PLoS ONE: Nedskrivning af Lysosomal aktivitet som en terapeutisk Modalitet Målretning Cancer Stamceller af embryonale rhabdomyosarcoma cellelinje RD

Abstrakt

rhabdomyosarcoma er den hyppigste bløddelssarkom hos børn og unge, med en høj grad af tilbagefald der dramatisk påvirker det kliniske resultat. Multiagent kemoterapi i kombination med kirurgi og /eller strålebehandling, er behandlingen af ​​valg. Men tilbagefald sats er skuffende høj, og er et presserende behov identifikation af nye terapeutiske redskaber. Under denne henseende, den selektive blok af de vigtigste funktioner for kræft stamceller (CSC), synes særligt lovende. I denne undersøgelse, vi isoleret rhabdomyosarcom- CSC med stamceller-lignende funktioner (høj ekspression af NANOG og OCT3 /4, selvfornyelse evne, multipotency). Rhabdomyosarcom CSC viste højere invasiv evne og en nedsat cytotoksicitet til doxorubicin i sammenligning med native celler, gennem en mekanisme relateret til den klassiske multilægemiddelresistens proces. Dette var afhængige af et højt niveau af lysosom syreindhold medieres af en høj ekspression af vacuolær ATPase (V-ATPase). Da det ikke var forbundet med andre pædiatriske kræftformer, ligesom Ewings sarkom og neuroblastom, V-ATPase højere udtryk i CSC var rhabdomyosarcoma specifik. Inhibering af lysosomale forsuring af V-ATPase-inhibitor omeprazol, eller ved specifik siRNA silencing, signifikant forøget doxorubicin cytotoksicitet. Uventet lysosomal målretning blokerede også cellevækst og reducerede invasive potentiale rhabdomyosarcom CSC, selv ved meget lave doser af omeprazol (10 og 50 pM, henholdsvis). Baseret på disse observationer, vi foreslår lysosom surhed som et værdifuldt mål at øge kemosensitivitet af rhabdomyosarcom- CSC, og foreslå brugen af ​​anti-V-ATPase agenter i kombination med standard regimer som et lovende redskab til udryddelse af minimal residual sygdom eller forebyggelse af metastatisk sygdom

Henvisning:. Salerno M, Avnet S, Bonuccelli G, Hosogi S, Granchi D, Baldini N (2014) Nedskrivning af Lysosomal aktivitet som en terapeutisk Modalitet Målretning Cancer Stamceller af embryonale rhabdomyosarcoma cellelinje RD . PLoS ONE 9 (10): e110340. doi: 10,1371 /journal.pone.0110340

Redaktør: Adriano Angelucci, University of L’Aquila, Italien

Modtaget: Maj 2, 2014 Accepteret: September 21, 2014; Udgivet: 20 okt 2014

Copyright: © 2014 Salerno et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en FIRB tilskud (RBAP10447J til N. B.) fra det italienske undervisningsministerium, universiteter og forskning; fra den italienske sammenslutning for Cancer Research (AIRC 11426 til N. B.); og af det italienske ministerium for sundhed, Finansiel støtte til videnskabelig forskning “5 promille 2010”. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

rhabdomyosarcoma (RMS) er den hyppigste solid tumor i barndommen, histologisk featuring forskellige mønstre af tværstribede muskler differentiering og kendetegnet ved en meget aggressiv klinisk adfærd [1]. Selvom resultatet af RMS patienter markant har forbedret i løbet af de sidste to årtier baseret på anvendelse af kirurgi og /eller strålebehandling i kombination med kemoterapi, tilbagefald forekomme stadig i 30-40% af nonnmetastatisk patienter. Desuden ca. 15% af børn med RMS viser tegn på systemisk sygdom på tidspunktet for diagnosen. Disse “højrisiko” emner har begrænset behandlingsmuligheder og en dårlig prognose [2], hvorfor det presserende behov for at identificere nye behandlinger baseret på et indgående kendskab til RMS biologi.

