PLoS ONE: niclosamid Undertrykker Cancer Cell Growth ved at inducere Wnt Co-receptor LRP6 Nedbrydning og hæmmende for Wnt /β-Catenin Pathway

Abstrakt

Wnt /β-catenin signalvej er vigtigt for tumor initiering og progression. Den lavdensitetslipoprotein receptor-relateret protein-6 (LRP6) er en væsentlig Wnt co-receptor for Wnt /β-catenin signalering og repræsenterer en lovende anticancer mål. For nylig blev den antihelminthic lægemiddel, niclosamid sig at inhibere Wnt /β-catenin signalering, selvom mekanismen ikke er veldefineret. Vi fandt, at niclosamid var i stand til at undertrykke LRP6 ekspression og phosphorylering, blokere Wnt3a-induceret β-catenin akkumulering og inhiberer Wnt /β-catenin signalering i HEK293-celler. Desuden blev de inhiberende virkninger af niclosamid på LRP6 ekspression /phosphorylering og Wnt /β-catenin signalering tilpasset i human prostata PC-3 og DU145 og bryst MDA-MB-231 og T-47D-cancerceller. Desuden viste vi, at den mekanisme, hvormed niclosamid undertrykt LRP6 skyldes øget nedbrydning som tydeligt ved en kortere halveringstid. Endelig har vi vist, at niclosamid var i stand til at inducere cancercelle apoptose, og vises fremragende anticanceraktivitet med IC

50 værdier mindre end 1 um for prostata PC-3 og DU145 og bryst MDA-MB-231 og T-47D-cancerceller . IC

50 værdier er sammenlignelige med dem, vist sig at undertrykke aktiviteter Wnt /β-catenin signalering i prostata- og brystcancerceller. Vores data indikerer, at niclosamid er en unik lille molekyle Wnt /β-catenin signalering inhibitor målretning Wnt coreceptor LRP6 på celleoverfladen, og at niclosamid har et potentiale, der skal udvikles en ny kemoforebyggende eller terapeutisk middel mod human prostata og brystkræft .

Henvisning: Lu W, Lin C, Roberts MJ, Waud WR, Piazza GA, Li Y (2011) niclosamid Undertrykker Cancer Cell Growth ved at inducere Wnt Co-receptor LRP6 Nedbrydning og hæmmende for Wnt /β-Catenin pathway. PLoS ONE 6 (12): e29290. doi: 10,1371 /journal.pone.0029290

Redaktør: Lin Mei, Medical College of Georgia, USA

Modtaget: September 1, 2011; Accepteret: November 24, 2011; Udgivet: 16. december 2011

Copyright: © 2011 Lu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Institutes of Health (RO1CA124531, til YL). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Wnt /β-catenin signalering spiller en vigtig rolle i fosterudviklingen og kan føre til tumordannelse når afvigende aktiveret. Et kendetegn for Wnt /β-catenin signaleringsaktivering er stabiliseringen af ​​cytosolisk β-catenin, som kommer ind i kernen for at aktivere Wnt målgener ved at binde transkriptionsfaktorer af T-celle-faktor /lymfoid øge faktor (TCF /LEF) familie [ ,,,0],1], [2]. I mangel af Wnt-ligander, er β-catenin-niveauer effektivt reguleret af en supramolekylær kompleks indeholdende adenomatøs polyposis coli (APC), axin, og glycogensyntetase kinase 3β (GSK3p). Dette kompleks fremmer phosphorylering af β-catenin med caseinkinase 1 (CK1) og GSK3p. Phosphoryleret β-catenin bliver multi-ubiquitineret (Ub) og nedbrydes af 26S-proteasomet. Virkningen af ​​dette kompleks inhiberes ved binding af Wnt til dets receptorer på celleoverfladen [1], [2]. En række Wnt /β-catenin target gener er blevet identificeret, herunder dem, der regulerer celleproliferation og apoptose, hvilket således mediere kræft initiering og progression [3] – [5]. Overbevisende dokumentation har vist, at der er en unormal opregulering af denne vej i tumorigenese af mange typer af kræft, og at afbrydelse af Wnt /β-catenin signalering repræsenterer en stor mulighed for at udvikle nye lægemidler til kræft kemoforebyggelse og terapi [6] – [8].

