PLoS ONE: Den Microbe-Afledt Short Chain Fatty Acid butyrat Mål miRNA-Dependent p21 genekspression i Human Colon Cancer

Abstrakt

Colon mikrobiota gære ikke-absorberet kostfibre til at producere uhyre mængder af kortkædede fedtsyrer (SCFA’er), der gavner værten gennem et utal af metaboliske, trofiske og kemoforebyggende virkninger. De kemoforebyggende virkninger af SCFA butyrat er delvist medieres gennem induktion af p21-genekspression. I denne undersøgelse vurderede vi rollen som microRNA (miRNA) i butyrat induktion af p21-ekspression. Udtrykket profiler af miRNA i HCT-116 celler og i humane sporadiske coloncancerformer blev vurderet ved microarray og kvantitativ PCR. Regulering af p21 genekspression ved MIR-106b blev vurderet ved 3’UTR luciferase reporter assays og transfektion af specifikke miRNA efterligner. Butyrat ændret ekspression af 44 miRNA i HCT-116 celler, hvoraf mange var afvigende udtrykt i tyktarmskræft væv. Medlemmer af MIR-106b familie blev reduceret i førstnævnte og øget i den sidstnævnte. Butyrat-induceret p21-proteinekspression blev dæmpet ved behandling med en MIR-106b mimic. Muterede p21 3’UTR-reporterkonstruktioner udtrykt i HCT-116-celler bekræftede direkte MIR-106b målretning. Butyrat faldt HCT-116 proliferation, en effekt vendes med tilføjelse af MIR-106b mimic. Vi konkluderer, at mikrobe-afledte SCFA’er regulerer vært genekspression involveret i tarm homeostase samt carcinogenese gennem modulation af miRNA

Henvisning:. Hu S, Dong TS, Dalal SR, Wu F, Bissonnette M, Kwon JH, et al. (2011) The Microbe-afledte kortkædede fedtsyre Butyrat Mål miRNA-afhængig p21 genekspression i human coloncancer. PLoS ONE 6 (1): e16221. doi: 10,1371 /journal.pone.0016221

Redaktør: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Spanien

Modtaget: August 23, 2010; Accepteret: 16. december 2010; Udgivet: 20 Jan 2011

Copyright: © 2011 Hu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra human microbiome Project (DK083993, HG004858), R37 DK47722 (EBC), K08 DK078046 (JHK), den Digestive Disease Research Core center DK-42.086 fra University of Chicago, og mave-tarm Research Foundation Associates ‘bestyrelse (SRD). Praktikanter blev støttet af en Research Fellowship Award fra Crohns og Colitis Foundation of America (SH), T35 DK62719 (TSD), og T32 DK07074 (SRD). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

De fleste menneskelige sporadiske kolon kræft udvikle sig gradvist som akkumulere ændringer i genekspression omdanne normal colon epitel til adenocarcinom. Denne proces indebærer et samspil mellem genetiske og miljømæssige faktorer, sidstnævnte støttet af den epidemiologiske forbindelse mellem øget forekomst af tyktarms- og endetarmskræft og faktorer såsom øget levetid, udsat for kræftfremkaldende stoffer, og kostvaner i højt industrialiserede lande [1]. Blandt de foreslåede risikofaktorer kosten er lav fiberindhold, som kan sænke biotilgængeligheden af ​​kortkædede fedtsyrer (SCFA’er), der er dannet ved mikrobiel anaerob fermentering af kostfibre [2]. SCFA’er såsom acetat, proprionat, og butyrat produceres i uhyre mængder og er de mest rigelige anioner i colon luminale væske og fæces [3]. Disse mikrobielle produkter ikke kun give en vigtig kilde til energi til colon epitel, men også har udbredt trofiske effekter, der omfatter regulering af værten gener involveret i vedligeholdelse af intestinal homeostase [4].

I udifferentieret, meget proliferativ ondartet celler, butyrat hæmmer proliferation og inducerer differentiering gennem en række mekanismer, herunder ændringer i DNA-methylering, selektiv inhibering af histon phosphorylering og histondeacetylering (HDAC), og modulering af intracellulær signalering kinase [5] – [7]. I en human colon epithelial cellelinie (HT29), blev 221 butyrat responsive gener involveret i proliferation, differentiering og apoptose identificeres [6]. Blandt generne ændret af butyrat behandling var mange involveret i cellecyklus regulering, såsom cyklin afhængige kinase inhibitor p21, GADD45A, og PTEN [6].

