PLoS ONE: REV3L, en lovende mål i Regulering af kemosensitivitet livmoderhalskræft celler

Abstrakt

REV3L, den katalytiske subunit af DNA-polymerase ζ (Polζ), spiller en væsentlig rolle i DNA skader tolerance mekanisme translesion syntese (TLS). Rolle

REV3L

i kemosensitivitet af livmoderhalskræft behov udforskning. I den foreliggende undersøgelse evaluerede vi ekspressionen af ​​Polζ protein i paraffinindlejrede væv under anvendelse immunohistokemi og fundet, at ekspressionen af ​​Polζ i livmoderhalskræft væv var højere end i normalt væv. Vi derefter etableret nogle livmoderhalskræft cellelinjer med

REV3L

undertrykkelse eller overekspression. Udtømning af

REV3L

undertrykker celledeling og kolonidannelse af livmoderhalskræft celler gennem G

1 anholdelse, og

REV3L

fremmer celledeling og kolonidannelse af livmoderhalskræft celler ved at fremme G

1 fase til S faseovergang. Undertrykkelsen af ​​

REV3L

ekspression forbedret følsomhed cervicale cancerceller for cisplatin, og overekspression af

REV3L

tillagt resistens over for cisplatin som vist ved ændringen af ​​apoptose satser, og betydeligt ændringer ekspressionsniveauet af anti-apoptotiske proteiner B-cellelymfom 2 (Bcl-2), myeloid celle leukæmi sekvens 1 (MCL-1) og B-celle-lymfom-ekstra store (Bcl-xl) og proapoptotiske Bcl-2-associeret x protein (Bax ). Vores data tyder på, at

REV3L

spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​livmoderhalskræft cellulære respons på cisplatin, og dermed målrette

REV3L

kan være en lovende måde at ændre kemosensitivitet i livmoderhalskræft kræftpatienter.

Henvisning: Yang L, Shi T, Liu F, Ren C, Wang Z, Li Y, et al. (2015)

REV3L

, en lovende mål i Regulering af kemosensitivitet af livmoderhalskræft Cells. PLoS ONE 10 (3): e0120334. doi: 10,1371 /journal.pone.0120334

Academic Redaktør: Eric Asselin, University of Quebec på Trois-Rivieres, CANADA

Modtaget: Juli 28, 2014 Accepteret: 29 januar 2015; Udgivet: 17 Marts 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering: Støtte blev leveret af National Natural Science Foundation of China. (give nr 81.202.050; https://www.nsfc.gov.cn/.). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Livmoderhalskræft er den femte fælles og den fjerde dødelige kræft hos kvinder over hele verden med næsten 528.000 nye tilfælde og 266.000 dødsfald i 2012 [1]. Kemoterapi er en af ​​de mest nyttige strategier i systematisk behandling af cervixcancer. Cisplatin monoterapi eller i kombination med andre kemoterapeutiske lægemidler forblev den dominerende systemisk terapeutisk modalitet for lokalt fremskreden og metastatisk livmoderhalskræft i flere årtier. Men udviklingen af ​​resistens over for kemoterapeutiske midler udgør en væsentlig hindring, der bidrager til tumor tilbagefald, progression, og visse død [2].

Selv om de nøjagtige underliggende mekanismer ikke er fuldt forstået, undersøgelser har vist, at nogle DNA skader undslipper reparation og kan stalle replikation maskiner trods af DNA reparationsmekanismer. For eksempel tillader translesion DNA-syntese (TLS) beskadigede celler til at fuldføre genom replikation ved rekruttering af specialiserede DNA-polymeraser til strandede replikationsgafler [3,4]. TLS polymeraser bidrage til opretholdelsen af ​​den genomiske integritet, og ellers gået i stå DNA replikationsgafler kan kollapse i strukturer og forårsage en DNA dobbeltstrengsbrud (DSB), for derved at øge genomisk ustabilitet [3]. I mellemtiden er lav-fidelity DNA-polymeraser involveret i spontan og DNA-skader fremkaldt mutagenese og dermed bidrage til malign transformation [5,6,7]. Aktiveringen af ​​TLS kan også bidrage til den erhvervede lægemiddelresistens i tumorceller behandlet med DNA-beskadigende anticancermidler, og det er fordi Polζ tilhører den funktionelle gruppe TLS DNA-polymeraser spiller en stor rolle i bypass af mange typer af DNA-skader [8,9,10,11].