Eksperimenter udført i Drosophila [9], Xenopus [10] og mus [11] viste, at low-density lipoprotein receptor-relateret protein 5 (LRP5) /LRP6 (betegnet pil i Drosophila) virker som en co-receptor for Wnt-ligander, som interagerer med både syv transmembrane receptor Frizzled (Fz) -familien og LRP5 /6 for at aktivere den kanoniske Wnt signalvejen. De cytoplasmatiske haler af LRP5 /6, upon receptoraktivering af Wnt-ligand, er phosphoryleret, og rekruttere det cytosoliske scaffold protein axin til membranen. LRP6 udtrykkes i humane cancercellelinier og opreguleret i humane maligne væv [12] – [16]. Undersøgelser i de seneste år har vist, at LRP6 er en lovende terapeutisk mål for udvikling af nye lægemidler mod cancer [6] -. [8], [15], [17], [18]

niclosamid (handel navn Niclocide) er en teniacide i antihelmintic familie, der er særlig effektiv mod cestoder, der inficerer mennesker. Niclosamid har været FDA godkendt til sådanne betegnelser og har været brugt i mennesker i næsten 50 år [19] – [21]. Det menes, at niclosamid inhiberer oxidativ phosphorylering i mitokondrier af cestoder; en aerob metabolisme, som mange cestoder er afhængige. For nylig er det blevet påvist, at niclosamid kan nedregulere cytosolisk β-catenin-ekspression til at inhibere Wnt /β-catenin signalering [22], [23], og undertrykke kolorektal cancervækst og metastase [23], [24]. Eftersom mekanismen ikke var veldefineret, vi yderligere undersøgt dette. Vi viste for første gang, at niclosamid kan hæmme Wnt /β-catenin signalering ved at inducere LRP6 nedbrydning, og at denne aktivitet er tæt forbundet med dens antiproliferative og apoptoseinducerende aktivitet.

Resultater

niclosamid blokke Wnt /β-catenin signalering induceret af Wnt3a og LRP6 ved at undertrykke LRP6 ekspression i HEK293-celler

kompleksbundet cytosolisk β-catenin (fri β-catenin) er den aktive form af β-catenin, der translokeres til cellen kerne til at aktivere transkriptionsfaktorer af TCF /LEF-familien, hvilket fører til transskription af Wnt målgener. For at bestemme om niclosamid kan inhibere Wnt /β-catenin signalering blev HEK293-celler behandlet i med Wnt3a konditioneret medium (CM) i nærvær af niclosamid eller vehikel (DMSO). Niveauerne af cytosolisk frit β-catenin og totale cellulære β-catenin blev derefter undersøgt ved Western blotting. Som vist i figur 1A, niclosamid kunne blokere Wnt3a-induceret cytosolisk frit β-catenin og totale cellulære β-catenin akkumulering i HEK293-celler ved koncentrationer så lave som 0,6 uM (figur 1A).

(A) HEK293-celler i 6-brønds plader blev behandlet med Wnt3a CM (20%) og niclosamid ved angivne koncentrationer i 24 timer. Niveauerne af cytosolisk frit β-catenin, totalt cellulært β-catenin, LRP6 og phospho-LRP6 (p-LRP6) blev undersøgt. Alle prøverne blev også undersøgt med anti-actin-antistof til at kontrollere lig belastning. (B) HEK293-celler i plader med 24 brønde blev transient transficeret med LRP6 plasmid eller den tilsvarende kontrol vektor, sammen med TOPFlash konstruere og β-galactosidase-udtrykkende vektor i hver brønd. Efter at være blevet inkuberet i 24 timer blev celler behandlet med niclosamid eller niclosamid plus Wnt3a CM ved angivne koncentrationer i 24 timer. Luciferaseaktiviteten blev derefter målt 24 timer senere med normalisering til aktiviteten af ​​β-galactosidase. Værdier er gennemsnit af tre bestemmelser med standardafvigelser indikeret ved fejlsøjler. ** P 0,01 sammenlignet med kontrolcellerne uden niclosamid behandling