Et stigende mængde af beviser tyder på, at den utilstrækkelige af aktuelle anticancerbehandlinger at udrydde minimal residual sygdom og forebygge tilbagefald dels afhænger af deres manglende evne til at målrette den delmængde af hvilende eller lav-prolifererende tumorceller, kendt som cancer stamceller (CSC) [3]. CSC blev først identificeret i leukæmier [4] og efterfølgende beskrevet i flere solide tumorer [5], [6], [7], herunder sarkomer [8], [9], [10], [11], [12]. Det er almindeligt accepteret, at CSC effektivt indlede tumorer, display stamceller-lignende funktioner, og er ansvarlige for lokal og systemisk tilbagefald på grund af manglende respons til anticancer midler [3]. Et forhold mellem CSC og minimal residual sygdom er blevet rapporteret [13], hvilket kraftigt antyder, at målrette disse celler ville holde et betydeligt potentiale for at forbedre resultatet af patienter behandlet med konventionelle anticancer midler. Faktisk CSC-lignende kemoterapi elementer er allerede blevet også identificeret i RMS [14], [15].

Microenvironmental betingelser er i stand til væsentligt at modulere stemness fænotype under fysiologiske betingelser samt i kræft. Især i CSC niche, tumorceller svare hypoxi ved at konvertere fra aerob respiration til glycolyse, som herefter frembringer mælkesyre og forårsager lokal acidose. Tilstedeværelsen af ​​sådanne ejendommelige microenvironmental funktioner er blevet relateret til induktion og vedligeholdelse af multipotency og stemness [16]. Ekstracellulær acidose er derfor en vigtig aktør i dannelsen og vedligeholdelsen af ​​CSC, fordi, per se, er i stand til at fremme en stilk-lignende fænotype. Det er allerede kendt, at maligne tumorer, herunder sarcomer, er karakteriseret ved en sur ekstracellulære miljø, og at cancerceller indeholder sædvanligvis en signifikant mængde sure lysosomer. Disse funktioner er i overensstemmelse med flere funktioner i malignitet, herunder invasiv og modstandsdygtighed over for anticancer behandlinger [17]. Faktisk ophobning af basiske lægemidler i sure vesikler, eller deres neutralisering gennem forsuring af det ekstracellulære miljø er en effektiv mekanisme for kemoresistens og kan lette tumor invasion [18], [19]. . Af denne grund er CSC opførsel påvirket af biokemiske og biofysiske variabler af det ekstracellulære rum

I denne undersøgelse udforskede vi rollen af ​​lysosom forsuring, påført vakuolær (H +) – ATPase (v-ATPase ) protonpumpe som en ejendommelig mekanisme giver en selektiv fordel til RMS CSC. Vi viste, at V-ATPase er involveret i invasivitet samt i kemosensitivitet af disse celler, og at sådanne træk ved malignitet kan helt vendes ved blokering af syrning ved terapeutiske doser af protonpumpehæmmere (PPI), hvilket tyder på den potentielle fordel af denne klasse af lægemidler i kombination med konventionelle anticancer midler til effektivt at målrette RMS CSC.

Materialer og metoder

Cellelinjer

RD (RMS), MG-63 (osteosarkom ), SK-ES-1, A-673 (Ewings sarkom, ES), SH-SY5Y, NB-100, og CHP-212 (neuroblastom, NB) cellelinier blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket i IMDM (Life Technologies), plus 20 U /ml penicillin, 100 mg /ml streptomycin og 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS) (komplet medium). Multiresistent MG-63-celler blev isoleret ved trinvis eksponering for stigende doser af doxorubicin (DXR). Det resulterende MG-63 cellelinie, der voksede eksponentielt i nærvær af 100 ng /ml DXR blev udpeget som multiresistent variant MG-63-DXR100. MG-63-DXR100 blev kontinuerligt udsættes for 100 ng /ml DXR at opretholde den resistente fænotype multilægemiddelresistens [20].

Sphere kulturer

Sphere-dannende celler blev opnået som tidligere beskrevet [12 ]. Kort fortalt alle celler blev dyrket i forankringsuafhængige betingelser i DMEM: F12-medium med progesteron (20 nM), putresceine (10 mg /ml), natriumselenit (30 nM), apo-transferrin (100 ug /ml) og insulin (25 ug /ml) (Sigma-Aldrich) i lav-vedhæftede kolber (Nunc). Frisk human epidermal vækstfaktor (20 ng /ml) og basisk fibroblastvækstfaktor (10 ng /mL) (PeproTech) blev tilsat to gange om ugen, indtil cellerne begyndte at vokse danne flydende aggregater, opkaldt rhabdospheres. Kulturer blev ekspanderet ved mekanisk dissociation af kuglerne, efterfulgt af re-udpladning af celler og resterende celleaggregater i komplet medium. Kun kulturer stand til vækst under spherogenic kolonier og vise stamcelle-relaterede funktioner blev overvejet. Kuglerne blev analyseret under serum sultet medium på lave vedhæftede substrater (ikke klæbende tilstand) eller omliggende tilstand i nærvær af serum, afhængigt af assayet. Alle de isolerede kugler blev karakteriseret for ekspression af stamcelle-relaterede markører (NANOG og OCT3 /4), og kun for RMS CSC, for kuglen danner effektivitet og multipotency.

