PLoS ONE: Promotor Hypermethylering-Related Reduceret Somatostatin Production Fremmer Ukontrolleret Cell Proliferation i kolorektal Cancer

Abstrakt

Baggrund

Somatostatin (SST) har anti-proliferative og pro-apoptotiske effekter. Vores mål var at analysere og sammenligne SST udtryk under normal aldring og kolorektal carcinogenese på mRNA og protein niveauer. Endvidere har vi testet status for methylering af

SST

i biopsiprøver, og cellen vækstinhiberende virkning af SST analog octreotid i human colorektal adenocarcinom-cellelinje.

Metoder Salg

colon prøver blev indsamlet fra raske børn (n1 = 6), raske voksne (n2 = 41) og kolorektal cancer patienter (CRC’er) (n

3 = 34) for

SST

mRNA-ekspression analyse, ved hjælp HGU133 Plus2.0 microarrays. Resultaterne blev valideret både på originalen (n

1 = 6; n

2 = 6; n

3 = 6) og uafhængige stikprøver ((n

1 = 6; n

2 = 6; n

3 = 6) ved real-time PCR SST udtrykkende celler blev påvist ved immunhistokemi på colon biopsiprøver (n

1 = 14;. n

2 = 20; n

3 = . 23) virkningen af ​​octreotid på cellevækst blev testet på Caco-2-cellelinje SST methylering procentdel i biopsiprøver (n

1 = 5;. n

2 = 5, n

3 = 9) blev defineret ved hjælp af methylering-følsomme restriktionsenzym fordøjelse

Resultater

i tilfælde af normal aldring SST mRNA-ekspression ændrede ikke, men faldt i kræft (p 0,05). forholdet mellem SST immunreaktivt. celler var signifikant højere hos børn (0,70% ± 0,79%) sammenlignet med CRC (0% ± 0%) (p 0,05). octreotid signifikant forøget andelen af ​​apoptotiske Caco-2 celler

SST

viste signifikant. højere methylering niveau i tumorprøver (30,2% ± 11,6%) sammenlignet med raske unge individer (3,5% ± 1,9%) (p 0,05).

konklusioner

i kræft colon mucosa den reducerede SST produktion kan bidrage til ukontrolleret celleproliferation. Vores observation, at i colon cancerceller octreotid signifikant forøget celledød og svækket celleproliferation antyder, at SST kan fungere som en regulator af epiteliale celle kinetik. Hæmningen af ​​SST-ekspression i CRC kan epigenetisk reguleret af promotor hypermethylering

Henvisning:. Leiszter K, Sipos F, Galamb O, Krenács T, Veres G, Wichmann B, et al. (2015) Promotor Hypermethylering-Related Reduceret Somatostatin Production Fremmer Ukontrolleret Cell Proliferation i kolorektal cancer. PLoS ONE 10 (2): e0118332. doi: 10,1371 /journal.pone.0118332

Academic Redaktør: Robert Dante, Institut national de la santé et de la recherche médicale, FRANCE

Modtaget: 4. august, 2014 Accepteret: 13 januar 2015; Publiceret: 27 februar 2015

Copyright: © 2015 Leiszter et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Most relevant data er inden for papir og dens Støtte Information filer. Microarray datafiler er tilgængelige i Gene Expession Omnibus database (GSE10714, GSE37364, og GSE37267)

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklærede, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Somatostatin (SST), en regulerende-hæmmende peptid, har bemærkelsesværdig effekt på mave-funktion. Det undertrykker gastrointestinal motilitet og galdeblære sammentrækning, hæmmer gut eksokrine sekretion, regulerer den intestinale næringsstof absorption og blodgennemstrømning, og nedsætter epitelproliferation [1-5]. Desuden SST inhiberer hormonfrigivelse (fx GH, TSH, insulin, gut hormoner), tjener som neurotransmitter og neuromodulator, og bidrager til vandbalance [1,4,6]. Beyond disse fysiologiske endokrine og parakrine /autokrine virkninger, kan SST direkte hæmme celledeling og fremkalde apoptose via somatostatin receptor (SSTR) signalering [4,7]. Derfor kan reducerede somatostatin niveauer, som vi fandt i en pilotundersøgelse har relevans i mave tumorigenese herunder tyktarmskræft, som er en af ​​de førende årsager til kræft dødsfald [8].