LRP6 er en vigtig Wnt co-receptor for Wnt /β-catenin-signalvejen, og LRP6 phosphorylering er kritisk for Wnt /β. catenin signaleringsaktivering induceret af Wnt proteiner [25] – [28]. At udforske den molekylære mekanisme bag Wnt /β-catenin signalering hæmning af niclosamid undersøgte vi LRP6 udtryk og phosphorylering efter niclosamid behandling. Som vist i figur 1A, behandling af Wnt3a CM markant induceret endogen LRP6 phosphorylering i HEK293-celler, som blev afskaffet ved niclosamid behandling. Vigtigt er det, vi fandt også, at det totale cellulære niveau af endogen LRP6 blev stærkt formindsket efter niclosamid behandling i HEK293-celler (figur 1A).

For at bekræfte den inhiberende virkning af niclosamid på LRP6 ekspression og phosphorylering udførte vi en Wnt /β-catenin signalering reporter assay for at teste, om niclosamid er i stand til at inhibere Wnt /β-catenin signal aktivering ved LRP6 og Wnt3a. HEK293-celler blev transient transficeret med LRP6 sammen med Wnt /β-catenin signalering reporter TOPFlash og behandlet med Wnt3a CM og niclosamid. Som vist i figur 1B, LRP6 ekspression øgede TOPFlash aktivitet i HEK293-celler, der blev yderligere forstærket, når cellerne blev transficeret med LRP6 og behandlet med Wnt3a CM (figur 1B). Desuden blev den forøgede TOPFlash aktivitet induceret af LRP6 eller LRP6 plus Wnt3a CM blokeret af niclosamid (figur 1B).

niclosamid undertrykker LRP6 Ekspression og phosphorylering og Blocks Wnt /β-catenin signalering i prostata og brystcancerceller

for at afgøre, om niclosamid kan blokere Wnt /β-catenin signalering i kræftceller, vi undersøgte niveauet af cytosolisk fri β-catenin efter niclosamid behandling. Vi fandt, at cytosoliske frie β-catenin-niveauer i human prostata PC-3 og bryst MDA-MB-231 cancerceller blev væsentligt reduceret efter niclosamid behandling (figur 2A). Endvidere når PC-3 og MDA-MB-231-celler blev transient transficeret med Wnt /β-catenin signalering reporter TOPFlash, fandt vi, at niclosamid behandling i høj grad reduceret TOPFlash aktivitet i PC-3 og MDA-MB-231-celler ( Figur. 2B).

(A) Prostatacancer PC-3 og brystcancer MDA-MB-231-celler i 6-brønds plader blev behandlet med niclosamid ved de angivne koncentrationer i 24 timer. Niveauerne af cytosolisk frit β-catenin blev derefter undersøgt ved GST-E-cadherin bindingsassay. (B) Prostatacancer PC-3 og brystcancer MDA-MB-231-celler i 24-brønds plader blev transient transficeret med TOPFlash luciferase-konstruktion og β-galactosidase-udtrykkende vektor i hver brønd. Efter 24 timers inkubation blev celler behandlet med 2,4 pM niclosamid. Luciferaseaktiviteten blev derefter målt 24 timer senere med normalisering til aktiviteten af ​​β-galactosidase. Værdier er gennemsnittet af tredobbelte bestemmelser med s.d. indikeret ved fejlsøjler. ** P. 0,01 sammenlignet med kontrolcellerne

Det er velkendt, at axin2 er en transkriptionel mål for Wnt /β-catenin-signalvejen, og at ekspressionsniveauet af axin2 er underskrift aktivering af Wnt /β-catenin signalering [29] – [32]. Cyclin D1 er en transkriptionel mål for Wnt /β-catenin signalering, og er kritisk for cancercelleproliferation [33], [34]. For at bestemme de inhiberende virkninger af niclosamid på Wnt /β-catenin signalering i humane cancerceller, undersøgte vi axin2 og cyclin D1-ekspression i humane prostata PC-3 og DU145 og bryst MDA-MB-231 og T-47D-cancerceller. Som vist i figur 3, niclosamid undertrykte signifikant axin2 og cyclin D1-ekspression i alle fire cancercellelinier. Salg