REV3L

gen, pattedyr ortolog af Saccharomyces cerevisiae

rev3

gen, koder den katalytiske subunit af Polζ [12,13], mens REV7L (også kendt som MAD2L2) interagerer med REV3L gennem en specifik binding domæne [14,15,16,17].

REV3L

gen synes at være allestedsnærværende udtrykt i både normale og maligne humane væv, mens dens udtryk niveau varierer i forskellige normal og tumorceller [18,19,20]. Den unikke funktion

REV3L

er af usædvanlig interesse på grund af sin kritiske rolle i forebyggelsen af ​​cisplatin cytotoksicitet. For eksempel kylling DT40 celler mangelfulde i

rev3

viste højere følsomhed over for cisplatin, sammenlignet med andre DNA-reparation eller check-point mutanter [21].

REV3

udtømning øger også følsomheden og mindsker mutagenese fremkaldt af cisplatin i muse B-celle lymfomer og lungekræft celler, mennesker og mus fibroblastceller, og menneskelige tyktarmscarcinomceller [22,23,24,25]. Undertrykkelse af ekspression af

REV1L

, et medlem af Y-typen polymerase familie, der understøtter aktiviteten af ​​DNA-polymerase ζ [13,26], kan markant reducere antallet af udvikling af resistens i human ovariecancer celler [27]. Derudover en undersøgelse viste, at hæmning af

REV3

udtryk i sig selv kan fremkalde vedvarende DNA skader og vækst anholdelse i kræftceller i flere lunge-, bryst-, lungehindekræft, og colontumorcellelinier [28]. Disse resultater tyder på, at

REV3L

gen væsentligt påvirker cellulær resistens over for cisplatin. Derfor er det muligt at overvinde cisplatin modstand gennem inhibering af

REV3L

.

Vores tidligere undersøgelse viste, at Polζ ekspression kan anvendes som indikator for dårlig prognose, som kan være forårsaget af potentiel chemoradiation modstand i livmoderhalskræft kræftpatienter [29]. Roller Polζ i regulere chemoradiation modstand og forudsige prognosen forbliver dårligt kendetegnet ved cervikal karcinom, som fortjener yderligere udforskning. Derfor har vi etableret livmoderhalskræft cellelinjer med nedregulering eller opregulering af

REV3L

og evaluerede deres følsomhed over for cytotoksisk middel cisplatin og relaterede apoptose arrangementer.

Materialer og Metoder

Etik erklæring

Alle forskning med mennesket deltagere blev godkendt af etiske komité på Fudan University i Shanghai Cancer center (FUSCC). Et skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle rekrutterede individer, og hver klinisk undersøgelse blev udført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen samtykke.

vævsprøver og cellelinier

Vi lavede væv microarrays hjælp pladecellekræft prøver fra 123 konsekutive livmoderhalskræft kræftpatienter med FIGO (International Federation of Gynækologi og Obstetrik, 2009) iscenesætter IB, IIA eller IIB og 17 patienter med normal cervikal behandlet mellem marts 2008 og marts 2009 kl FUSCC. Vævene blev histopatologisk bekræftet uafhængigt af to gynækologiske patologer (TXY og YG). Den detaljerede kliniske dannelse blev ekstraheret fra patienternes elektroniske database på FUSCC, som tidligere beskrevet [29].

De etablerede humane livmoderhalskræft cellelinjer SiHa, HeLa, ME180 og MS751 blev indhentet fra American Type Culture Collection ( ATCC). Alle celler blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM, HyClone, Thermo Scientific, USA) suppleret med 10% kalvefosterserum (Gibco, Life Technologies, USA), 100 U /ml penicillin (Biowest, Nuaille, Frankrig), og 100 U /ml streptomycin (Biowest, Nuaille, Frankrig) og inkuberet ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO

2

Immunhistokemi Assay

immunhistokemisk (IHC) assays. var udført som tidligere beskrevet [29]. Den 10 × 12 væv microarray (TMA) blev foretaget af FUSCC Tissue Bank, som tidligere [30] beskrevet. IHC blev udført på 5-um-tykke TMA sektioner ved hjælp af antistof mod Polζ (sc-48.814, kanin polyklonale antistof, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA, fortynding 1: 100) og ChemMate

TM EnVision

TM /HRP (peberrodsperoxidase),

Kanin /mus

, afsløring kit (DAKO, Glostrup, Danmark). En kendt positivt tilfælde prøve blev inkluderet som en positiv kontrol, og det primære antistof blev erstattet med ikke-immunt muse /kaninserum til negativ kontrol. Den IHC farvning blev scoret uafhængigt af to gynækologiske patologer (TXY og YG), som blev blindet til patient kliniske resultater, ved hjælp af et pointsystem baseret på både procentdelen af ​​positive tumorceller og farvning intensitet, som tidligere [31] beskrevet. Endelig blev vurderingen af ​​proteinekspression defineret som negativ (≤2 +) og positive ( 2 + til 6 +), og for scoringer, der var tolkelige grund af vævstab eller mangel på tumorceller, en score på ikke anvendelig (N /A) blev tildelt.