somatostatin er hovedsageligt produceret i centrale og perifere nervesystem, i det endokrine pancreas og i tarmen; desuden mindre SST sekretion også er blevet bevist i skjoldbruskkirtlen, binyrer, submandibulære kirtler, nyrer, prostata, placenta, og cellerne i immunsystemet. SST syntetiseres ud fra et stort precursor molekyle kaldet præprosomatostatin (preproSST), som forarbejdes enzymatisk til modne produkter. To bioaktive peptid produkter af SST-kodende gen er kendt, SST-14 og SST-28 [1]. SST-28 syntetiseres i tarmslimhinden, som er den største perifere kilde peptidet og større SST producerende celler i mavetarmkanalen er mucosale A-celler i tarmepitelet, D-celler i det gastriske antrum og pancreas, og iboende neuroner i myentericus og submukøse plexus langs fordøjelseskanalen [3]. Somatostatinfrigivelse kan stimuleres og inhiberet af flere hormoner, neuropeptider, neurotransmittere, cytokiner, vækstfaktorer og næringsstoffer. For eksempel væksthormon-frigivende hormon (GHRH), corticotropin-frigørende hormon (CRH), neurotensin, bombesin, IL-1, IL-6 og TNF-α kan stimulere SST sekretion i flere væv. På den anden side, den γ aminobutiric aminosmørsyre (GABA), opiater, TGF-β og leptin er potentielle inhibitorer af SST frigivelse. Næringsstoffer har vævsspecifik effekt på SST produktion, og tarm SST sekretion er udløst af luminale men ikke cirkulerende næringsstoffer [1].

De fem kendte somatostatin receptorer (SSTR1, SSTR2 /SSTR2A, SSTR2B /, SSTR3, SSTR4 , SSTR5) kodes af fem humane gener er typiske G-protein-koblede receptorer (GPCR) med syv a-helical transmembransegmenter. Ved binding af SST til dets receptorer, er flere cellulære funktioner moduleret gennem flere G-protein-afhængige signalveje. Forskellige signalveje aktiveres afhængigt af receptorundertypen og vævslokalisering. Alle SSTR undertyper hæmmer adenylatcyclase og cAMP produktion, regulere proteinphosphataser og aktivere G-protein reguleres indad ensretter K

+ kanal (GIRK) familie på ligandbinding [1,2,5,9,10].

manifestation af antiproliferative og pro-apoptotiske virkninger af SST på normale og tumorceller afhænger af typen af ​​ligand binding SSTR. SST og dets analoger har indirekte virkning på cellevækst ved at hæmme angiogenese, modulering af immunsystemet og inhibere vækstfaktorer (fx IGF-1) og trofiske hormoner frigivelse. Desuden kan det inducere apoptose, hæmme cellecyklus og modulere virkningen af ​​vækstfaktorer direkte [11-14].

I vores tidligere undersøgelser, vi har sammenfattet de makroskopiske, mikroskopiske og molekylære ændringer, der påvirker mave-tarmkanalen, især tyktarmen under normal aldring [15-17]. Vi har vist, at sunde unge colon epitel og kolorektal cancer kan karakteriseres med øget celledeling og faldt apoptose sammenlignet med den raske voksne colon mucosa. Men mens celledeling er strengt reguleret og velafbalanceret i børn, det bliver ukontrolleret i CRC. Vi har også vist, at ændringer i mRNA ekspression under normal aldring og kolorektal carcinogenese kan være relateret til øget, men forskelligt reguleret cellevækst [18]. Formålet med denne undersøgelse var at analysere lokal somatostatin produktion i human tyktarmsepitelet under normal ældning og colorektal carcinogenese, såvel mRNA og protein-ekspressionsniveauer. Vi undersøgte også virkningerne af somatostatin analog octreotid på menneskers colorektal adenocarcinom-cellelinje (Caco-2). Da promotor hypermethylering epigenetisk kan ændre gentranskription både under aldring og carcinogenese, vi testede status methylering af

SST

gen.