Under normale forhold, spredning er stramt reguleret gennem virkningen af cykliner, cyclinafhængige kinaser (CDK’er), og CDK-inhibitorer, som regulerer overgangene fra G1 til S-fasen og G2 til mitose og fungere som kontrolsteder at forhindre replikation hvis DNA er beskadiget [8]. Som svar på signaler, der angiver DNA-ødelæggelse, p21 og p27 binder til cyclin-cdk-komplekser og inducere cellecyklusstandsning [8], [9]. Men i cancer, er denne reguleret proces med celledeling og vækst tabt. For eksempel er tab af funktion af G1 checkpoint cyclin-afhængig kinase inhibitor p21 været knyttet til carcinogenese og p21 tab er observeret i 79% af coloncancer-tumorer ved immunhistokemi [10], [11].

butyrat inducerer p21 gentransskription via en p53-uafhængige vej involverer ikke-kompetitiv hæmning af HDAC [12] – [14]. Men muligheden for, at nogle af butyrat aktioner vedrørende p21-genekspression kan medieres gennem miRNA-afhængige translationelle mekanismer er ikke tidligere blevet undersøgt. HDAC-inhibitorer er for nylig blevet undersøgt som en ny gruppe af anti-cancer epigenetiske behandlingsredskaber, og en HDAC-inhibitor, suberoylanilid hydroxamsyre (SAHA), er FDA godkendt til behandling af kutant T-celle lymfom [15]. Endvidere er HDAC-hæmmere været impliceret i miRNA regulering på flere typer af maligniteter. Behandling af brystkræft cellelinje SKBR3 med hydroxamsyren HDAC-hæmmer LAQ824 ført til betydelige ændringer i ~ 40% af cellens udtrykte miRNA [16]. SAHA behandling af den humane lungecarcinom-cellelinje A549 medført væsentlige ændringer i ekspressionen af ​​64 miRNA [17]. Indflydelsen af ​​HDAC inhibitor og mikrobiel produkt butyrat på miRNA ekspression i colon cancer væv er ikke blevet undersøgt.

miRNA er -22 nukleotid, ikke-kodende RNA, som spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​celleproliferation, apoptose, og differentiering [18]. Større end 1000 humane miRNA er blevet identificeret, og de fleste menes at målrette hundredvis af gener [19]. Dysregulering af miRNA ekspression kan bidrage til carcinogenese ved at øge proto-onkogen ekspression eller nedregulering tumorsuppressorer [20]. For eksempel, miRNA regulerer mange vigtige proteiner i de signalveje af kolorektal cancer, f.eks Den miR-106b familien reducerer p21 udtryk og påvirker cellecyklusprogression [21] – [23]. Blandt MIR-106b forudsagte mål, silencing af p21 med siRNA nærmest fænokopier MIR-106b gevinst på funktion [22].

I denne undersøgelse har vi den hypotese, at anti-cancer effekter af mikroben afledt SCFA butyrat kan medieres delvist via ændringer i miRNA ekspression. Vi udførte miRNA microarray undersøgelser af humane coloncancer HCT-116 celler behandlet med butyrat og fundet signifikante ændringer i miRNA-profiler, herunder nedsat ekspression af miR-106b familie. miRNA microarray analyse af sporadisk type human coloncancerformer fundet forøget ekspression af MIR-106b familie. Butyrat blev fundet at inducere p21-ekspression, der var forbundet med et signifikant fald i celleproliferation. Tilsætningen af ​​en MIR-106b mimic vendt øget p21-ekspression og nedsat celleproliferation induceret af butyrat. Disse resultater har afsløret en unik mekanisme for mikrobiel interaktion med vært genekspression, der involverer ændringer af miRNA profiler til at begrænse celle cykling og hæmme tyktarmskræft celleproliferation.

Materialer og metoder

Etik Statement

Kirurgiske menneskelige colon biopsier blev opnået fra patienter tyktarmskræft på University of Chicago Medical center under en protokol godkendt af Institutional Review Board. Skriftligt informeret samtykke blev opnået forud for indsamlingen af ​​vævsprøver. Alle kliniske undersøgelser med humane forsøgspersoner blev udført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen.

