undersøgt i to eksperimentelle betingelser. : 2% og 10% føtalt kalveserum (FCS) -supplemented RPMI-medium. Væksten af ​​androgen-afhængige LNCaP-cellelinje blev overraskende forøget med 100 nM 1,25-dihydroxyvitamin D3 i 2% FCS suppleret medium og undertrykt i 10% FCS (fig. 1A). Vi har allerede vist rolle TRPV6 kanal i spredning af prostata cancer celler [15], og derfor har vi forsøgt at undersøge reguleringen af ​​TRPV6 kanal udtryk ved 1,25-dihydroxyvitamin D3. Da det er påvist, at

trpv6

er et VDR-reguleret gen [17], har vi undersøgt reguleringen af ​​TRPV6 udtryk ved 1,25-dihydroxyvitamin D3 i LNCaP celler i forskellige steroid indhold af medierne (Fig . 1B, C). 1,25-dihydroxyvitamin D3 synes at direkte aktivere

trpv6

gen i LNCaP celler, men i 10% FCS medium dens virkninger var ikke så signifikant (fig. 1B) end i 2% FCS (Fig. 1C) . 1,25-dihydroxyvitamin D3 signifikant dosisafhængigt forøget TRPV6 mRNA-ekspression i 2% FCS-holdigt RPMI-medium (fig. 1C). At kontrollere, om formindskede virkninger af 1,25-dihydroxyvitamin D3 skyldtes FCS indhold og ikke i den optimale virkning gang vi udførte tidskurven hjælp den maksimale koncentration på 100 nM over tre dage med forskellige tidsintervaller (fig. 1d). For at bekræfte signifikant induktion af TRPV6 protein ved 1,25-dihydroxyvitamin D3 i 2% FCS indeholdende RPMI medium opnået ved real time kvantitativ PCR en western-blotting blev udført. Den viste en betydelig stigning i TRPV6 proteinniveauet ved aktivering med 100 nM 1,25-dihydroxyvitamin D3 (fig. 1E). Immuncytokemi ved anvendelse TRPV6 specifikt antistof viste ekspressionen af ​​TRPV6 kanaler i LNCaP-celler (fig. 1F) samt dens lokalisering på plasmamembranen ved hjælp koleratoksin (CTX) konjugeret med FITC mærkning specifikt G2M lipider i membranen. Derfor virkningerne af 1,25-dihydroxyvitamin D3 på væksten af ​​androgenafhængige LNCaP-celler afhænger af den relative steroid indhold. Desuden, 1,25-dihydroxyvitamin D3 øger ekspressionen af ​​TRPV6 kanal i lav-steroid betingelser.

A, 1,25-dihydroxy-vitamin D3 virkninger på proliferationshastighed målt ved MTS-assay af LNCaP-celler inkuberet med enten 2 % eller 10% FCS-holdigt RPMI-medium, * – P 0,05, ** – P 0,01, sammenlignet med deres respektive kontroller (DMSO), n = 3. B, opregulering af TRPV6 mRNA-ekspression af 1,25- dihydroxyvitamin D3 i LNCaP-celler dyrket i 10% FCS-holdigt RPMI-medium; * – P 0,05, sammenlignet med kontrol (DMSO), n = 3. C, opregulering af TRPV6 mRNA-ekspression af 1,25-dihydroxyvitamin D3 i LNCaP-celler dyrket i 2% FCS-holdigt RPMI-medium; * – P 0,05, ** – P 0,01, sammenlignet med kontrol (DMSO), n = 3. D, Tiden afhængighed af TRPV6 udtryk under 100 uM 1,25-dihydroxyvitamin D3 behandling i LNCaP celler inkuberet i 10 % FCS-indeholdende RPMI-medium. * – P 0,05, ** – P 0,01, sammenlignet med kontrol (DMSO), n = 3. E, et western-blotting af TRPV6 proteinniveauer induceret af 1,25-dihydroxyvitamin D3 behandling i 3 dage i LNCaP-celler inkuberet i 2% FCS-holdigt RPMI-medium. F, A konfokal mikroskopi viser mønstret af TRPV6 proteinekspression og lokalisering på plasmamembran LNCaP-celler dyrket i 2% FCS-holdigt RPMI-medium. Kolera toksin konjugeret til FITC (CTX, grøn), der anvendes til at farve plasmamembranen samt TRPV6 kanal (TRPV6, rød), og deres respektive merge (CTX + TRPV6) er vist.