Karakterisering af stamceller egenskaber rhabdospheres

kuglen-dannende effektivitet under serielle passager blev undersøgt ved udpladning enkeltceller fra rhabdospheres ved en densitet på 2.000 celler /ml i en 48-brønds plade til opnåelse af nye sfærer. Det samlede antal tumor sfærer blev talt, og kuglerne dissocieres for at opnå den anden og tredje generation af kugler. Til bedømmelse multipotency blev rhabdospheres opretholdes som adhærente kulturer i 3 dage og derefter udsået i forskellige forhold. Kort fortalt, for osteogen differentiering, 100.000 celler blev podet i plader med 6 brønde og dyrket i α-MEM suppleret med 10% FBS, 10 mM β-glycerophosphat, 10

-8 M dexamethason og 50 mg /ml L-ascorbinsyre -2-phosphat (Sigma). Efter 14 dage blev cellerne fikseret med 3,7% paraformaldehyd, og mineralisering blev evalueret ved farvning med 1% alizarinrødt S (pH 4,2; Sigma-Aldrich). For adipogenisk differentiering, blev 100.000 celler podet i en 6-brønds plade og dyrket i DMEM høj glucose (Lonza) suppleret med 10% FBS, 0,5 uM dexamethason, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthin, og 50 uM indomethacin (Sigma- Aldrich). Efter 17 dage blev cellerne fikseret og lipider farvet med 0,3% Olie-rød-O. For chondrogen differentiering, blev 500.000 celler centrifugeret i en 15 ml polypropylen konisk rør og inkuberet i DMEM høj glucose suppleret med 10% FBS, 10 mg /ml TGFp1 (PeproTech), 100 uM L-ascorbinsyre 2-phosphat, 6,25 ug /ml insulin, 40 pg /ml L-prolin (Sigma-Aldrich). Efter 3 uger blev snit afledt af chondrogene pellets farvet med Alcian blå (pH 2,5).

Genekspression

Genekspression blev vurderet til at bestemme stamcelle-relaterede funktioner og yderligere karakterisering kuglen kulturer . Totalt RNA blev isoleret fra RMS, ES, og NB flydende kugler eller native celler med NucleoSpin RNA II (Macherey-Nagel), og revers transkriberet. Udtrykket af mRNA for OCT3 /4 (NM_002701.4), NANOG (NM_024865.2), MDR1 (AF016535.1), ATPase V

0C (NM_001101.2), matrixmetalloproteinase (MMP) 9 (NM_004994.2 ), og CXC kemokinreceptor-4 (CXCR4) (NM_001008540.1) blev evalueret under anvendelse af en Light Cycler instrument (Roche Diagnostics), amplifikation 1 ug cDNA og den universelle probebibliotek (Roche Applied Science). Sonder og primere blev valgt ved hjælp webbaseret assay design software (ProbeFinder https://www.roche-applied-science.com): OCT3 /4-f 5′-CTTCGCAAGCCCTCATTTC-3′; OCT3 /4-r 5′-GAGAAGGCGAAATCCGAAG-3 ‘; NANOG-f 5’-ATGCCTCACACGGAGACTGT-3 ‘; NANOG-R 5’-AGGGCTGTCCTGAATAAGCA-3 ‘; MDR1-f 5’-GCCATCAGTCCTGTTCTTGG-3 ‘; MDR1-R 5’-GCTTTTGCATACGCTAAGAGTTC-3 ‘; ATPase V

0C-f 5′-TTCGTTTTTCGCCGTCAT-3 ‘; ATPaseV

0C-r 5′-CCACTGGGATGATGGACTTC-3 ‘; MMP9-f 5’-GAACCAATCTCACCGACAGG-3 ‘; MMP9-R 5’-GCCACCCGAGTGTAACCATA-3 ‘. Resultaterne blev udtrykt som forholdet mellem genet af interesse og TATA-bindende protein (TBP, NM_003194.4; TBP-f 5’-TTGGGTTTTCCAGCTAAGTTCT-3 ‘; TBP-R 5′-CCAGGAAATAACTCTGGCTCA-3’) som reference gen ifølge den 2

-ΔΔCT metode [21].