Materialer og metoder

Patienter og prøver

Efter informeret samtykke, kolorektale biopsi prøver blev taget under rutinemæssig endoskopisk indgreb på 2. Institut for Intern Medicin og på 1. Institut for Pædiatri, Semmelweis University, Budapest, Ungarn. Skriftligt informeret samtykke blev opnået på forhånd fra alle voksne deltagere og fra de pårørende, pedeller, eller værger på vegne af mindreårige /børn er godkendt af etiske udvalg. I alt blev 81 biopsiprøver analyseret i microarray analyse (6 raske børn, 41 raske voksne og 34 CRC’er fra voksne) og 36 biopsi prøver blev involveret i real-time PCR validering (12 raske børn, 12 raske voksne og 12 CRC’er fra voksne) . Syvoghalvtreds vævsprøver blev analyseret ved immunohistokemi (14 raske børn, 20 raske voksne og 23 CRCs fra voksne) og 15 biopsier fra colon blev undersøgt ved anvendelse af methylering-følsomme restriktionsenzym methylering array analyse (5 raske børn, 5 raske voksne og 9 CRCs fra voksne). Femoghalvfjerds mikroarrays (indeholdende de voksne prøver) var blevet hybridiseret tidligere; deres datafiler blev brugt i tidligere offentliggjorte undersøgelser ved hjælp af forskellige sammenligninger [19-21] og er tilgængelige i Gene Expression Omnibus database (serie tiltrædelse nummer: GSE10714 og GSE37364). De datasæt af de nyligt hybridiseret 6 mikroarrays er registreret på GSE37267 serienummer tiltrædelse nummer. Kontrol børn blev henvist til ambulatoriet med forstoppelse, blødning fra endetarmen eller kronisk mavesmerter. Ileocolonoscopy var en del af deres diagnostiske procedure (for at udelukke organisk sygdom) og biopsi prøver viste normal makroskopisk udseende og histologi. Hver prøve blev verificeret ved histopathologists. For mRNA undersøgelser (microarray analyse, Taqman RT-PCR) og methylering matrix analyse blev colon prøver opbevaret i RNAlater Reagent (Qiagen Inc, Germantown, US) ved -80 ° C før nukleinsyre ekstraktion. Kolorektale biopsi prøver blev rutinemæssigt fikseret i formaldehyd og indlejret i paraffin til immunhistokemiske eksperimenter.

Etiske godkendelser (Nr .: 69/2008 og 202/2009) for denne undersøgelse blev udstedt af det regionale og institutionelle Udvalg for Videnskab og forskning Ethics of Semmelweis University (Budapest, Ungarn). Detaljeret klinisk-patologisk specifikation af patientprøverne er opsummeret i

Tabel 1

.

mRNA udtryk microarray analyse

Ifølge producentens anvisninger, total RNA blev ekstraheret ved hjælp af RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc., Germantown, USA). Mængden af ​​isolerede RNA blev karakteriseret ved at måle absorbans (NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer, NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, USA) og kvaliteten af ​​isoleret RNA blev testet med kapillær gelelektroforese (2100 Bioanalyzer og RNA 6000 Pico Kit /Agilent Inc ., Santa Clara, CA, USA /). Ifølge Affymetrix beskrivelsen, blev biotinylerede cRNA prober syntetiseret fra 1 til 8 pg total RNA med RIN (RNA Integrity Number) mellem 7-10 og fragmenteret ved hjælp af One-Cycle Target mærkning og kontrol Kit (http: //www.affymetrix. com /support /downloads /manualer /expression_s2_manual.pdf). Ti mikrogram af hver fragmenterede cRNA prøve blev hybridiseret i HGU133 Plus2.0 array (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) ved 45 ° C i 16 timer. Mikroarrayene blev vasket under anvendelse Fluidik Station 450 enhed og farvet med antistof amplifikation farvning fremgangsmåde ifølge producentens instruktioner. Fluorescerende signaler blev detekteret ved GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix).