(A) DU145 og PC3-prostatacancerceller og MDA-MB-231 og T-47D-brystcancerceller i 6-brønds plader blev behandlet med niclosamid ved angivne koncentrationer i 24 timer. De samlede cellulære niveauer af LRP6, p-LRP6, Dvl2, Axin2 og cyclin D1were derefter undersøgt. Alle prøverne blev også undersøgt med anti-actin-antistof til at kontrollere lig belastning. (B) PC-3 og DU145 prostatacancerceller og MDA-MB-231 og T-47D-brystcancerceller i 6-brønds plader blev behandlet med niclosamid ved angivne koncentrationer i 24 timer. De cytosoliske niveauer af Dvl2 blev derefter undersøgt. Alle prøverne blev også undersøgt med anti-actin-antistof til at kontrollere lig belastning.

For at bestemme om den hæmmende virkning af niclosamid på Wnt /β-catenin signalering er relateret til LRP6 ekspression undersøgte vi LRP6 ekspression og phosphorylering efter niclosamid behandling. Som vist i figur 3A, niclosamid kunne undertrykke LRP6 ekspression og phosphorylering i alle fire cancercellelinier, hvilket indikerer, at niclosamid kan undertrykke Wnt /β-catenin signalering i bryst- og prostatacancerceller ved at undertrykke LRP6 ekspression.

niclosamid Fremkalde LRP6 Nedbrydning

for at definere den molekylære mekanisme bag effekten af ​​niclosamid på LRP6 proteinniveau, vi studerede LRP6 omsætning. PC-3-celler blev behandlet med niclosamid ved 1,2 uM i 0, 3, 6, 10 og 24 timer i nærvær af cycloheximid, et protein syntese inhibitor. Som vist i figur 4, i fravær af niclosamid behandling blev LRP6 nedbrudt med en halveringstid på ca. 6,9 timer. Behandling med niclosamid væsentligt forbedret LRP6 omsætning med en halveringstid på ca. 2,3 timer (figur 4A). Denne afkortning af LRP6 halveringstid tyder på, at niclosamid kan stimulere LRP6 nedbrydning. For at teste, om niclosamid regulerer LRP6 udtryk på transskription niveau også, vi undersøgte LRP6 mRNA niveauer ved real-time RT-PCR. Som vist i figur 4B, blev LRP6 mRNA-niveauer ikke signifikant ændret efter niclosamid behandling i PC-3 og MDA-MB-231-celler. Derfor niclosamid-induceret LRP6 suppression skyldes primært den forøgede LRP6 nedbrydning.

(A) PC-3-celler blev inkuberet med 10 ug /ml cycloheximid i nærvær af niclosamid (1,2 uM) eller vehikel til 0, 3, 6, 10 eller 24 timer. Celler blev derefter høstet, og niveauet af endogen LRP6 blev undersøgt ved Western blotting. Prøver blev også undersøgt med anti-actin-antistof til at kontrollere lig belastning. Pixlerne for hvert bånd blev målt, normaliseret og plottet. Dataene er gennemsnitsværdier af tre uafhængige forsøg med SD værdier, der angives ved fejlsøjler. * P 0,05, ** P 0,01 versus tilsvarende kontrolværdi. (B) PC-3 og MDA-MB-231-celler i 6-brønds plader blev behandlet med niclosamid i 24 timer. Cellerne blev derefter høstet og LRP6 mRNA niveauer blev bestemt ved real-time RT-PCR og normaliseret til niveauet budskab GAPDH mRNA. Alle værdier er gennemsnittet af tredobbelte bestemmelser med s.d. angivet med fejllinjer.

niclosamid har ingen effekt på Dishevelled-2 (Dvl2) Udtryk i Prostata og Breast Cancer Cells

Det er blevet rapporteret, at niclosamid nedregulerer komponenter af Wnt-vejen specifikt cytosolisk Dvl2 ekspression, hvilket resulterer i formindsket nedstrøms Wnt /β-catenin signalering i kolorektale cancere [23]. For at teste, om Dvl2 også er involveret i niclosamid-induceret Wnt /β-catenin signalering inhibering i prostata- og brystcancerceller, undersøgte vi både totalt cellulært og cytosoliske niveauer af Dvl2 ekspression. Uventet fandt vi, at niclosamid havde ingen effekt på både totale cellulære og cytosolisk Dvl2 ekspression i human prostata PC-3 og DU145 og bryst MDA-MB-231 og T-47D cancerceller (figur 3), mens LRP6 ekspression blev stærkt undertrykt ved samme behandling (figur 3A). Disse resultater indikerer, at LRP6 nedregulering er nøglen mekanisme bag niclosamid-induceret Wnt /β-catenin signalhæmning i human prostata PC-3 og DU145 og bryst MDA-MB-231 og T-47D-cancerceller.