Western blotting

Western blotting blev udført for at detektere stamcelle-relaterede markører OCT3 /4 og NANOG samt MDR1, ATPase V

0A1 underenhed, og TBP. Flydende kugle eller native celler blev lyseredes med varm lysepuffer (1% SDS, Tris pH 7,4 20 mM, 5% β-mercaptoethanol) til analyse af OCT3 /4 og NANOG, eller med RIPA-buffer (Tris, pH 7,6 50 mM, NaCl 150 mM, Triton-X 100 5%, natriumdeoxycholat 0,25%, EGTA pH 8 1 mM, NaF 1 mM, Sigma) suppleret med proteasehæmmere (Roche), for de andre proteiner. Lige mængder af protein lysater blev underkastet reducerende SDS-PAGE på en polyacrylamidgel, efterfulgt af immunoblotting-analyse. Blots blev probet med en fåre-anti-OCT3 /4 (Abcam), et muse-anti-NANOG (Abcam), et muse-anti-MDR1 (D-11, Santa Cruz), en kanin-anti-ATPase V

0A1 (Abcam ) eller et kanin-anti-TBP (Santa Cruz) som reference. Inkubation med peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer følges. Reaktionen blev afsløret ved en kemiluminescens-substrat (Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate, Thermo Scientific). Immunblot-assays blev gentaget tre gange. Signalet fra hvert bånd blev kvantificeret af en dedikeret software til densitometrisk evaluering (VisionWorksLS Analysis Software, Biospectrum, UVP).

Immunofluorescens

Til farvning af V-ATPase, fik rhabdospheres lov til at klæbe i 24 timer i komplet medium og fikseret, derefter inkuberet med et anti-V-ATPase V

0A1 polyklonalt antistof (Sigma-Aldrich), efterfulgt af et sekundært anti-kanin-antistof Alexa grøn 488 nm (Life Technologies). At observere vesikulær lokalisering af V-ATPase, actin cytoskeleton blev co-farvet under anvendelse af 0,5 ug /ml Phalloidin-tetramethylrhodamin B isothiocyanat (TRITC) fluorescerende farvestof (Sigma). Kerner blev modfarvet med Hoechst 33258 (Sigma), og cellerne blev observeret af konfokal mikroskopi (Nikon TI-E).

Migration assay

Migrationen evne rhabdospheres blev evalueret af Boyden kammer teknik i forhold til RD. Kort fortalt blev enkelte celler afledt af RD eller rhabdospheres efter trypsinisering suspenderet i serumfrit medium indeholdende 0,1% bovint serumalbumin (BSA) og udsået i det øvre rum af en Boyden kammer (8-um pore, Euroclone). De nedre kamre indeholdt 10% FBS i IMDM medium som en kemo-tiltrækningsstof. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C og fik lov til at migrere i 8 timer. Celler bundet til den øvre overflade af filteret blev mekanisk fjernet ved skrubning med vatpinde. Chambers blev farvet i 0,5% krystalviolet fortyndet i 100% methanol i 30 min, skyllet i vand og undersøges under lysfeltsbillede mikroskopi. Værdier for migration blev opnået ved at tælle 5 felter pr membran (X20 mål) og repræsenterer gennemsnittet af fire uafhængige forsøg.

Invasion assay

MMP-aktivitet blev kvantificeret som tidligere beskrevet [22]. Kort fortalt blev celler fra rhabdospheres og RD udsået i 6-brønds plader (300.000 celler /brønd) og fik lov til at klæbe. Efter 48 timer blev cellerne vasket og inkuberet ved 37 ° C med 400 pi phosphatpufret saltvand (PBS) i 3 timer. PBS blev derefter opsamlet, centrifugeret, og supernatanten blev anvendt til assayet. Lige mængder af supernatanten blev tilsat til 100 pi af gelatine quenching (DQ Gelatine, Life Technologies) i en 96-brønds plade. Adhærerende celler blev løsnet og talt. Efter 24 timer ved 37 ° C blev fluorescensemissionen målt med en mikropladelæser (Tecan). Resultater blev rapporteret som procentdelen af ​​fluorescensemission i forhold til acellulær supernatant og normaliseret med det totale antal celler. Eksperimentet blev gentaget tre gange.