TaqMan real-time polymerasekædereaktion (RT-PCR) validering

TaqMan polymerasekædereaktion blev anvendt til måling mRNA ekspression af SST kodning gen på originale (6 histologisk intakte børn, 6 histologisk intakt voksen og 6 voksne CRC prøver) og uafhængige sæt prøver (6 histologisk intakte børn, 6 histologisk intakt voksen, 6 voksne CRC prøver). 18S ribosomale RNA (Hs03928990_g1 *) og GAPDH (Hs03929097_g1 *) blev anvendt som reference gen.

Total RNA ekstraktion, kvalitet og kvantitet kontroller blev udført som beskrevet tidligere. Brug af High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit med RNase Inhibitor, 1 pg af total RNA pr prøve blev omvendt transskriberet (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Kvaliteten af ​​cDNA blev kontrolleret ved SDHA real-time PCR (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Schweiz). Derefter 16,7 ng cDNA skabelon per prøve blev anvendt til

SST

(Hs00174949_m1 *) mRNA-ekspression analyse med TaqMan Gene Expression Master Mix (Life Technologies). Målingerne blev udført på LightCycler 480 (Roche) med Mono Color Hydrolyse Probe /UPL Probe afsløring format. Efter denaturering ved 95 ° C i 10 minutter blev 40 PCR-cykler udføres (opformering ved 95 ° C i 15 sekunder, og ved 60 ° C i 1 min).

Immunhistokemi til påvisning af somatostatin-producerende celler

Cores 2 mm i diameter blev indsamlet fra udvalgte områder af formalinfikserede, paraffinindlejrede vævsblokke fremstillet ud fra 20 normale colon prøver og 23 colorektale cancere i voksne patienter og indsættes i væv microarray (TMA) Modtager blokke. Desuden blev 14 histologisk intakte colon biopsi prøver fra børn også undersøgt på protein niveau. 5 um tykke vævssnit blev skåret fra TMA blokke og fra biopsiprøver, og blev immunfarvet. Endogen peroxidase blokering (0,5% hydrogenperoxid og methanolblanding, 30 min, stuetemperatur) og antigen-genvinding (Target Retrieval Solution, Dako, Glostrup, Danmark, kode: S1699, i pH 6 puffer, udført i en mikrobølgeovn ved 900 W i 10 min og ved 370 W i 40 min) blev udført på afvokset prøver. Ikke-specifik blokering med 1% bovint serumalbumin blev anvendt. Immunhistokemisk påvisning af somatostatin blev udført i et fugtigt kammer under anvendelse af kanin-anti-humant polyklonalt antistof (1:50 fortynding natten over, Thermo Scientific, Californien, USA, code: RB-038-A). EnVision + HRP-system (mærket Polymer Anti-kanin, 40 min, Dako, kode: K4003) og diaminobenzidin-brint peroxidase-kromogen-substrat-system (Cytomation Liquid DAB + Substrat Chromogen System, 10 min, Dako, kode: K3468) blev anvendt for signal konvertering. Endelig hæmatoxylin co-farvning blev udført.

Tælling af somatostatin-producerende celler på digitale lysbilleder

Stained prøver biopsi og væv microarray (TMA) dias var digitaliseret med en høj opløsning digital scanner (Pannoramic Scan, 3DHISTECH Ltd. Budapest, Ungarn) ved hjælp af flerlags fluorescerende scanning med en høj numerisk blænde (0,8) x20 objektiv og en high dynamic range AxioCam Mrm Rev.3 sort-hvid kamera tilsluttet scanneren. Digitale slides blev adgang til via en computerskærm og analyseret ved hjælp af Pannoramic Viewer-softwaren (version 1.11.43.0). Markøren Counter softwaremodul resulterer i permanente indføringer på optalte celler blev anvendt til at estimere det relative forhold SST producerer og andre epitelceller. Epiteliale SST positivitet optrådte alle så stærk brun cytoplasmatisk mærkning i dias. Afhængig af prøvens størrelse blev 500-1000 epitelceller tælles i langsgående godt orienterede krypter.