TRPV6 er involveret in1,25-dihydroxyvitamin D3 proliferation af LNCaP celler

Ifølge de data opnået over virkningerne af 1,25-dihydroxyvitamin D3 i 2% FCS blev yderligere undersøgt. Da vi allerede har demonstreret rolle TRPV6 kanal i spredning af prostata cancer celler [15], og vide, at der ikke er nogen kemisk forbindelse til rådighed hidtil selektivt blokerer TRPV6, brugte vi siRNA tilgang til selektivt knockdown TRPV6. Tre forskellige metodiske tilgange blev anvendt til at vurdere proliferation af LNCaP-celler i 2% FCS-holdigt medium (fig. 2A-C). Antallet af levedygtige prolifererende celler blev målt ved MTS assay. siRNA-TRPV6 faldt betydeligt antallet af prolifererende celler fra dag 2 til 4 efter transfektion (D0) (fig. 2A). 100 nM 1,25-dihydroxyvitamin D3 var i stand til at øge udbredelsen af ​​LNCaP celler mens TRPV6 knockdown inverteret denne stimulation til niveauet endnu lavere end i kontrol. siRNA mod androgen receptor (AR), der vides at være afgørende for prostata vækst og udvikling, blev anvendt som en positiv kontrol for at opnå stærke og pålidelige virkning på prostata cellelevedygtighed.

A, LNCaP celler proliferation i 2% FCS holdigt RPMI-medium behandlet med 1,25-dihydroxyvitamin D3 (100 nM, påført ved D1), siRNA-TRPV6 (siTRPV6, 80 nM, transficeres i D0), den kombinerede behandling af 1,25-dihydroxyvitamin D3 og siTRPV6 specificeret ovenfor, og siRNA-AR (Siar, 80 nM, transficeres ved D0) som en positiv kontrol. * – P 0,05, ** – P 0,01, sammenlignet med kontrol, n = 4; B, en celle cyklus analyse af LNCaP-celler (inkuberet med 2% FCS-holdigt RPMI medium) for de samme betingelser som i MTS assay (A) (D3 lig med 100 nM 1,25-dihydroxyvitamin D3), udføres ved flowcytometri af cellerne farvet med propidiumiodid. * – P 0,05, ** – P 0,01, § – P 0,05 over Vitamin D3; n = 3. C, et western-blotting af prolifererende cellekerneantigen (PCNA) i de angivne betingelser ovenfor sammenlignet med p-actin. D, en apoptose-assay udført ved flowcytometri som subG1 population af LNCaP-celler dyrket i 2% FCS-holdigt RPMI-medium farvet med propidiumiodid. * – P 0,01 over for kontrol; n = 3.

En celle cyklus under anvendelse af propidiumiodid-farvning blev udført for at præcis virkningerne af TRPV6 knockdown samt 1,25-dihydroxy-vitamin D3 virkninger og den rolle TRPV6 deri, på cellecyklus fasefordeling af LNCaP-celler dyrket i 2% FCS indeholdende RPMI-medium (fig. 2B). Bekræftede vi faktisk, at siRNA-TRPV6 faldt antallet af celler, der optages i S-fasen. Procentdelen af ​​cellerne er optaget i S-fase var signifikant højere i 100 nM 1,25-dihydroxyvitamin D3 behandlede celler end i kontrol. Pretransfection af LNCaP celler med siRNA-TRPV6 svækket 1,25-dihydroxyvitamin D3 øget spredning, dog ikke i fuldt omfang. siRNA-AR som ovenfor blev anvendt som en positiv kontrol og viste et betydeligt fald i% af cellerne er optaget i S-fasen.