Flowcytometri

Rhabdosphere celler og RD blev dissocieret med trypsin, talt og farvet som følger. Til kvantificering af CD133 ekspressionen blev cellesuspensioner inkuberet med monoklonalt CD133 /1-antistof (AC133, Miltenyi Biotec) i 10 minutter, efterfulgt af 20 minutters inkubation med anti-ged-antistof Alexa grøn 488 nm (Life Technologies) ved 4 ° C. Til evalueringen af ​​CXCR4 indhold blev cellesuspensioner farvet med monoklonalt CD184 (CXCR4) -PE (Miltenyi Biotec) i 10 minutter ved 4 ° C. Efter farvning blev cellerne resuspenderes derefter i PBS og analyseret med en Coulter EPICS XL flowcytometer (Coulter Corporation, Beckman Coulter). Forsøg blev gentaget tre gange.

Drug følsomhed assay

Rhabdosphere celler og RD blev udpladet i plader med 6 brønde (200.000 /brønd) og fik lov til at klæbe. Efter 24 timer blev celler inkuberet med DXR (10, 50, og 100 ng /ml; Sigma) eller cisplatin (5, 10, og 100 uM, Sigma), og efter yderligere 72 timer blev antallet af levedygtige celler blev bedømt ved Trypan blåt farveeksklusion assay. Procentdelen af ​​vækstinhibering blev beregnet i forhold til ubehandlede celler. Lægemidlet halvmaksimal effektiv koncentration (EF

50) for hver cellelinje blev beregnet ved lineær regressionsmetode. Eksperimentet blev gentaget to gange.

DXR uptake

Rhabdosphere celler og RD blev podet i 8 brønde glas chamberslides og fik lov til at klæbe. Cellerne blev derefter eksponeret for DXR (10 ug /ml) i 15 minutter, vasket og observeres direkte ved konfokal mikroskopi. Niveauet af nukleare DXR blev kvantificeret i mindst 100 celler over forskellige områder ved hjælp af NIS-Elements Microscope Imaging Software (Nikon).

lysosomet surhedsgrad evaluering

Emissionen spektrum af pH-følsomme acridinorange (AO) blev anvendt til måling pH-variationer i sure organeller [23], [24]. Rhabdosphere celler og RD blev podet i plader med 6 brønde og fik lov til at klæbe i 24 timer i komplet medium. Cellerne blev derefter eksponeret for AO (1 ug /ml) i 10 minutter, vasket og observeres direkte ved spektral konfokal mikroskopi. For at karakterisere profilen af ​​AO emission spektre, blev det røde bånd bidrag (R%) inden for hele emissionsspektrum beregnes som følger: R% = 100

jeg

655 /(

I

655 /

jeg

530), hvor

jeg

655 og

jeg

530 er den grønne (520-540 nm ) og den røde (645-665 nm) integreret intensiteter emission hhv. Den gennemsnitlige R% blev beregnet for alle de sure organeller i 10 celler. Eksperimentet blev gentaget to gange.

Cytosolisk pH-måling

Cytosoliske pH (pHc) af rhabdosphere celler og RD blev målt ved anvendelse af carboxy-seminaphthorhodafluor-1 (carboxy-snarf-1) (Molecular Probes ). Celler blev podet i kammerskiver og fik lov til at klæbe i 24 timer og derefter 10 uM carboxy-snarf-1 blev tilsat til dyrkningsmediet i 30 min. Kammeret objektglas blev anbragt på det stadium af konfokalt mikroskop og fik lov til at tilpasse i mindst 20 minutter før start PHC målinger. Den excitation laserstråle på 514 nm (Arlaser) var rettet til prøven via S Plan Fluor EL WD 40X objektiv (Nikon). Den resulterende fluorescensemission blev opsamlet ved 644 nm og 594 nm. Flere regioner af interesse (ROI) med en diameter på 1 um blev derefter udvalgt tilfældigt udelukke nukleare regioner. Emissionen Forholdet blev kalibreret ved hjælp af løsninger (110 mM KCl, 25 mM KHCO

3, 11 mM glucose, 1 mM MgCl

2, 1 mM CaCl

2, 10 mM HEPES) med varierende pH-niveauer, og som indeholder 10 uM nigericin (K + /H + ionophor). Fluorescensemissionen ratio (644 nm /594 nm) blev beregnet og anvendt til at estimere pHc fra kalibreringskurven. Forsøget blev gentaget tre gange.