niclosamid inducerer Prostata og Breast cancer Cell apoptose og Forhindrer cancer Cell Proliferation

Wnt /β-catenin pathway er vigtig for kræftcellen apoptose [35], [36]. Efter at have fastslået, at niclosamid er en potent hæmmer af Wnt /β-catenin signalering i prostata- og brystcancerceller, derefter testet vi, om niclosamid er i stand til at fremkalde apoptose. Som vist i figur 5A, at eksponering niclosamid ved 1,2 og 2,4 uM i 24 timer signifikant induceret apoptotisk DNA fragmentation i prostata PC-3 og DU145 og bryst MDA-MB-231 og T-47D-cancerceller.

( A) Cancer celler blev behandlet med niclosamid ved de angivne koncentrationer i 24 timer. Flydende og vedhæftede celler blev kombineret for apoptose påvisning ved celledøden ELISA-kit fra Roche Diagnostics Corporation for histon-associerede DNA-fragmenter som beskrevet i Materialer og Metoder. (B) kræftceller i 96-brønds plader blev behandlet med niclosamid i 72 timer. Cellelevedygtighed blev målt ved celle Titer Glo Assay system. Alle værdier er gennemsnittet af tredobbelte bestemmelser med s.d. indikeret ved fejlsøjler. ** P. 0,01 versus tilsvarende kontrol værdi

Da niclosamid kan blokere Wnt /β-catenin signalering i kræftceller og kan inducere apoptose, vi næste undersøgt effekten af ​​niclosamid på kræft celleproliferation. Som vist i figur 5B, niclosamid inhiberede cancercelleproliferation med IC

50 værdier mindre end 1 pM for alle fire testede cellelinier. IC

50 værdier er sammenlignelige med dem, vist sig at undertrykke aktiviteter Wnt /β-catenin signalering i prostata- og brystcancerceller.

Discussion

overbevisende evidens for, at der er en unormal opregulering af Wnt /β-catenin pathway i tumorigenese af mange typer af cancer. Mens genetiske mutationer af visse komponenter i Wnt /β-catenin vej, såsom

APC

og

CTNNB1

, er væsentlige medvirkende faktorer til tarmkræft, er de typisk ikke den fremherskende mekanisme er forbundet med mange andre typer af cancer, såsom bryst- og prostatakræft. I stedet fremgår det, at dysregulering af Wnt /β-catenin signalering på celleoverfladen fører til afvigende aktivering af denne pathway i disse typer af cancer [3] – [5], [37]. Derfor målrettet inhibering af Wnt /β-catenin signalering ved celleoverfladen er en rationel og lovende ny tilgang til cancerterapi.

Wnt /β-catenin signalering spiller en vigtig rolle i mælkekirtlen udvikling og carcinogenese [ ,,,0],4]. Triple negativ brystkræft (TNBC, ER, PR, og HER2-negativ brystkræft) er en af ​​de mest vanskelige undertyper af brystkræft til at behandle på grund af mangel på en målrettet terapi. Undersøgelser har vist, at Wnt /β-catenin signalering aktivering fortrinsvis findes i TNBC og er forbundet med en dårlig klinisk resultat [38]. Basal-lignende brystkræft (BLBC) deler mange overlappende funktioner med BLBC. Flere undersøgelser har vist, at LRP6 opreguleres i humane TNBC eller BLBC [14] – [16]. Hos mus blev brystkirtel udvikling og MMTV-Wnt1-induceret brystkirtler tumorigenese forsinket i LRP6