Plasmid Byggeri og Cell transfektion

Alle de anvendte primere i undersøgelsen blev konstrueret ved hjælp af Primer Premier 5-softwaren. For at teste for mulige repetitive sekvenser, blev primere linie med GeneBank database ved hjælp af BLAST online værktøj. AutoDimer Software blev anvendt til påvisning af potentielle hårnålestrukturer og mulige primer-dimer kombinationer. Alle primere blev syntetiseret af Sangon Biotech Co., Ltd (Shanghai, Kina). Tre korte hårnål interfererende RNA (shRNA) målretning

REV3L

blev udformet og syntetiseret kemisk og indsættes i pBABE /U6 /Puro vektor ifølge den tidligere rapporterede fremgangsmåde [32,33]. Vi valgte en shRNA med en højeste hæmning effektivitet ved anvendelse af cellelinier med høj ekspression af

REV3L

(Forward primer: 5′-GGAGAATAGAACTATGG TGCAAGCCTACGTAGCGTCTGCACCATAGTTCTATTCT CCCTTTTTG-3 ‘; revers primer: 5’-AATTCAAA AAGGGAGAATAGAACTATGGTG CAGACGCTACGTAGGCTTGCACCATAG TTCTATTCTCC-3 ‘). Den pBABE /U6 /Puro vektor, der indeholder negative kontrol (NC) shRNA (shGFP) blev ligeledes bygget af direkte indsætte oligo nukleotider koder lille hårnål RNA mod grøn fluorescens protein mRNA (shGFP) i pBabe /U6 /puromycin [32,34]. Retrovira udtrykker

REV3L

shRNA eller GFP shRNA blev produceret ved transfektion af pBabe /U6 /sh

REV3L

eller pBabe /U6 /shGFP i phoenix amfotropiske celler og bruges til at inficere målceller ved hjælp af en metode beskrevet før [32]. Kort sagt blev celler inficeret med virus supernatanter, og efter en 24-timers opsving blev cellerne udvalgt med puromycin (200 ng /ml) i 10-14 dage til at etablere stabile cellelinier, der udtrykker shREV3L eller shGFP. De resulterende celler blev dyrket i medium uden puromycin og anvendt til yderligere forsøg. Cellelinjer med lav udtryk for

REV3L

blev transficeret med pcDNA3.1 /neo-REV3L plasmid (leveret af Dr. Yoshiki Murakumo, Nagoya University Graduate School of Medicine, Nagoya, Japan) eller pcDNA3.1 /neo negativ kontrol plasmid under anvendelse af lipofectamin 2000 pr fabrikantens anvisninger. Efter 48 timer og inden for 120 timers transfektion blev cellerne anvendt til yderligere analyse.

RT-PCR og Real-Time PCR

Totalt RNA blev isoleret ved anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, Life technologies , USA) ved at følge fabrikantens protokol, og omvendt transkriberet til cDNA under anvendelse PrimeScript

TM RT reagens Kit (Takara Biotechnology, Shiga, Japan). PCR-produkter blev amplificeret med TaKaRa Taq TM med reaktioner af 30 cykler af (94 ° C, 30 s; 58 ° C, 30 s; og 72 ° C, 1 min) ved hjælp af Mastercycler® eprealplex (Eppendorf AG, Hamburg, Tyskland) . Fem mikroliter PCR-produkter blev analyseret ved elektroforese på 1,5% agarosegel indeholdende ethidiumbromid og visualiseret under UV-belysning. Real-time PCR blev udført i Applied Biosystems Prism 7900-system (Applied Biosystems, Life Technologies, USA) under anvendelse ExScipt Syber grøn QPCR kit (Takara Biotechnology, Shiga, Japan) under følgende betingelser: en indledende denaturering på 95 ° C i 30 s, en cyklus; 95 ° C i 5 s; 55 ° C i 30 s; og 72 ° C i 30 s, 40 cyklusser; efterfulgt af en smeltekurveanalyse at kontrollere specificiteten af ​​amplifikation. Hver prøve blev testet i tre eksemplarer og primere til glyceraldehyd-3-phosphatedehydrogenase (GAPDH) blev anvendt i parallelle reaktioner som intern kontrol. Tre uafhængige forsøg blev udført for de endelige analyser ved hjælp af 2