Cell Culture

Humane HCT-116 tyktarmscancerceller blev erhvervet fra ATCC. Celler blev dyrket ved 37 ° C i høj glucose DMEM-medium (Invitrogen) indeholdende 10% (vol /vol) føtalt bovint serum, 50 pg /ml L-glutamat, 50 ug /ml streptomycin og 50 U /ml penicillin. Celler blev behandlet med 1-2 mM butyrat i 24 til 48 timer før høst for hvert enkelt assay. Celler blev skyllet to gange og skrabet over i iskold phosphatpufret saltvand (PBS), pelleteret (14.000 g x 20 sek), derefter lyseres for RNA og protein ekstraktion.

Humane biopsier fra colon

Kirurgisk humane biopsier fra colon fra tumorvæv og omgivende normalt udseende tyktarmsslimhinde (mindst 5 cm væk tumor grænse) blev opnået ved en kolorektal kirurg. Efter fjernelse blev biopsier øjeblikkeligt anbragt på is og skyllet i iskoldt PBS før cellelyse til RNA-ekstraktion.

miRNA microarray

Totalt RNA blev ekstraheret fra HCT-116-celler og humane colon vævsprøver ved hjælp af Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Ambion) ifølge producentens protokol. HCT-116 celle miRNA blev analyseret ved hjælp af miRCURY LNA ™ microarray v.11.0 (Exiqon), som indeholder indfangningsprober rettet mod alle miRNA til human, mus eller rotte registreret i miRBase version 13 på Sanger Institute. Alle prøver blev samlet for at skabe en fælles reference. Et pg totalt RNA fra hver prøve og samlet fælles reference blev mærket ved hjælp af miRCURY ™ LNA Array power mærkning kit (Exiqon, Danmark). Den Hy3 ™ -mærket prøver og en hY5 ™ -mærket henvisning RNA prøve blev blandet parvis og hybridiseret til miRCURY ™ LNA arrays. Mikroarrayet Objektglassene blev scannet under anvendelse af Agilent G2565BA Microarray Scanner System (Agilent Technologies, Inc., USA) og billedet analyse blev udført under anvendelse af Imagene 8.0 software (BioDiscovery, Inc., USA). De kvantificerede signaler blev baggrund korrigeret (Normexp med offset værdi 10) og normaliseret ved hjælp af den globale Lowess (lokalt vægtet Scatterplot Smoothing) regression algoritme [24]. Dataene er udtrykt som normaliserede log2 transformerede Hy3 /hY5 ratio.

På en tilsvarende måde blev humane colonvæv miRNA analyseret under anvendelse Mirvana miRNA Bioarrays v.2 (Ambion), som benytter version 8.0 af miRBase sekvens database. Prøverne blev mærket med Mirvana miRNA mærkning kit og hybridiseret til de miRNA bioarrays pr producentens anvisninger. De arrays blev scannet ved hjælp af GenePix4000B i University of Chicago Functional Genomics Core Facility. I alt 12 miRNA profiler blev genereret fra 6 parrede colon vævsprøver.

Real-time PCR for miRNA

Total RNA blev ekstraheret fra pelleterede HCT-116 celler ved Trizol (Invitrogen, Grand Island , NY) ifølge fabrikantens instruktioner. Komplementært DNA blev syntetiseret fra total RNA-prøver ekstraheret fra HCT-116-celler eller humane colonvæv vha NCode ™ miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen). Real-time PCR blev udført med en iCycler (Bio-Rad) ved anvendelse af iQSYBR Green PCR Supermix (Bio-Rad) med miRNA specifikke primere og en universel qPCR Primer ifølge producentens protokol for NCode Kit (tabel S1). To-trins kvantificering cyklus-forløb (45 cykler ved 95 ° C i 15 sekunder og derefter 60 ° C i 15 sekunder) anvendt. Ct-værdi er defineret som antallet af cykler, hvor fluorescensen krydser en fast tærskelværdi over grundlinjen. En lille nucleolar RNA, RNU48, blev målt som endogen kontrol [25]. For en relativ kvantificering, blev fold ændringer målt under anvendelse af ΔΔCt metoden. For hver prøve blev Ct værdi af hver miRNA måles og sammenlignes med RNU48 som ACt, (ACt = Ct

miRNA – Ct

RNU48). Den fold ændring af miRNA i eksperimentelle prøver i forhold til at kontrollere prøverne blev bestemt ved 2

-ΔΔCT, hvor ΔΔCt = ACt

Unknown -ΔCt

Kontrol [26]

.