Behandling af Caco-2 celler med somatostatin analog octreotid og måling af Sub-G1 befolkning ved anvendelse af flowcytometri

Celledyrkning og behandling. Celledyrkning eksperiment blev holdt i et specifikt patogen cellekultur laboratorium. Caco-2 human epithelial adenocarcinom cellelinie blev opnået fra DSMZ (Braunschweig, Tyskland; Cat No. ACC-169.). Cellerne blev dyrket til konfluens i MEM-medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA;. Cat No. M 2279), suppleret med 20% kalvefosterserum (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA;. Cat No. F 24429) og 160 pg /ml gentamycin (Sandoz GmbH, Schaftenau, Østrig). Efterfølgende blev 70.000 Caco-2 celler afregnes til l brønd til en 24-brønds behandling plade i MEM suppleret med gentamycin og FCS. Efter 24 timer blev mediet ændret: MEM blev tilsat med gentamycin og med uden FCS 0,1, 1,0, 2,5, 5,0 og 10,0 nmol /l af octreotid (Sandoz GmbH). Måling blev udført i triplikater for hver koncentration. Efter 24, 48 og 72 timer behandling blev cellerne høstet, to gange vasket i 0,5 ml sterilt PBS og til slut resuspenderet i 1,0 ml iskold 70% ethanol og opbevaret ved -20 ° C.

Flowcytometri og Sub-G1 afsløring befolkning. Prøverne blev centrifugeret i 3 min ved 1300 rpm, hvorefter cellerne blev resuspenderet i 300 μ1 ekstraktionsbuffer og 3 pi RNAse (RNase A /T1 Mix, Thermo Fisher Scientific Baltikum UAB, Vilnius) blev tilsat. Efter 15 minutters inkubering ved stuetemperatur, 3 pi propidium jodide (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA;. Katalog nr 81.845) blev tilsat. Den FACS Målingen blev udført på Becton Dickinson Immunocytometry Systems (Mountain View, Californien, USA, serienummer 81.313).

Methylering-følsomme restriktionsenzym methylering array analyse

Biopsi prøver blev homogeniseret i to % natriumdodecylsulfat til DNA-ekstraktion, og derefter inkuberet i proteinase K-fordøjelse buffer (4 mg /ml) ved 60 ° C i 16 timer. DNA-ekstraktion blev udført med høj Pure PCR Template Preparation Kit (Roche Applied Science, Penzberg, Tyskland) som anvist af producenten. DNA blev elueret i 2×100 pi RNase- og DNase-frit vand og opbevaret ved -20 ° C. DNA methylering profiler blev undersøgt under anvendelse af EpiTect Methyl qPCR Array System (Qiagen, Hilden, Tyskland). Det isolerede DNA blev inkuberet med enten DNA-methylering afhængig eller DNA følsomme restriktionsenzymer i 16 timer ved 37 ° C, derefter inkuberet ved 65 ° C for at standse methylaseaktivitet. Hver reaktion 120 pi indeholdt 500 ng genomisk DNA. Efter enzymfordøjelse blev prøver analyseret ved fluorescens-baseret, kvantitativ PCR under anvendelse af LightCycler 480 (Roche Diagnostics, Basel, Schweiz). PCR blev udført under følgende betingelser: 95 ° C i 10 minutter, 40 cykler (97 ° C i 15 sek og 72 ° C i 1 min-med realtid datafangst). At sikre amplifikation af ønskede produkter, blev smeltekurveanalyse udføres ved at følge den realtids-PCR-reaktion. Den smeltekurveanalyse dataopsamling område var 65 ° -95 ° C, holder i 1 s ved trin på 0,04 ° C til PCR påvisning produkt.

Statistisk vurdering

For mRNA-ekspression profilering, Affymetrix udtryk arrays var primært præ-behandlet af GCRMA baggrund korrektion metode med fraktil normalisering og median polsk sammendrag. Udtrykket af

SST

gen mellem forskellige prøve grupper blev analyseret ved ANOVA og post-test Tukey HSD. De datasæt er tilgængelige i Gene Expression Omnibus databank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), serie tiltrædelse numre:. GSE10714, GSE37364 og GSE37267

For real-time PCR validering af SST udtryk 12 prøver blev analyseret i følgende grupper: børn, sunde /normale voksne og voksne CRCs. For normalisering blev 18S ribosomale RNA anvendt som husholdning intern kontrol og DCT værdier blev repræsenteret boxplots. Derfor data var normal fordelt til statistisk analyse ANOVA test og Tukey HSD post-test blev anvendt for at bestemme betydning. Følgende kriterier blev anvendt: Fold change≤0.5 eller Fold change≥2 og p-værdi 0,05