Vi overvåges også et protein niveau af prolifererende cellekerneantigen (PCNA) under anvendelse af samme betingelser. PCNA syntes at være faldet betydeligt på siRNA-TRPV6 knockdown. 1,25-dihydroxyvitamin D3-behandlede celler udtrykte 2 gange mindre PCNA som blev også observeret ved den kombinerede behandling af siRNA-TRPV6 og 100 nM 1,25-dihydroxyvitamin D3. Niveauet af PCNA i siRNA-AR-behandlede celler var ikke påviselig (fig. 2C).

En celle cyklus assay også tillader måling af et antal af apoptotiske celler som subG1 population blev anvendt. 100 nM 1,25-dihydroxyvitamin D3 havde nogen indflydelse på selve apoptose, hvorimod siRNA-TRPV6 havde signifikant effekt på apoptose sats (fig. 2D). Imidlertid kombinere behandlingen af ​​100 nM 1,25-dihydroxyvitamin D3 med transfektion af siRNA-TRPV6 steg signifikant antallet af apoptotiske celler meget mere end siRNA-TRPV6 forbehandling alene (fig. 2D). Således er TRPV6 involveret i både spredning og apoptose modstand LNCaP celler og virkningerne af 1,25-dihydroxyvitamin D3 er stærkt afhængige af TRPV6 udtryk.

TRPV6 medierer 1,25-dihydroxyvitamin D3-induceret Ca

2 + -uptake i LNCaP celler

for at studere bidrag TRPV6 som en højt Ca

2 + -selektiv kanal til Ca

2 + -uptake i LNCaP celler, vi målte intracellulær calcium ([Ca

2 +]

i) i LNCaP celler dyrket i 2% FCS indeholdende RPMI medium efter deraf følgende ændringer i ekstracellulære calcium niveauer ([Ca

2 +]

o). I kontrol celler behandlet med EtOH (CTRL) variationen i [Ca

2 +]

o producerede betydelige ændringer i [Ca

2 +]

i (fig. 3A). siRNA-TRPV6 knockdown faldt amplituden af ​​2 mM [Ca

2 +]

o-fremkaldte stigning i [Ca

2 +]

I (fig. 3A og C). 100 nM 1,25-dihydroxyvitamin D3 steget med sig selv basal [Ca

2 +]

jeg betydeligt samt øget [Ca

2 +]

i respons på anvendelse af 2 mM [Ca

2 +]

o som blev fuldstændig vendt ved forbehandling med siRNA-TRPV6 (fig. 3C). Disse data indikerer, at TRPV6 konstitutivt medierer Ca

2 + -uptake i LNCaP celler og TRPV6 også tegner sig for 1,25-dihydroxyvitamin D3-medieret forbedret Ca

2 + -uptake.

A, TRPV6 involvering i Ca

2+ optagelse i LNCaP celler dyrket i 2% FCS-holdigt RPMI medium og behandlet enten med SICT (CTRL) eller siRNA-TRPV6 (begge 80 nM, 24 timer). B, Ca

2+ optagelse i LNCaP celler dyrket i 2% FCS-holdigt RPMI medium og under 1,25-dihydroxyvitamin D3 (100 nM, 3 dage) behandlet med enten SICT (CTRL) eller siRNA-TRPV6 (begge 80 nM, 24 timer). C, en tilsvarende histogram viser relativ [Ca

2 +]

i niveauer efter deraf [Ca

2 +]

o afbrydere i de betingelser som angivet ovenfor. * – P 0,05 (sammenlignet med kontrol); ** – P 0,01, n = 140.

Virkningerne af 1,25-dihydroxyvitamin D3 på forskellige androgen-uafhængige cellelinjer