Fast -tid PCR for p21 mRNA

Totalt RNA blev ekstraheret fra pelleterede HCT-116 celler med Trizol. Komplementært DNA blev syntetiseret ved anvendelse SuperScript III (Invitrogen) og en tilfældig hexonucleotide primer. Sense- og antisense-primere for p21 (CDKN1A, NM_000389.3) er: 5′-TCACTGTCTTGTACCCTTGTGCTT-3 ‘og 5’AGAAATCTGTCATGCTGGTCTGCC-3′; for GAPDH: 5’-GGCAAATTCAACGGCACAGT-3 ‘og 5′-AGATGGTGATGGGCTTCCC-3’. Real-time PCR blev udført med en iCycler hjælp iQSYBR Green PCR Supermix (Bio-Rad). For hver prøve blev Ct værdien af ​​p21 mRNA målt og sammenlignet med GAPDH endogene kontrol som ACt, (ACt = Ct

p21 – Ct

GAPDH). Den gange ændring af miRNA i eksperimentelle prøver i forhold til kontrol prøverne blev bestemt ved 2

-ΔΔCT.

Western Blot

pelleteret HCT-116-celler blev homogeniseret i 10 mM Tris, pH 7,4 , 5 mM MgC

2, komplet proteaseinhibitorcocktail (Roche Molecular Biochemicals), 50 U /ml DNAse (Amersham) og 50 U /ml RNAse (Ambion). Protein blev kvantificeret under anvendelse af bicinchoninsyre-metoden. Protein blev solubolized i 3X Laemmli stopopløsning ved opvarmning til 65 ° C i 10 minutter.

Tyve mikrogram proteinprøver blev adskilt ved SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner i 25 mM Tris, pH 8,8 ; 192 mM glycin; 15% vol /vol methanol. Membraner blev blokeret med 5% vægt /volumen ikke-fedtholdig tørmælk i mellemdækket tris saltvand (TTBS). Primære antistoffer, der er specifikke for p21 (BD Bioscience), Hsc70 (SPA815, StressGen) og β-actin (Cell Signaling) blev tilsat og inkuberet natten over ved 4 ° C. Membraner blev vasket med TTBS, inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugerede arter-passende sekundære antistoffer (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) i 1 time ved stuetemperatur, og udviklet ved hjælp af et forøget kemiluminescens-system (Supersignal; Pierce, Rockford, IL).

Kvantificering af billeder blev udført ved scanning densitometri hjælp NIH billede J 1,54 software (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).

Cell proliferation Assay

Cell proliferation blev målt ved anvendelse af WST-1 reagens (Roche Applied Science) ifølge producentens protokol. HCT-116-celler blev dyrket på en 96 brønds fladbundet plade. Efter at have nået 50% konfluens, blev brønde behandlet med den angivne koncentration af butyrat i 24 timer. Pladerne blev aflæst på en mikropladelæser ved 450 nm før og 45 minutter efter tilsætning af WST-1 reagens. Henvisningen bølgelængde var 650 nm. Celleproliferation blev beregnet ifølge producentens protokol.

Cell transfektion med miRNA

Transit-LT1 (Mirus, WI) transfektionsreagens blev anvendt til at transficere HCT-116-celler med et konstrueret miR- 106B (Ambion Pre-MIR miRNA precursormolekyler) ifølge fabrikantens protokol. En kontrolgruppe miRNA (MIR-C), med identiske GC-indhold, men ingen sekvenshomologi med MIR-106b, blev anvendt som kontrol. Celler blev transficeret i 48 timer før høst.