+/- mus [14], mens MMTV-LRP6 transgene mus udviklede hyperplasi i deres mælkekirtler grund LRP6-medieret Wnt /β- catenin signalering [39]. Transkriptionel knockdown af LRP6 i TNBC MDA-MB-231-celler faldt betydeligt Wnt /β-catenin signalering, celleproliferation og tumorvækst

in vivo

[15]. Desuden er det blevet påvist, at specifikke LRP6 antistoffer var i stand til at blokere MMTV-Wnt1 eller MMTV-Wnt3 xenotransplantater

in vivo

[17], [18], og at rekombinant Mesd protein, en LRP6 antagonist, markant undertrykt tumorvækst i MMTV-Wnt1 xenograftmodeller [15]. Desuden salinomycin, en brystcancer stamcelle killer [40], blev for nylig påvist at være en inhibitor af Wnt /β-catenin signalering ved at inducere LRP6 nedbrydning [41]. I den foreliggende undersøgelse, vi demonstreret, at niclosamid undertrykt LRP6 ekspression i TNBC MDA-MB-231-celler og ER-positiv brystkræft T-47D-celler, og inhiberede brystcancercelleproliferation med IC

50 værdier mindre end 1 uM. Vores resultater støtter konceptet, at LRP6 er en lovende terapeutisk mål for brystkræft, herunder TNBC.

Akkumuleret beviser har vist en væsentlig rolle for Wnt /β-catenin signalering i udviklingen og progressionen af ​​human prostatacancer [3] . Selv om det er uklart, om LRP6 er opreguleret i prostatacancer, har vi for nylig vist, at LRP6 antagonisten Mesd markant hæmmet Wnt /β-catenin signalering i prostatakræft PC-3 celler, og undertrykt PC-3 celledeling

i vitro

og tumorvækst

in vivo

[42], [43]. I den foreliggende undersøgelse, fandt vi niclosamid inhiberede proliferationen af ​​prostatacancer PC-3 og DU145 celler med IC

50 værdier mindre end 1 uM, som er sammenlignelige med dem vist at undertrykke LRP6 ekspression og aktiviteterne i Wnt /β- catenin signalering i prostata kræftceller. Sammen disse resultater tyder på, at LRP6 er et potentielt terapeutisk mål for prostatakræft.

Mutationer i

APC

og

CTNNB1

er to vigtige faktorer for Wnt /β-catenin signalering aktivering i kolorektale cancere, men nyere undersøgelser viser, at niveauerne af Wnt /β-catenin signalering i kolorektale cancerceller kunne moduleres på celleoverfladen [44] – [48]. Især Ueno

et al.

Viste, at Wnt receptor Frizzled-7 aktiverer Wnt /β-catenin vej hos kolorektale cancerceller trods af tilstedeværelsen af ​​

APC

eller

CTNNB1

mutation og at Frizzled-7-siRNA kan anvendes som et terapeutisk reagens til kolorektal cancer [48]. Shi

et al

. rapporterede, at siRNA lyddæmpning af Wnt-2, som er kendt for sin overekspression i kolorektal cancer, hæmmede Wnt /β-catenin signalering og induceret apoptose i humane kolorektal cancer celler, der indeholder downstream mutationer [47]. Det secernerede Frizzled-relateret protein (SFRP) -familien og Wnt inhibitorisk faktor-1 (WIF-1) udskilles Wnt /β-catenin signalering antagonister, der binder til Wnt ligander, og forstyrre Wnt-receptor-interaktion. Det er blevet rapporteret, at tab af SFRP familie ekspression blev med promoter hypermethylering i colorektal cancer [44], og at genoprettelse af SFRP funktion i kolorektale cancerceller dæmper Wnt /β-catenin signalering selv i nærvær af downstream mutationer [45]. Tilsvarende Han

et al.

Rapporterede, at tab af WIF-1-ekspression var forbundet med promoter hypermethylering i kolorektal cancer, og at genoprettelsen af ​​WIF-1 funktion, Wnt-1 siRNA, eller et monoklonalt anti-Wnt- 1 antistof inducerer signifikant apoptose i kolorektal cancer celler, som indeholder downstream mutationer og udtrykker Wnt-1 [46]. For ganske nylig er det blevet rapporteret, at niclosamid var i stand til at hæmme Wnt /β-catenin signalering i kolorektal cancer celler, hæmmede kolorektal kræft vækst og S100A4-medieret metastatisk kolorektal cancer [23], [24]. Calcium-bindende protein S100A4 er et målgen af ​​Wnt /β-catenin pathway [49]. Fremtidige undersøgelser er nødvendige for at behandle betydningen af ​​LRP6 i tyk- udvikling kræft og progression.