-ΔΔCT relativ kvantificering metode. Primerparrene af

REV3L

anvendt var 5′-CGCGTCAGTTGGGACTTAAG-3 ‘(fremadrettet primer) og 5′-ACTATCGCCAACCTCAATGC-3’ (revers primer). Primerparrene af

GAPDH

var 5′-GGCCTCCAAGGAGTAAGACC-3 ‘(fremadrettet primer) og 5′-CAAGGGGTCTACATGGCAAC-3’ (revers primer). Primerparrene af

REV7L

var 5′-CTGGAGAAGAATGATGTGGAG-3 ‘(fremadrettet primer) og 5′-GTGGAGGCTGGGTGATCTCA-3’ (revers primer).

celleproliferationsassay og cellelevedygtighed Assay

at evaluere celleproliferation sats, vi udpladet 1×10

3 celler pr brønd i 96-brønds plader med 100 pi vedligeholdelsesmedium. Celletælling Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) blev anvendt til at overvåge cellevækst ved 0-7 dag, og antallet af levedygtige celler blev vurderet ved måling af absorbans ved 450 nm ved en mikropladelæser (BioTek instrumenter, Winooski, VT, USA). Den spredning indeks blev beregnet som eksperimentel OD-værdi /kontrol OD-værdi. Cellelevedygtighed blev også vurderet ved CCK-8. Vi belagte 5×10

3 livmoderhalskræft celler pr brønd i 96-brønds plader. Den næste dag blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af anticancer-lægemidler. Cellelevedygtighed blev derefter målt som beskrevet ovenfor. Tre uafhængige forsøg blev udført i firdobbelte brønde.

kolonidannelse Assay

Celler blev udpladet ved en lav densitet på 500 i en seks-brønds plade i tre eksemplarer. Cellerne fik lov at vokse i 2 uger før de blev fikseret med iskold methanol og farvet med krystalviolet. Forsøgene blev udført mindst tre gange for de endelige analyser.

Western Blotting

Celler blev lyseret i lysebuffer indeholdende proteaseinhibitorer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 0,05 M EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% SDS og 0,005 × proteaseinhibitorcocktail). Cellelysaterne blev opløst på 10% -15% SDS-PAGE-elektroforese og overført til PVDF-membraner (Merck Millipore, Darmstadt, Tyskland). Membranen blev blokeret med 5% fedtfri mælk i PBS-Tween 20 i 1 time ved stuetemperatur og inkuberet med udvalgte primære antistof med β-actin anvendt som en intern kontrol. Immunreaktivitet blev påvist efter inkubering med et peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., PA, USA, 1: 2000 fortynding) ved anvendelse af forøget kemiluminescens-metoden (Thermo Scientific, USA). Antistoffer mod Bcl-2, B-celle lymfom-ekstra store (Bcl-xl), myeloid celle-leukæmi-1 (MCL-1), Bcl-2-associeret x protein (Bax), cytochrom c, β-actin (Santa Cruz bioteknologi, CA, USA, 1: 1000 fortynding) og spaltes caspase 3 p17-specifikt antistof (Proteintech, IL, USA, 1: 1000 fortynding blev) anvendt til Western blotting-analyse. Western blot-band densitet blev analyseret under anvendelse Image J software pr fabrikantens instruktioner, og bandet massefylde forholdet hvert protein til p-actin blev beregnet i overensstemmelse hermed. Tre uafhængige forsøg blev udført for de endelige analyser.