For statistisk analyse af SST Immunofarvning resultater ANOVA test og Tukey HSD post-test blev anvendt.. I begge metoder væsentlighedskriterier var p. 0,05

Mann-Whitney testen blev brugt til at sammenligne andelen af ​​Caco-2 celler i forskellige cellecyklus faser (Sub-G1, G1, S, G2 og M) af octreotid-behandlede grupper og i kontrolgruppen. p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultaterne af methylering array analyse blev evalueret ved ANOVA og Tukey HSD post-test for at bestemme og sammenligne andelene af

SST

promotor-methylering i den. tre eksempler grupper.

For statistisk analyse R 3.1.0 statistisk miljø blev anvendt. Boxplots repræsenterer median og standardafvigelse data med outliers.

Resultater

Somatostatin udtryk ændringer i hyperproliferative tilstande af tyktarmen

Somatostatin mRNA ekspressionsniveauer i kolorektale biopsiprøver fra sunde unge, voksen og kolorektal cancer blev påvist under anvendelse 213921_at Affymetrix probeset ID (https://www.affymetrix.com/analysis/index.affx). mRNA ekspressionen af ​​SST ændrede ikke under normal ældning i forhold sunde unge (Ch) og voksne (N) prøver dog genekspression faldt betydeligt i kolorektal cancer (CRC) (p 0,05) i forhold til normal voksen (N) prøver

(fig. 1)

.

Real-time PCR validering på originalen, den uafhængige og de kombinerede sæt prøver kontrolleret betydeligt reduceret

SST

udtryk i CRC (p . 0,05)

(figur 2)

, og øget SST produktion hos raske prøver, uanset alder. Immunhistokemisk analyse bekræftede næsten fraværende somatostatin produktion i kolorektale karcinom prøver i forhold til unge og voksne sund colon mucosa på protein niveau (p 0,05)

(Fig 3, 4).

mRNA. udtryk microarray analyse af somatostatin (SST) gen i mikroskopisk normale colon biopsi prøver fra børn (CH) og voksne (N) og i kolorektale cancer biopsi prøve (CRCs). Røde prikker er de normaliserede mRNA udtryk værdier, boxplots repræsenterer median og standardafvigelse.

SST

udtryk faldt markant i CRC.

Validering af mRNA ekspression ændringer af somatostatin (

SST

) gen i histologiske normale colon biopsi prøver fra børn (Ch) og voksne (n) og i kolorektale cancer biopsiprøve (CRCs) under anvendelse realtid polymerasekædereaktion (RT-PCR) på kombinerede prøvesæt. Røde prikker er de normaliserede RT-PCR udtryk værdier, boxplots repræsenterer median og standardafvigelse. RT-PCR-analyse kontrolleret faldt betydeligt

SST

udtryk i CRC.

Påvisning af SST producerende celler (brun cytoplasma) under normal aldring og i kolorektal cancer (CRC). Billeder blev taget med digital mikroskop: normalt barn væv (Ch) (80 gange forstørrelse), normalt voksent væv (N) (55-gange forstørrelse) og carcinom (CRC) hos voksne (20-gange forstørrelse). kunne detekteres kun meget lavt SST proteinniveauet i CRC prøver.

Påvisning af somatostatin (SST) producerende celler i den menneskelige normale colon epitel fra børn (CH) og fra voksne (N) og i kolorektal cancere (CRCs). Røde prikker er forholdet mellem SST producerende celler sammenlignet med det samlede epitelcelle count (%); boxplots repræsenterer median og standardafvigelse af data. SST produktion faldt betydeligt i CRC.