Udviklingen af ​​FDA godkendte lægemidler, der anvendes til andre indikationer er en attraktiv strategi for udvikling af nye lægemidler til kræft chemoforebyggelse eller terapi givet deres dokumenteret sikkerhed rekord. Afbrydelse af Wnt /β-catenin signalering er en stor mulighed for at afgøre, om FDA godkendt medicin kan have potentielle anticancer effekt [6] – [8]. Niclosamid er en salicyclamide derivat og stof valg til behandling af de fleste bændelorm infektion. Niclosamid udøver sin antiparasitisk aktivitet i det intestinale lumen og absorberes dårligt fra mave-tarmkanalen [19] – [21]. Men i mus implanteret humane kolorektal cancer xenografter, oralt administreret niclosamid var veltolereret, opnåede plasma og tumor niveauer i forbindelse med biologisk aktivitet og førte til tumor kontrol [23]. Desuden niclosamid har nogen signifikant toksicitet mod ikke-kræft celler

in vitro

og viser ingen tydelige bivirkninger i niclosamid-behandlede mus [23]. Vi demonstrerer heri, at niclosamid er en potent Wnt /β-catenin signalering inhibitor ved at inducere LRP6 nedbrydning i kræftceller, og viser en fremragende anticancer aktivitet

in vitro

. Derfor, som en FDA-godkendt antihelminthic lægemiddel, vil niclosamid være en interessant comoound skal optimeres for at forøge dens biotilgængelighed og skal testes for sine

in vivo

cancer forebyggende og terapeutiske roller i fremtiden.

Materialer og metoder

Materialer

niclosamid blev købt fra Sigma. Polyklonalt anti-phospho-LRP6 (Ser1490) og anti-Dvl2 og monoklonalt anti-Axin2 blev indkøbt fra Cell Signaling Technology. Monoklonalt anti-LRP6 var fra Santa Cruz Biotechnology. Polyklonalt kanin-anti-cyclin D1 var fra Chemicon International. Monoklonalt anti-β-catenin var fra BD Biosciences. Monoklonalt anti-actin var fra Sigma. Peroxidasemærket anti-muse-antistof og ECL-systemet blev købt fra Amersham Life Science. Plasmid pCS-Myc-hLRP6 indeholdende fuldlængde humant LRP6 cDNA var fra Dr. Christof Niehrs (Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg, Tyskland). Plasmid Glutathion-S-transferase (GST) -E-cadherin blev venligst stillet til rådighed af Dr. Gail Johnson (University of Rochester, NY). Den TOPFlash luciferase-konstruktion var fra Upstate Biotechnology. Den β-galactosidase-udtrykkende vektor, luciferase assaysystem og β-galactosidase assaysystem blev erhvervet fra Promega. Vævskulturmedier, føtalt bovint serum (FBS), og plast-ware blev opnået fra Life Technologies, Inc. blev proteinase inhibitor cocktail Complete ™ opnået fra Boehringer Mannheim. Alle cellelinier blev opnået fra ATCC og dyrkedes i RPMI-1640 medium indeholdende 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Celler blev dyrket i antibiotisk medium for celle proliferationsassays. Cell Titer Glo assaysystemer var fra Promega. detektion celledød ELISA-kit blev indkøbt fra Roche Diagnostics Corporation.

Western blotting

Celler i plader med 6 brønde blev lyseret i 0,5 ml lysebuffer (phosphatpufret saltvand indeholdende 1% Triton X -100 og 1 mM PMSF) ved 4 ° C i 10 min. Lige mængder af protein blev underkastet SDS-PAGE under reducerende betingelser. Efter overførsel til Immobilon-P overførselsmembran, successive inkuberinger med et primært antistof og et peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof blev udført i 60-120 minutter ved stuetemperatur. De immunreaktive proteiner blev derefter detekteret under anvendelse af ECL-systemet. Film, der viser immunoreaktive bånd blev scannet af Hp Scanjet 5590.