Vækst analyser efter lysosomer målretning

For at forringe lysosomer funktion, rhabdosphere celler og RD blev behandlet ved hjælp af to forskellige strategier. For den første blev celler podet i plader med 6 brønde (200.000 /brønd), fik lov til at klæbe i 24 timer i komplet medium, og derefter behandlet med AO (0,1, 0,5, og 1 ug /ml; Sigma), som selektivt akkumulerer i sure lysosomer og påvirke cancercellevækst [25]. Efter 72 timer blev antallet af levedygtige celler vurderet ved udelukkelse farvestof-assay. Forsøget blev gentaget to gange. Den anden strategi blev vurderet ved anvendelse PPI omeprazol (OME), et lægemiddel, der vides at inhibere V-ATPase-aktivitet [26]. Cellelevedygtighed efter OME behandling blev bestemt under anvendelse af to forskellige assays. a) For de indirekte assay rhabdospheres og RD, eller celler repræsentative for ES- eller NB histotype, blev podet i plader med 96 brønde (8000 celler /brønd) og fik lov til at klæbe. Efter 24 timer blev mediet skiftet med upufret RPMI med 10% FBS og behandlet med 10, 25, 50, og 100 uM af OME (Sigma-Aldrich). Efter 24, kun for rhabdomyosarcomaceller, og 72 timer for RMS, ES og NB-celler, blev levedygtigheden evalueret af en sur phosphatase (AP) assay. Kort beskrevet blev cellerne vasket og inkuberet ved 37 ° C med 100 pi puffer indeholdende 0,1 M natriumacetat (pH 5,0), 0,1% Triton X-100, og 5 mM p-nitrophenil phosphat. Efter 3 timer blev reaktionen standset ved tilsætning af 10 pi 1 N NaOH, og farveudviklingen blev analyseret ved 405 nm under anvendelse af en mikropladelæser (Tecan) [23]. b) til direkte assay rhabdospheres og RD blev podet i plader med 6 brønde og fik lov til at klæbe. Efter 24 timer blev 50 pM OME tilsat til dyrkningsmediet. Efter yderligere 24 timer blev antallet af levedygtige celler bestemmes ved udelukkelse farvestof-assay. Eksperimentet blev gentaget to gange.

Apoptose analyse

Rhabdosphere Cellerne fik lov at klæbe efter 24 timer i komplet medium og udsættes for 50 uM OME i upufret RPMI med 10% FBS. Efter 24 og 48 timer blev cellerne mærket med Hoechst 33258 og tilstedeværelsen af ​​apoptotiske legemer blev påvist under fluorescensmikroskopi.

Cellecyklusanalyse

Rhabdospheres blev eksponeret for 100 pM af OME i ikke vedhæftende betingelser ved pH 6,8 i 24 timer. DNA-indholdet og bromdeoxyuridin (BrdU) inkorporering i S-fasen blev bestemt ved samtidig analyse af propidiumiodid (PI) for den samlede DNA-indhold og FITC-konjugeret anti-BrdU-fluorescens. Kort fortalt blev celler inkuberet med 40 pM 5-BrdU (Sigma) i 60 minutter ved 37 ° C, vasket og derefter 5 x 10

6 enkeltceller blev fikseret med 75% ethanol i 20 minutter ved 4 ° C. Delvis DNA-denaturering blev udført ved at inkubere celler i HCl, efterfulgt af neutralisering med Na tetraborat. Prøver blev derefter inkuberet med et monoklonalt muse-anti-BrdU FITC-antistof (BD Biosciences), vasket, farvet med 2,5 ug /ml PI (Sigma-Aldrich), og analyseret. Monoparametric og biparametriske analyser blev udført ved hjælp af WinMDI 2.7-softwaren. Forsøget blev gentaget to gange.

Effekter af DXR på cellelevedygtighed efter OME behandling

Rhabdosphere celler lader til at klæbe i 24 timer i komplet medium. Cellerne blev derefter forbehandlet med 10, 25, 50, og 100 uM af OME i upufret RPMI med 10% FBS. Efter yderligere 24 timer blev cellerne udsat for 50 og 25 ng /ml DXR i pufret medium. Efter yderligere 48 timer blev cellelevedygtighed vurderet af AP-assay som tidligere beskrevet. Data blev rapporteret som celleoverlevelse i forhold til ubehandlede celler (sæt = 100%). Forsøget blev udført i fire eksemplarer.