Anti-proliferative virkninger af somatostatin-analog på kolorektal cancer celler

somatostatin analog octreotid blev tilføjet til kolorektal adenocarcinom-celler (Caco-2) i forskellige koncentrationer. Signifikant øget DNA-fragmentering (Sub-G1 population) blev målt ved flowcytometri efter 48 timer sammenlignet med kontrolcellerne, i en koncentrationsafhængig måde. I tilfælde af somatostatin-analog behandling ved højere koncentrationer end 0,1 nmol /l, er andelen af ​​apoptotiske Sub-G1 fraktioner var signifikant højere (p 0,05), end det var i kontrolgruppen, mens andelen af ​​celler i andre cellecyklusfaser ( G1, S, G2, M) var signifikant lavere. Den højeste apoptotiske fraktion (Sub-G1) og det laveste G1, S, G2, M befolkning blev målt til 5,0 nmol /l octreotid koncentration. Den flowcytometri resultater er opsummeret i

Tabel 2, Tabel 3

og

Fig. 5 fotos.

Procentdel af celler i kontrol og octreotid-behandlede grupper med gennemsnitlige og standardafvigelsesværdier. Blå søjler repræsenterer cellerne i Sub-G1 fasen, og de andele af celler i G1 + S + G2 + M fase er illustreret ved røde søjler. Ved højere koncentrationer end 0,1 nmol /l tilsat octreotid, andelen af ​​apoptotiske Sub-G1 fraktion var signifikant højere (p 0,05) end i kontrolgruppen, mens andelen af ​​celler i andre cellecyklusfaser (G1 + S + G2 + M) var signifikant lavere. Den højeste apoptotiske fraktion (Sub-G1) og den laveste (G1 + S + G2 + M) befolkning blev målt til 5,0 nmol /l octreotid koncentration. Vejviser

SST promoter DNA methylering ændringer i hyperproliferative tilstande af tyktarmen

Promotor methylering af somatostatin gen steg i normal aldring og carcinogenese. Den laveste

SST

promotor methylering blev fundet i juvenil tyktarmsepitelet (3,5% ± 1,9%), som kan karakteriseres ved kontrolleret, øget celleproliferation. I kolorektal cancer, hvor øget cellevækst er dysreguleret,

SST

methylering var imidlertid betydeligt højere (30,2% ± 11,6%) (p 0,05). Den højeste status methylering blev påvist i CRC

(Fig. 6)

.

Evaluering af promotor methylering af

SST

gen i normale kolorektale biopsi prøver fra børn (Ch) og fra voksne (n) og i kolorektale cancere (CRCs) under anvendelse methylering-følsomme restriktionsenzym methylering array analyse. Røde prikker er de promotor methylering værdier

SST

(%); boxplots repræsenterer medianen og standardafvigelse. Arrangøren methylering stiger under normal aldring og carcinogenese, og den højeste methylering rate blev påvist i de tumorform prøver.

Diskussion

Tyktarmskræft er en af ​​de hyppigste maligne tumorer med dårlig resultat i avancerede tilfælde. Dens forekomst er lav under en alder af 50, men øger det hurtigt i de ældre aldersgrupper. I de udviklede lande medianalderen på diagnosetidspunktet er ca. 70 år [8], og i de fleste CRC tilfælde er diagnosticeret over en alder af 65 [22]. Derfor kan alder betragtes som en dominerende risikofaktor for kolorektal carcinogenese [23]. Vi har tidligere vist, at forhøjede celleproliferation er et fælles træk af colorektal epitel både i barndom og i kræft med den betydelige forskel i reguleringen af ​​celleproliferation i cancer [18]. I denne undersøgelse viste vi begge på mRNA og protein niveauer at somatostatin udtryk ikke adskiller sig væsentligt hos ældre raske colon epitel i forhold til unge prøver, men det er næsten fraværende i kolorektal cancer. Promotorregionen

SST

genet viste sig at være hypermethyleret i CRC biopsier, som delvis vil kunne vendes ved demethylering i cancercellelinier. Eftersom behandling med somatostatin analog octreotid resulterede i reduceret celleproliferation og forhøjet apoptose i en human colorektal adenocarcinom-cellelinje, vores resultater tydede på, at den manglende lokale SST produktion kan bidrage til forhøjede og ukontrolleret celleproliferation i CRC.