To forskellige androgen-uafhængige cellelinjer var anvendes: en androgen receptor-deficient DU-145 og androgen-ufølsom LNCaP c4-2 cellelinier. Celler blev dyrket under de samme betingelser i 2 eller 10% FCS suppleret RPMI-medium og virkningerne af 1,25-dihydroxyvitamin D3 blev undersøgt (fig. 4). Virkningerne af 1,25-dihydroxyvitamin D3 på androgen receptor deficient DU-145-cellelinie sandsynligvis ville være serum-afhængige eftersom i 2% FCS de proproliferative virkninger af 1,25-dihydroxyvitamin D3 blev konserverede (Fig 4A), mens der i 10 % FCS dens virkninger blev afskaffet (fig. 4B). Den anden cellelinie ufølsom over for steroider, men stadig udtrykker androgenreceptoren, LNCaP c4-2 blev anvendt, hvor virkningerne af 1,25-dihydroxyvitamin D3 blev vist at være FCS-uafhængig og 100 nM 1,25-dihydroxyvitamin D3 udøvet sin stærke anti-proliferative virkninger (fig. 4C-D). En tidstro kvantitativ PCR blev udført som viser reguleringen af ​​TRPV6 ekspression i DU-145-celler med 100 uM 1,25-dihydroxyvitamin D3 i både 2 og 10% FCS-holdigt medium (fig. 4E). Steroid-berøvet betingelser i tilfælde af LNCaP-celler (LNCaP-ST) blev også anvendt til at bekræfte, at induktionen af ​​TRPV6 ekspression afhænger meget af steroid indhold af dyrkningsmediet (fig. 4F). Således pro-proliferative virkninger af 1,25-dihydroxyvitamin D3 på væksten af ​​PCA-celler bestemmes ved dets evne til at inducere ekspressionen af ​​TRPV6 kanal og dens induktion synes at være stærkt steroid-afhængig.

A, B, virkningerne af 1,25-dihydroxyvitamin D3 på androgen receptor-mangelfuld DU-145 cellelinje i både 2 og 10% FCS-holdigt RPMI medium (A og B, henholdsvis), * – P 0,05 (sammenlignet med kontrol ), n = 3. C, D, virkningerne af 1,25-dihydroxyvitamin D3 på androgen-ufølsom LNCaP c4-2 cellelinje i både 2 og 10% FCS-holdigt RPMI medium (C og D, henholdsvis), * – P 0,05 (sammenlignet med kontrol), n = 3. E, de relative ekspressionsniveauer af TRPV6 kanal i DU-145-celler behandlet med 100 uM 1,25-dihydroxyvitamin D3 i 3 dage i 2 og 10% FCS-holdigt RPMI medium, * – P 0,05 (sammenlignet med kontrol), n = 3. F, ekspressionen af ​​TRPV6 kanal induceret af 100 nM 1,25-dihydroxyvitamin D3 i 3 dage i LNCaP-celler i steroid-berøvet RPMI-medium (LNCaP- ST), n = 3.

diskussion

En af de vigtigste fund af det nuværende arbejde er, at 1,25-dihydroxyvitamin D3 kan øge udbredelsen af ​​LNCaP celler. Vi har klart vist, at både proliferation og antallet af cellerne kommer ind i S-fasen er forøget ved 1,25-dihydroxyvitamin D3-behandling. Disse virkninger fuldstændigt afhængig af ekspressionen og funktionen af ​​TRPV6 kanal, som tidligere er blevet vist at være impliceret i prostata cancervækst og apoptose-resistens [15]. En tidligere rapporteret 1,25-dihydroxyvitamin D3 antiproliferativ aktivitet i prostatakræft kan kompromitteres af TRPV6 opregulering.

En række værker har allerede offentliggjort TRPV6 induktion af 1,25-dihydroxyvitamin D3 i tarmen [19], nyre [20], halvrund kanal [21], og selv prostatacancerceller [22]. Fem VDR responsive elementer blev fundet i det humane gen der koder for epitel calciumkanal TRPV6 tyder direkte regulering af 1,25-dihydroxyvitamin D3 via dens formodede receptor [17]. Vi har bekræftet i vores celle model at ekspressionen af ​​TRPV6 direkte opreguleres ved 1,25-dihydroxyvitamin D3 i dosis- og tidsafhængig måde. Vores resultater tyder på, at karakteren af ​​denne opregulering er steroid-afhængig da i steroid-berøvet betingelser virkningerne af 25-dihydroxyvitamin D3 afskaffes. Dette fund er i overensstemmelse med de data, aktiviteter for 1,25 dihydroxyvitamin D3 i LNCaP celler er afhængige af steroid samregulering og at for eksempel, androgen receptor opregulering af 1,25-dihydroxyvitamin D3 bidrager sandsynligvis til de synergistiske virkninger af en , 25-dihydroxyvitamin D3 og DHT i disse celler [23]. Dataene fra laboratoriet af Feldman viser, at tilsætningen af ​​DHT ved 1 nM til mediet genoprettede den antiproliferative aktivitet af 1,25-dihydroxyvitamin D3, mens et antiandrogen, Casodex, blokerede fuldstændigt 1,25-dihydroxyvitamin D3 antiproliferative og PSA stimulation aktiviteter når celler blev dyrket i FBS-medium [23].