DXR optagelse efter OME behandling

Rhabdosphere celler lader til at klæbe i 24 timer i komplet medium. Cellerne blev derefter pre-behandlet med 10 og 20 uM af OME i upufret RPMI med 0,1% FBS i 1 time og derefter udsat for 5 ug /ml DXR i 15 min. Den nukleare DXR blev kvantificeret i mindst 100 celler i forskellige områder, som tidligere beskrevet, og sammenlignet med den for ubehandlede celler. Eksperimentet blev gentaget to gange.

siRNA transfektion

specifikt gen silencing effekt blev opnået ved siRNA teknologien er forbundet med pipette-typen elektroporering. Kort fortalt blev rhabdosphere celler trypsiniseret og 100 pi cellesuspension indeholdende 2.000.000 celler og 1,6 nmol specifik siRNA (ON-TARGETplus Menneskelig ATP6V0C siRNA Smart pool, Dharmacon, Thermo Scientific) eller kontrol siRNA (siRNA ctr, ON-TARGETplus Ikke målretning Kontrol Pool, Dharmacon) eller vand (ingen siRNA) blev overført til en 1-mm kuvette (Neon transfektionssystem, Life Technologies). Elektroporerede celler blev podet i plader med 6 brønde (500.000 celler /brønd) i RNA-isolering og i en 96-brønds plade for væksten assayet (15.000 celler /brønd). Efter 24 timer blev reduktionen af ​​mRNA-niveauet for V

0C ATPase verificeret af Real Time PCR som tidligere beskrevet. For væksten assayet blev cellerne eksponeret for 25 ng /ml DXR i pufret medium og inkuberet i yderligere 48 timer. Cellelevedygtighed blev vurderet ved AP indirekte assay som tidligere beskrevet. Resultaterne blev rapporteret som procent af celleoverlevelse

vs

kontrol celler (ingen siRNA). Eksperimentet blev gentaget to gange.

Inhibering af rhabdosphere cellemigration ved OME

Rhabdospheres blev dissocieret og podet i plader med 6 brønde lad til at klæbe i 24 timer i komplet medium. For at evaluere migration evne, cellerne blev derefter forbehandlet med 50 uM OME i upufret RPMI med 10% FBS. Efter 24 timer blev levedygtige celler talt og derefter et tilsvarende antal ubehandlede eller OME-behandlede celler blev podet i det øvre rum af Boyden kammer, som tidligere beskrevet. Forsøget blev gentaget to gange.

Hæmning af rhabdosphere celle invasive potentiale ved OME

For at evaluere den invasive potentiale blev rhabdosphere celler lad at klæbe i 24 timer i komplet medium og derefter forbehandles med 50 uM OME i upufret RPMI med 0,1% FBS i 3 timer. Frigivelsen af ​​MMP’er i supernatanten blev kvantificeret ved gelatine quenching assay som tidligere beskrevet, og normaliseret med det totale antal levedygtige celler. For at evaluere virkningen på CXCR4-udtrykkende population blev rhabdospheres podet i kugle-dannende tilstand ved pH 6,8 og forbehandlet med 100 pM af OME. Efter 48 timer blev cellerne udsat for levedygtige optælling og CXCR4-positive fraktion i populationen af ​​levende celler (valgt som den forreste og side scattering parametre) blev evalueret med flowcytometri, som tidligere beskrevet. Forsøgene blev gentaget to gange.

Statistisk analyse

På grund af det lille antal observationer, data blev betragtet som ikke normalt fordelt. Værdier blev udtrykt som middelværdi ± SE. Statistisk analyse blev udført med StatView 5.0.1 software (SAS Institute Inc., Cary, NC). Den ikke-parametrisk Mann-Whitney U test blev anvendt, og p. 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

Rhabdosphere dannelse og berigelse

Efter 2-3 ugers kultur i vækstfaktor beriget serum-udsultet medium, RD-celler dannede kulturer består i flydende celle aggregater, de såkaldte rhabdospheres, som kunne blive yderligere udvidet

i

vitro

(figur 1A). For at vurdere evnen hos rhabdosphere celler at initiere selvfornyelse, blev antallet af dannede kugler over tre serielle passager på hver passage bestemmes. Antallet af kugler opnået ved den tredje generation var signifikant højere, hvilket indikerer, at rhabdospheres kan serielt beriges. (Figur 1B; p = 0,0495

vs

passage 1)