luciferasereporteren Assays Salg

Modified pGL3-konstruktioner med p21 3’UTR nedstrøms for den ildflueluciferase-kodende sekvens blev en generøs gave fra Dr. V. Narry Kim af Biologisk Institut, Seoul National University [27]. Seks timer efter butyrat behandling blev HCT-116 celler forbigående transficeret med modificerede pGL3 konstruktioner og pRL-TK plasmider (Renilla luciferase drevet af thymidinkinasepromotor, E2241, Promega) ved hjælp Transit LT-1 transfektion reagens. Celler blev høstet ved omrystning i 500 pi lysisbuffer (Promega). Firefly og

Renilla

luciferaseaktiviteter i lysatet blev bestemt tre gange med en Dual-Luciferase Reporter assaysystem, i overensstemmelse med producentens instruktioner (Promega). Ildflueluciferaseaktivitet, blev normaliseret til

Renilla

luciferaseaktivitet.

Statistical Analysis

Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SEM for det angivne antal forsøg. Resultaterne af flere forsøg blev analyseret ved t-test eller ANOVA hjælp Bonferroni korrektion for multiple sammenligninger.

For miRNA arrays, en to-halet t-test beregnet mellem prøven og referencegrupper identificeret miRNA med p -værdier lavere end 0,05. Disse miRNA blev derefter valgt til yderligere undersøgelse med RT-PCR.

Resultater

Butyrat ændrer miRNA udtryk i humane tyktarmskræft HCT-116 celler, herunder medlemmer af miR-106b familie

for at undersøge effekten af ​​butyrat på miRNA udtryk i colon cancerceller, blev udtryk profiler af miRNA i butyrat-behandlet HCT-116 celler målt ved hjælp af et microarray. Vehikelbehandlede HCT-116-celler blev analyseret som kontrol. Fyrre-fire miRNA viste væsentlige ændringer i udtryk som reaktion på butyrat behandling. Ændringerne i ekspressionen af ​​13 af de 26 miRNA som faldt og 5 ud af de 18 miRNA at øget blev bekræftet under anvendelse af real-tid, kvantitativ PCR (fig S1). Tredive-en af ​​de 44 miRNA med ændringer i udtryk vises i varmen kortet i venstre panel i figur 1A. Flere medlemmer af miR-17-92a, miR-18b-106a og miR-25-106b klynger blev signifikant reduceret i respons på butyrat.

A) miRNA microarray-profiler blev udført på RNA udvundet fra HCT- 116 celler behandlet med vehikel eller 1 mM butyrat og human colon væv fra patienter med sporadisk coloncancer og tilstødende normalt udseende væv. Dataene blev normaliseret ved hjælp af den globale Lowess regression algoritme og udtrykkes som log basis 2 transformerede forhold mellem prøvens signal til kontrol henvisningen pool signal. Heat maps er repræsenteret. Den røde farve i varmen kortet repræsenterer forøget udtryk i forhold til de sammenfattede henvisningen kontrol, og grøn repræsenterer reduceret udtryk sammenlignet med pooled kontrol. Ændringer i ekspressionen af ​​MIR-17 – 106b familie blev bekræftet ved real-time PCR i B) HCT-116-celler og C) human colon væv. Resultaterne er middel ± SE, n = 4. * angiver p. 0,05 for prøve i forhold til kontrol

Expression niveauer af disse miRNA blev også vurderet i humane sporadiske kolon kræft og omkringliggende normalt udseende kolon ved microarray og er vist i den højre panel i figur 1A. De miRNA faldt i butyrat-behandlet HCT-116 celler blev dramatisk forøget i tumorvæv sammenlignet med normale kontroller. Mirs-17, -20a, -20b, -93, -106a og -106b var alle faldt som reaktion på butyrat behandling. Disse miRNA deler den samme frø region sekvens og dermed målrette de samme bindingssteder i 3’UTRs af target mRNA. Brug real time PCR, vi bekræftet, at butyrat nedreguleret disse miRNA i HCT-116-celler (Figur 1B). Vi bekræftede også, at disse miRNA var meget over-udtrykt i humane coloncancer prøver (figur 1C), hvilket tyder på, at nogle anti-cancer effekter af butyrat medieres ved at undertrykke de miRNA, der er opreguleret i tyktarmskræft.