evne 1,25-dihydroxyvitamin D3 til at inhibere prostatavækst er blevet påvist i primære dyrkede celler fra normale væv, benign prostatahyperplasi (BPH) og prostatacancer og flere xenograftmodeller af prostatacancer [5], men ikke i forhold til TRPV6 reaktionsevne er påvist indtil videre. Mekanismen for 1,25-dihydroxyvitamin D3-aktivitet er ikke helt klart, men angår forskellige aktiviteter som at pre-receptor forskelle i farmakokinetik, samt forskelle i funktionelle konformation af liganden-bundne VDR kompleks, som kan ændre egenskaberne af retinoid X -receptor hybridisering, DNA-binding og co-aktivator rekruttering [24]. Mekanismen for væksthæmning ved 1,25-dihydroxyvitamin D3 synes at være mutifactorial men induktion af p21

WAF1 /CIP1 og /eller p27

Kip1 synes at være en vigtig vej [25].

vi er den første til at rapportere, at virkningerne af 1,25-dihydroxyvitamin D3 kan være pro-proliferative når medieret af den direkte induktion af

trpv6

genekspression i humane stærkt kræft androgen-afhængige LNCaP-cellelinje. Spørgsmålet er stadig åbent, om 1,25-dihydroxyvitamin D3 behandling er mulig i kræft stadier og metastase er forskellig i høj TRPV6 udtryk eller, ellers, i prostata cancer celler biopsier stadig reagerer på 1,25-dihydroxyvitamin D3 behandling ved overekspression TRPV6.

, 1,25-dihydroxyvitamin D3 opregulerer således TRPV6 som forøger [Ca

2 +]

jeg giver øget Ca

2 + -uptake af LNCaP celler. Dette 1,25-dihydroxyvitamin D3-induceret Ca

2 + -uptake dramatisk øger proliferationshastighed og en række af de celler, der føres ind i S-fase og også bidrager til den forbedrede apoptose modstand. Interessant nok den apoptose forbliver upåvirket ved 1,25-dihydroxyvitamin D3 behandling, som kan forklares ved reaktionsevne LNCaP-cellelinje til 1,25-dihydroxyvitamin D3 via øge ekspressionen af ​​TRPV6 kanal og derfor øge modstanden mod apoptose. Men når LNCaP-celler behandles med 1,25-dihydroxyvitamin D3, men pretransfected med siRNA-TRPV6 og således blottet for denne kanal De er meget mere udsat for apoptose, at det bliver sammenlignelig med virkningen af ​​siRNA mod AR positiv kontrol anvendes en. Dette indebærer, at calcium tilføres til cancercellen via TRPV6 kanal anvendes til at modvirke virkningerne af 1,25-dihydroxyvitamin D3, som skal være antiproliferativ i fravær eller lave forekomst af denne kanal. Vi konkluderer, at TRPV6 er en alvorlig faktor for 1,25-dihydroxyvitamin D3 pro- eller antiproliferativ aktivitet.

Vores data er ikke i modstrid med de tidligere offentliggjorte værker og er i overensstemmelse med den hypotese, at de væksthæmmende effekter af en , 25-dihydroxyvitamin D3 er delvist medieret gennem dets evne til at modulere PCNA-ekspression [26]. En PCNA proteinniveau er to gange mindre ved 1,25-dihydroxyvitamin D3 behandling er yderligere reduceret i LNCaP-celler transficeret med siRNA-TRPV6, med eller uden 1,25-dihydroxyvitamin D3.