(A) Fase kontrast billeder af rhabdospheres afledt af RD dyrket i forankringsuafhængig tilstand i serum-udsultet medium suppleret med bFGF og EGF. Repræsentant billede, skala bar 100 um. (B) Sphere-dannende effektivitet rhabdospheres over tre serielle passager. Grafen viser mængden af ​​den primære, sekundære (genereret fra dissocierede primære sfærer), og tertiære (genereret fra dissocierede sekundære kugler) kugler fra 2000 celler. * P 0,05

vs

primære sfærer. (C) mRNA-niveauer for stamcelle markører OCT3 /4 og NANOG i rhabdospheres forhold til indfødte RD af Real Time PCR. * P 0,05. (D) Western blotting for OCT3 /4 og NANOG i rhabdospheres forhold til RD native celler (venstre, repræsentative billeder) og densitometrisk analyse (til højre; * p 0,05). (E) Differentiation analyser af rhabdospheres efter inkubation med passende differentierede stimuli. Venstre: osteogen differentiering evalueret af alizarinrødt S-farvning, skala bar 100 pm; midten: adipogenisk differentiering evalueret med olie-rød-O-lipid-farvning, skala bar 10 um; højre: chondrogen differentiering evalueret af Alcian blå farvning, skala bar 50 um. Repræsentative billeder. (F) Transwell kemotaksiassay af rhabdospheres

vs

indfødte RD. Grafen viser antallet af migrerede celler i fem X20 felter efter 8 timer. * P 0,05. (G) mRNA niveauer for MMP9 i rhabdospheres

vs

indfødte RD af Real Time PCR. * P 0,05. (H) MMP’er aktivitet i supernatanten fra rhabdospheres

vs

RD native celler ved gelatine quenching assayet. * P 0,05. (I) mRNA niveauer for CXCR4 i rhabdospheres sammenlignet med indfødte RD af Real Time PCR. * P 0,05. (L) cytofluorimetrisk analyse af CXCR4-positive cellefraktion i rhabdospheres og indfødte RD. Repræsentative plots intensitet for rhabdospheres og indfødte RD (til venstre) og procentdelen af ​​CXCR4-positive celler (til højre). ** P. 0,001

Stemness funktioner i rhabdospheres

For at vurdere stamcelle-relaterede karakteristika rhabdospheres, niveauet af ekspression af to stemness markører, transskription faktorer OCT3 /4 og NANOG, blev evalueret og sammenlignet med native RD-celler. Transkriptionen af ​​begge gener blev opreguleret i rhabdospheres (figur 1C). Især observerede vi en markant stigning for NANOG mRNA og en tendens til stigning, men ikke signifikant, for OCT3 /4 (figur 1C; p = 0,0283). Lignende resultater blev opnået for NANOG protein ved Western Blot-analyse, som vi har registreret en svag, men signifikant stigning for kugler (Figur 1D; p = 0,0495), mens vi ikke fandt forskel for OCT3 /4. Især vi også fundet, at CD133 ikke var forbundet med stamme-lignende fænotype (45,9 ± 3,4% for RMS CSC

vs

43,8 ± 1,8% for RD, henholdsvis). Endelig viste vi stamcellen plasticitet rhabdospheres ved deres evne til at differentiere langs tre mesenkymale slægter, hvilket fremgår af alizarinrødt S (osteogenese), olie-rød-O (adipogenese), og Alcian blå (chondrogenese) farvning (figur 1E) .

Forbedrede migration og invasion egenskaber rhabdospheres

antallet af rhabdosphere celler, der migrerede gennem Boyden Chamber var signifikant højere end RD (figur 1F; p = 0,0162). Rhabdosphere celler viste også en markant

in vitro

ekstracellulære matrix-nedbrydning potentiale i forhold til nativt RD, som vist ved opregulering af MMP9 mRNA (figur 1G; p = 0,0495), og ved de højere niveauer af gelatine nedbrydning aktivitet af secerneret MMP9 (figur 1 H; p = 0,0368). Desuden rhabdospheres udtrykte meget høje niveauer af celleoverfladereceptoren CXCR4, hvilket fremgår af Real Time PCR (Figur 1I; p = 0,0495) og flowcytometri (fig 1L; p = 0,0027). Denne kemokinreceptor medierer migrationen af ​​tumorceller over for dets ligand udtrykker væv [27].

Reduceret følsomhed over for DXR gennem MDR1-uafhængig mekanisme i rhabdospheres

At evaluere kemoresistens i RMS CSC, rhabdospheres og nativ RD blev udsat for stigende koncentrationer af cisplatin eller DXR. Med hensyn til levedygtighed hæmning, viste begge cellepopulationer det samme mønster som reaktion på cisplatin (figur 2A, EF

50 værdier: 18,7 uM for kugler og 14,6 uM for RD). På den anden side, i modsætning til nativt RD viste RMS CSC en signifikant lavere vækstinhibering som respons på DXR (figur 2B; p = 0,018 i 10 ng /ml, p = 0,0209 for 50 ng /ml, og p = 0,0202 for 100 ng /ml).