Cytosolisk gratis β-catenin analyse med GST-E-cadherin bindende assay

GST-E-cadherin bindende assay blev udført præcis som tidligere beskrevet [50]. -Kompleksdannet cytosolisk frit β-catenin stede i 100 ug totalt cellelysat blev underkastet SDS-PAGE og påvist under anvendelse af det monoklonale antistof til p-catenin.

Real-time RT-PCR

I alt RNA blev isoleret fra cellekulturer under anvendelse af RNA-Bee (Tel-Test), og første streng cDNA-syntese blev udført under anvendelse ProSTARTM Ultro HF RT-PCR Kit (Stratagene) primet med oligo (dT) primer i en reaktionsblanding 20 pi indeholdende 1 ug totalt RNA. Til analyse af LRP6 mRNA-niveauer, blev real-time RT-PCR udført med de specifikke LRP6 og GAPDH primere købt hos SABioscience /Qiagene. Den LRP6 mRNA-niveau var normaliseret til GAPDH mRNA-niveau.

Analysisof cytosolisk Dvl2 udtryk

Cytosoliske Dvl2 udtryk blev undersøgt med metoden som beskrevet for andre steder [23]. Kort fortalt blev cellerne lyseret med hypotonisk lysepuffer (bestående af 10 mM Tris-HCI, pH 7,4 og 0,2 mM MgCl2, suppleret med proteaseinhibitorer, inkuberet på is i 10 min, og homogeniseret ved anvendelse af en tætsluttende glas dounce. Saccharose og EDTA blev tilsat til slutkoncentrationer på 0,25 M og 1 mM, blev hver. Lysater derefter centrifugeret ved 20.000 x g i 1 time ved 4 ° C. Supernatanten repræsenterer cytosolisk cellefraktion blev herefter fortyndet i SDS-prøvebuffer, og Dvl2 ekspression blev derefter undersøgt ved Western blotting.

luciferase reporter assay

Cancerceller blev udpladet i plader med 24 brønde. Efter dyrkning natten over blev cellerne transient transficeret med 0,1 ug af TOPFlash luciferase-konstruktion (Upstate Biotechnology) og 0,1 ug β-galactosidase-udtrykkende vektor (Promega, Madison, WI). Efter 24 timers inkubation blev celler behandlet med niclosamid. celler blev derefter lyseret 24 timer senere og begge luciferase og β-galactosidase aktiviteter blev bestemt. luciferaseaktiviteten var normaliseret til β-galactosidaseaktiviteten.

Apoptose evaluering

Apoptose blev vurderet med detektion celledød ELISA-kit indkøbt fra Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis. Dette assay detekterer oligonucleosomes frigivet efter forsigtig lysis af cellen. Celler blev dyrket i T25 kolber til den ønskede varighed. Det brugte medium indeholdende flydende celler blev gemt og opbevaret på is. De adhærerende celler blev opsamlet ved forsigtig trypsinering og blev kombineret med flyderne til pelletering ved centrifugering. Efter forsigtig lysis af cellerne med pufferen tilvejebragt med påvisning kit, blev cellelysatet anvendt til ELISA-testen. Resultaterne blev normaliseret ved proteinindholdet opnået fra parallelle kolber med celler bliver lyseret under anvendelse af puffer som beskrevet ovenfor til Western blotting.

Celleproliferationsassay

Celler blev podet i 96-brønds væv kultur behandlet mikrotiterplader ved en densitet på 5000 celler /brønd i et samlet volumen på 50 pi. Efter inkubation natten over blev cellerne behandlet med niclosamid i 72 timer ved tilsætning af 50 pi 2X stamopløsninger til passende brønde, der allerede indeholder 50 pi celler og medium at eksponere celler til det endelige koncentrationer af niclosamid påkrævet. Cellelevedygtighed blev målt ved celle Titer Glo Assay (Promega).

Statistik

Statistiske analyser blev udført ved anvendelse af Students uparrede t-test. Data blev præsenteret som gennemsnit ± SD. Forskelle på P. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Tak

Vi takker Meredith S. Plaxco og Tommie A. Gamble for at køre celleproliferationsassays og Dr. Gail Johnson (University of Rochester) for tilvejebringelse GST-E cadherin cDNA.