Cell Cycle Analysis ved flowcytometri

Flowcytometri cellecyklus-analyse blev udført under anvendelse af PI enkelt farvning metode. Celler blev suspenderet i 1 ml phosphatpufret opløsning (PBS) og fikseret i centrifugerør i 3 ml absolut ethanol. Cellerne blev holdt i ethanol natten over ved -20 ° C. Derefter blev ethanol-suspenderede celler centrifugeret i 5 min ved 2000 rpm. Cellepelleten blev resuspenderet i 5 ml PBS i ca. 30 s og centrifugeret ved 2000 rpm i 5 min. Cellepelleten blev resuspenderet i 500 pi PI-farvning solutionand holdt i mørke ved 37 ° C i 10 min. Prøven blev analyseret ved anvendelse af et FACScan flow-cytometri (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

Apoptose Analyse ved flowcytometri

adhærerende celler blev opsamlet og underkastet følgende apoptoseassays. Celler blev mærket med FITC-konjugeret Annexin V og PI anvendelse af en Annexin V-FITC (fluoresceinisothiocyanat) apoptose afsløring kit (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) ifølge producentens anvisninger, og efterfølgende analyseret ved FACScan flow-cytometri.

immunofluorescensbestemmelse

Celler blev udpladet ved en densitet på 2000 i 24-brønds kammerobjektglas og behandlet med forskellige koncentrationer af cisplatin i 24 timer. Cellerne blev fikseret med MeOH og permeabiliseret med Triton X-100. Derefter celler blev blokeret med 1% BSA i PBS i 2 timer, og inkuberet med primært antistof mod γ-H

2AX (Biolegend, San Diego, CA, USA, 1: 200 fortynding) natten over. Endelig blev cellerne inkuberet med AlexaFluor-488 gede-anti-muse-sekundært antistof (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., PA, USA, 1: 200 fortynding) og monteret med DAPI. y-H

2AX foci blev vurderet med grøn fluroscence. blev gennemført mindst tre uafhængige forsøg.

Cisplatin behandling

Cisplatin blev købt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Stock koncentration af cisplatin blev 5 mg /ml. Forskellige koncentrationer af cisplatin blev anvendt til behandling af livmoderhalskræft linjer for cellelevedygtighed assay for forskellige tidsrum. Og i apoptose analyse blev cisplatin anvendt af 30%, 50% inhiberende koncentration beregnes ud fra celleviabilitetstest.

Statistical Analysis

Alle værdier blev udtrykt som middelværdi ± standardfejl på middelværdien (SEM). Statistisk analyse blev gennemført af Students

t

-test. En

P Drømmeholdet værdi mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS-version 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Resultater

Polζ væsentligt stærkt udtrykt i livmoderhalskræft væv

Til undersøge forskellen i ekspressionen af ​​

REV3L

mellem human livmoderhalskræft og normal livmoderhals, vævet microarray af 123 pladecellecarcinom af cervikale cancerpatienter og 17 patienter med normal cervix blev opnået og Polζ ekspression blev analyseret ved hjælp af IHC assay (fig. 1A). Patienternes karakteristika og status Polζ ekspression blev vist i fig. 1B. Blandt de 123 livmoderhalskræft kræftpatienter blev syv (6%) væv scoret af N /A for IHC farvning. Generelt blev Polζ positivt udtryk påvist i 21,7% (25/115) i de livmoderhalskræft væv og 5,9% (1/17) i de normale cervikale væv. Den gennemsnitlige Polζ udtryk var også højere i de livmoderhalskræft væv end i de normale cervikale væv (The IHC farvning score var 1,72 og 0,82, henholdsvis;

P

= 0,034) (. Figur 1A, B).

(A) Polζ-positive (øverste, venstre panel) og Polζ-negative (øverste, højre panel) udtryk i livmoderhalskræft prøver, Polζ-positive (nedre, venstre panel) og Polζ-negative (lavere, højre panel) ekspression i normale cervikale væv. (B) De kliniske karakteristika og status for Polζ ekspression af cervikale kræftpatienter og patienter med nomal livmoderhalsen. Den gennemsnitlige Polζ udtryk var højere i de livmoderhalskræft væv end i de normale cervikale væv. (C) Real time PCR-analyse for

REV3L

mRNA-ekspression i fire livmoderhalskræft cellelinjer.

REV3L

udtryk var højere i HeLa og SiHa celler end i MS751 og ME180 celler. (D) Omvendt transskription PCR-analyse for

REV3L

mRNA ekspression i kort hårnål RNA transficeret negative kontrol celler (shGFP), shREV3L celler,

REV3L

-overexpressing celler, og vektor kontrol celler.

REV3L

udtryk blev signifikant reduceret i shREV3L celler og blev øget i

REV3L

-overexpressing celler sammenlignet med kontrol celler.