miR -106b inhiberer butyrat-induceret p21-proteinekspression

Tidligere undersøgelser viste, at 3’UTR af p21, som regulerer cancercelleproliferation, indeholder to bindingssteder for den mIR-17 – 106b frø sekvens (figur 2A) og hæmmes af disse miRNA i forskellige former for kræft [revideret i 13-15, 22]. Vi har derfor analyseret virkningerne af butyrat og en MIR-106b efterligne på p21 mRNA og protein niveauer i HCT-116-celler. Som vist i figur 2B og 2C, butyrat forøget p21-proteinekspression fire fold efter 24 timers behandling. En eksogen miR-106b efterligner fugtet butyrat-induceret p21 protein-ekspression i forhold til celler behandlet med butyrat alene mens styre miRNA molekyler havde ingen effekt på p21 udtryk.

A) Skematisk af fælles frø regioner i miR-17 – 106b familie, der er rettet mod p21 3’UTR på to steder. HCT-116-celler blev behandlet med butyrat (2 mM) eller vehikel og blev transficeret med MIR-106b efterligner eller kontrol miRNA (MIR-C) i 24 timer før høst. B) Western blots for p21, β-actin og Hsc70 er vist, og er repræsentative for 4 individuelle forsøg alle med lignende resultater. C) densitometri resultaterne af Western blots af p21 normaliseret for p-actin. D) p21 mRNA overflod blev analyseret ved real-time PCR. Resultater er middeltal ± SE, n = 4. * viser p 0,05 sammenlignet med basal. # Indikerer p 0,05 sammenlignet med kontrol

For at bestemme virkningen af ​​butyrat og miRNA på p21 genekspression blev cellulære p21-mRNA-niveauer målt ved real-time PCR (figur 2D).. Butyrat inducerede en 3,6 gange stigning i p21 mRNA rigelighed. I modsætning hertil miR-106b efterligner havde ingen effekt på p21 mRNA-ekspression.

3’UTR af p21 medierer translationel regulering af butyrat og miR-106b

For at undersøge effekten af ​​miR- 106b på translationel regulering af p21-ekspression, HCT-116-celler blev transient transficeret med modificerede luciferase reporter vektorer indeholdende enten vildtype p21 3’UTR eller p21 3’UTRs indeholdende mutationer i enten den ene eller begge af mIR-106b bindingssteder (figur 3A). Ildflue-luciferase-ekspression blev anvendt til at vurdere cis regulering via p21 3’UTR. PRL-TK vektor, der udtrykker Renilla luciferase blev cotransficeret til kontrol for transfektionseffektivitet. Under basale betingelser, mutationer i de enkelte MIR-106B målregioner i p21 3’UTR ved nucleotiderne 468-474 og nukleotider 1148-1154 resulterede i en 28% og 26% stigning i luciferaseaktivitet (figur 3B). Endvidere mutationer i begge MIR-106b målregioner resulterede i en stigning i luciferaseaktivitet 57%, hvilket tyder på, at begge bindingssteder medierer miRNA inhibering af basal p21-ekspression i cancerceller.

A) Skematisk af luciferase reporterkonstruktioner indeholdende p21 mRNA 3’UTR, som omfatter to bindingssteder for den mIR-17-106b familie. Mutationer blev dannet i disse MIR-106B målsteder. HCT-116-celler blev forbigående co-transficeret med ildflue luciferase pGL3 vektorer indeholdende vildtype eller muteret p21 3’UTR og pRL-TK Renilla luciferase kontrolvektoren. Celler blev også behandlet med butyrat (2 mM) eller vehikel og MIR-106b efterligner eller kontrollere miRNA molekyler (MIR-C). Celler blev høstet til luminescensmåling 48 timer efter transfektion. B) Basal luciferase ekspression af reporter-konstruktioner med vildtype eller muteret p21 3’UTR. * Angiver p 0,05 sammenlignet med p21 3’UTR C) Luciferaseekspression i celler efter butyrat og miRNA behandling. * Angiver p 0,05 sammenlignet med kontrol. Resultaterne er gennemsnit ± SE, n = 4.

butyrat stimuleret luciferaseaktivitet 85% i forhold til kontrol i HCT-116-celler transficeret med luciferase indeholdende p21 3’UTR vektor (figur 3C). Butyrat virkninger på luciferaseekspression blev vendt ved tilsætning af exogene MIR-106b efterligner, men ikke kontrol miRNA molekyler (MIR-C). Endvidere blev luciferaseaktiviteten af ​​HCT-116-celler transficeret med den kimære vektor indeholdende både mutant MIR-106b målsteder ikke ændret med butyrat behandling eller med butyrat i nærværelse af exogent MIR-106b.