gastrointestinale (GI) hormoner (f.eks somatostatin, cholecystokinin (CCK), gastrin, bombesin (BBS) /gastrin-frigivende peptid (GRP), neurotensin (NT), peptid YY (PYY), glucagon-lignende peptid 2 (GLP-2) ) udskilles af endokrine celler, som er placeret i tarmslimhinden og i bugspytkirtlen. Disse kemiske budbringere regulere intestinal og pankreatisk sekretion, fordøjelse, absorption, motilitet og celleproliferation. Somatostatin er et regulatorisk-inhiberende peptid, der kan betragtes som en universel udkobling hormon og derudover kan hæmme cellevækst i normale og neoplastiske væv. SST har endokrin og parakrin /autokrine virkninger, og kan binde til dens celleoverflade G-proteinkoblede receptorer (SSTR1-5) påbegyndelse signaltransduktionsveje [24].

I denne undersøgelse har vi fundet, at andelen af somatostatin-producerende celler er mindre end 1% i histologisk normale unge og voksne tyktarmsepitelet, og væsentligt reduceret i tumor-prøver. Tidligere immunhistokemiske studier har demonstreret dobbelt lokalisering af somatostatin være både i endokrine D-celler og nerver i tyktarmen [25]. Desuden

Parsons et al

. har også fundet relativt lavt antal SST-positive celler i tyktarmsepitelet [26]. I vores arbejdsgruppe

Galamb et al

. tidligere identificerede gener (fx

AMN, PTGDR

) med faldende udtryk under kolorektal tumorigenese [20,27]. I lighed med disse markører, faldt betydeligt SST produktion kan også bidrage til kolorektal cancer formation.

På grund af virkningerne af SST på mave-tarmkanalen, kan SST-analoger kan anvendes effektivt i ikke-neoplastiske tarmlidelser såsom akut variceal blødning, pancreas fistel, dumping syndrom, eller i nogle tilfælde af kronisk diarré og tarm pseudoobstruktion [28].

Anvendelse af SST-analoger er udbredt med hensyn til diagnose og behandling af neuroendokrine tumorer [29-31]. Diagnosticering af disse tumorer kan være vanskeligt og tidskrævende, der kan forværre risikoen for effektiv terapeutisk indgriben [30]. Radiomærkede somatostatinanaloger kan evince lokaliseringen af ​​primære og metastatiske tumorer, der udtrykker somatostatinreceptorer, der ikke kan påvises med konventionelle billeddannelsesteknikker grund af deres ringe størrelse [32]. Endvidere somatostatin og derivater heraf har flere positive virkninger ved behandling af neuroendokrine neoplasmer. Hæmningen af ​​hormonelle hypersekretion kan give symptomatisk lindring og tumor krympning [7]. SST analoger kan inhibere produktionen af ​​GH og IGF, fremme vækstfaktorer cancer [33]. De kan hæmme angiogenese [34,35], kan spille en immunemodulatory rolle [36,37], og kan forårsage cellecyklusstop og inducere apoptose via somatostatinreceptorer [11,14]. SST-analoger kan være sikrere lægemidler til langvarig brug end cytotoksiske kemoterapi, fordi de har færre og mildere bivirkninger som gastrointestinale klager, cholelithiasis og effekter på glukosemetabolismen [30].

SST analog scintigrafi kan anvendes til diagnosticering immunmedierede sygdomme (f.eks lymfomer, granulomatøs sygdomme og rheumatoid arthritis) [38-41] og ikke-neuroendokrine tumorer, samt [42]. Der er flere cellekultur eksperimenter, dyremodeller og kliniske studier, der undersøger de positive virkninger af SST-analoger i maligne tumorer, herunder lymfomer, brystkræft og prostatakræft [43-47].

I et klinisk studie effekten af ​​octreotid blev undersøgt i kemoterapi-refraktære patienter med mavekræft. Signifikant forbedring i overlevelse blev observeret i den behandlede gruppe, sammenlignet med den bedst understøttende behandling gruppe [48]. De positive virkninger af SST-analog terapi på hepatocellulært carcinom (HCC) er ikke klart. I samme tilfælde octreotid administration forbedret median overlevelse sammenlignet ubehandlede patienter [49,50], men efterfølgende studie i større population viste ikke overlevelse fordel for avancerede HCC patienter behandlet med langtidsvirkende octreotid sammenlignet med placebo [51].