butyrat virkning på celleproliferation inhiberes af mIR-106b

Da p21 inhiberer cellecyklusprogression undersøgte vi rollen som mIR-106b på butyrat anti-proliferative virkninger. HCT-116-celler blev behandlet med flere fortyndinger af butyrat i 24 timer og en WST-1 proliferation assay blev udført. Som vist i figur 4A, butyrat dosisafhængigt inhiberede celleproliferation. De antiproliferative butyrat var koncentrationerne i det fysiologiske område på 0,5 til 20 mM [28], [29]. Celler transficeret med exogent MIR-106b eller kontrol i 24 timer før til 2 mM butyrat eksponering blev også analyseret (figur 4B). Den butyrat-induceret hæmning af celleproliferation blev vendt ved tilsætning af MIR-106B efterligner molekyler på en dosis-afhængig måde (figur 4B). I modsætning hertil styre miRNA molekyler (MIR-C) viste ingen virkning på butyrat-induceret hæmning af celleproliferation.

HCT-116-celleproliferation blev målt med WST-1 proliferation kit. A) HCT-116-celler blev behandlet med den angivne koncentration af butyrat eller vehikel i 24 timer før WST-1 måling. * Angiver p 0,05, sammenlignet med basal B) HCT-116-celler blev transficeret med MIR-106b efterligner eller kontrol miRNA (MIR-C) med de angivne koncentrationer umiddelbart før behandling med 2 mM butyrat. Celler behandlet kun med butyrat blev analyseret som kontrol. * Angiver p 0,05 sammenlignet med butyrat alene. Resultaterne er middel ± SE, n = 5.

Diskussion

I denne undersøgelse, vi identificerer, for første gang, en vigtig regulerende rolle vækst for colon epitel miRNA i mediere virkninger af mikroben-afledte kortkædet fedtsyre butyrat på host-genekspression. Interessant nok i HCT-116-celler, butyrat undertrykt mange af de samme miRNA steg i humane coloncancerformer. En af disse miRNA, MIR-106b, blev fundet at målrette p21. Butyrat og MIR-106b behandling af en p21 3’UTR luciferase-reporterkonstruktion i HCT116-celler indikerer, at butyrat-stimulerede p21 ekspression translationelt inhiberes delvist af MIR-106b. Denne delvis hæmning af miR-106b bekræfter tidligere rapporter om, at butyrat regulerer også p21 udtryk via en miRNA uafhængig mekanisme, gennem sin hæmning af HDAC [7], [13], [14]. Vi foreslår, at mikrobielle produkt butyrat regulerer cellecyklus gennem både epigenetiske og translationel regulering gennem sin dobbelte rolle som HDAC-hæmmer og hæmmer af miR-106b udtryk (figur 5).

Butyrat hæmmer histon deactylases (HDAC) , hvilket tillader øget histonacetylering, faldt højere orden chromatin foldning, og øget transskription af p21. Butyrat mindsker også ekspressionen af ​​MIR-106b, og flere andre miRNA med samme frø sekvens region. MIR-106b familien hæmmer p21 oversættelse, og derfor faldt udtryk for miR-106b familie fører til øget p21 oversættelse.

Disse resultater har stor betydning for tarm homeostase og carcinogenese. Disse data tyder på, at disse miRNA spiller en rolle i colon carcinogenese og at deres reduktion med butyrat er en vigtig mekanisme af dens anti-cancer effekt. Seks af disse miRNA er i samme miRNA familie (MIR-17, MIR-20a, MIR-20b, MIR-93, MIR-106a, og MIR-106b), deler en identisk frø sekvens, og således rettet mod de samme bindingssteder i 3’UTRs af target mRNA. Derfor undertrykkelse af deres målgener under den kræftfremkaldende proces kan repræsentere en mønstret cellerespons at fremme celleproliferation og /eller vedligeholdelsen af ​​udifferentierede tilstand.

Fordi mange miRNA er også placeret i intron-regioner kodende gener, den miRNA respons sandsynligvis koordineret med transciptionally aktiverede gener, der bidrager til den samlede proces i carcinogenese. Som et eksempel relevant for vores resultater, er MIR-106b-25 polycistron placeret inden intron 13 i MCM7 genet på kromosom 7q22.1 [23]. MCM7 (minikromosom vedligeholdelse protein 7) regulerer DNA-replikation under S-fasen. I hvilende celler, humane MCM7 mRNA-niveauer er næsten ikke målbart, men dets ekspression induceres som celler ind i cellecyklus. Den MCM7 promotoren har tre E2F-steder, tre GC-bokse og en E box [30]. I hepatocellulært carcinom (HCC), ekspressionen af ​​MIR-106b precursor tæt korreleret til MCM7 ekspression, hvilket indikerer, at MIR-106b-25 polycistron koordineret transkriberes under indflydelse af MCM7 promotoren. Høje niveauer af ekspression af transkriptionsfaktoren E2F1 i HCC også korreleret med øget MIR-106b ekspression [31]. I gastriske cancerceller, E2F1 også synes at regulere MIR-106b-25 ekspression parallelt med stigninger i MCM7 ekspression [32]. I musefibroblaster transformeret med VVM og Ras onkogener, butyrat nedsætter E2F1 udskrifter og protein samt promoter aktivering [33]. Således kan butyrat udøve sin virkning på MIR-106b ekspression via nedsat E2F1-ekspression, selv om yderligere undersøgelser i HCT-116-celler er nødvendige for at undersøge denne mulighed.

Som tidligere angivet dysregulering af miRNA ekspression kan påvirke carcinogenese når miRNA målene er tumorsuppressorer eller onkogener. Mens behandling med MIR-106b fører til nedsat p21-proteinekspression, p21 mRNA niveauer ikke ændres, hvilket er konsistent med tidligere rapporter om, at MIR-106b regulerer p21 gennem translationel inhibering stedet mRNA-stabilitet [32]. Selvom MIR-106b regulering af p21-ekspression er blevet beskrevet i mange celletyper, der er modstridende data om den mekanisme af denne interaktion. I humane mammae epitelceller og normale lungefibroblaster, MIR-106b faldt p21 mRNA med ca. 40% [22]. I modsætning hertil HCC viste p21-ekspression ingen sammenhæng med ekspressionen af ​​miR106b-25 klynge, og synes ikke at være et mål for disse miRNA i denne celletype [31]. I en menneskelig gastrisk karcinom afledt cellelinje, miR-106b undertrykt p21 protein udtryk, men forårsagede ikke en signifikant ændring i p21 mRNA-niveauer [32].

Sammenfattende vi har opdaget en ny virkningsmekanisme for butyrat anti-cancer effekter involverer modulation af miRNA profiler og oversættelse-afhængig genekspression. Som ét eksempel butyrat inducerer ekspression af p21, en vigtig regulerende molekyle af standsning af cellecyklus, ved at undertrykke medlemmer af MIR-106b familie. Butyrat inhibering af MIR-106b er også forbundet med et signifikant fald i cancercelleproliferation satser. Sidstnævnte vendes ved tilsætning af MIR-106b efterligner. Disse resultater har afsløret et enestående eksempel på mikrobiel regulering af host genekspression, der forsinker celle cykling og hæmmer tyktarmskræft celleproliferation.

Støtte Information

Figur S1.

Butyrat ændrer markant udtryk for fyrre-fire miRNA i HCT-116 celler. HCT-116-celler blev behandlet med 1 mM butyrat i 24 timer. Isolerede totalt RNA blev underkastet miRNA-array-hybridisering. Fyrre-fire miRNA viste væsentlige ændringer i udtryk som reaktion på butyrat behandling. Microarray data normaliseret ved hjælp af den globale Lowess regression algoritme og udtrykkes som log basis 2 transformerede forhold mellem prøvens signal til kontrol henvisningen pool signal. Ændringerne i miRNA udtryk blev bekræftet ved hjælp af real-time, kvantitativ PCR for 13 af de 26 miRNA, der faldt og fem af de 18 miRNA s at øget

doi:. 10,1371 /journal.pone.0016221.s001

( TIF)

tabel S1.