Etablering af livmoderhalskræft cellelinjer med

REV3L

knockdown eller overekspression

for at undersøge funktionen af ​​

REV3L

i humane livmoderhalskræft celler, opdaget vi

REV3L

mRNA-ekspression i flere livmoderhalskræft cellelinier. Og så har vi oprettet cellelinje modeller genetisk manipulerede til

REV3L

udtryk. Som vist i fig. 1C,

REV3L

udtryk var højere i livmoderhalskræft cellelinier HeLa og SiHa end ME180 og MS751. Således har vi undertrykt

REV3L

udtryk i HeLa og SiHa cellelinjer ved stabil shREV3L transfektion (fig. 1D). I modsætning hertil

REV3L

udtryk blev overudtrykt i livmoderhalskræft celle linjer ME180 og MS751 sammenlignet med de vektor kontrol celler (Fig. 1d). Således forbedrede vi udtryk for

REV3L

i ME180 og MS751 celler. Regulering af

REV3L

genekspression i etablerede cellelinjer ikke havde en signifikant effekt på REV7L mRNA udtryk niveauer (S1 Fig).

REV3L

styrer celledeling og cellecyklus

Vi først opdaget effekten af ​​

REV3L

på celledeling og cellecyklus og fandt, at

REV3L

udtømning undertrykt cellevækst som undersøgt af CCK8 assay (fig. 2A) og kolonidannelse assayet sammenlignet med kontrolceller (fig. 2e). Fraktionen af ​​HeLa-celler i G

1 fase steg til 63% efter inhibering af

REV3L

ekspression sammenlignet med 54% i kontrolceller (fig. 2C). Således hæmning af

REV3L

inducerer en G

1 anholdelse i livmoderhalskræft celler. Overekspression af

REV3L

forfremmet celleproliferation (fig. 2B) og kolonidannelse af livmoderhalskræft celler (Fig. 2F). Cellecyklusanalyse viste, at et betydeligt fald i den del af G

1 fase blev observeret i ME180 celler efter

REV3L

overekspression (80%) sammenlignet med kontrolceller (66%) (fig. 2D) . Således overekspression af

REV3L

fremmer G

1 fase til S faseovergang i livmoderhalskræft celler.

(A) Udtømning af

REV3L

undertrykt celle spredning af HeLa shREV3L celler og SiHa shREV3L celler. (B) Styrkelse af

REV3L

fremmet celledeling af MS751

REV3L

og ME180

REV3L

celler. (C) Udtømning af

REV3L

induceret G

1 anholdelse i HeLa shREV3L celler. (D) Styrkelse af

REV3L

forfremmet G

1 fase til S faseovergang i ME180

REV3L

celler. (E) Udtømning af

REV3L

undertrykt koloni dannelse af HeLa shREV3L og SiHa shREV3L celler. (F) Styrkelse af

REV3L

forfremmet koloni dannelse af MS751

REV3L

og ME180

REV3L

celler. Data er gennemsnit af tre uafhængige forsøg ± SEM. *

P

0.05.

REV3L-

udtømning sensibiliserer livmoderhalskræft cellelinjer til cisplatin

REV3L

RNAi blev brugt til at undertrykke ekspressionen af ​​

REV3L

at se, om hæmning af

REV3L

udtryk kan øge kemosensitivitet af humane livmoderhalskræft celler til cisplatin. Resultaterne fra CCK8 assays viste, at efter suppression af

REV3L

, cervicale cancerceller var mere følsomme over for den cytotoksiske virkning af cisplatin (fig. 3A). Celle apoptose blev analyseret ved anvendelse af Annexin V-FITC-farvning. Dataene viste, at tidlige apoptotiske satser i shREV3L HeLa og SiHa-celler var signifikant højere end i shGFP HeLa og shGFP SiHa-celler som respons på forskellige doser af cisplatin i 24 timer (fig. 3B, C). 30%, 50%, 70% inhiberende koncentrationer af cisplatin i HeLa, SiHa

REV3L

undertrykkelse celler og kontrolceller er vist i tabel 1.

(A) Suppression af

REV3L

confered cervicale cancerceller mere følsomme over for den cytotoksiske virkning af cisplatin. (B) Undertrykkelse af

REV3L

viste overfølsomhed over for cisplatin. Celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af cisplatin i 24 timer, efterfulgt af farvning med Annexin V-fluoresceinisothiocyanat (FITC) og propidiumiodide (PI) for tidlige apoptotiske celler (Annexin V + PI-). Tidlige apoptotiske satserne for

REV3L

-suppression celler var signifikant højere end de vektor kontrol celler under samme betingelse. (C) Procentdelen af ​​apoptotiske celler induceret af cisplatin. Data er gennemsnit af tre uafhængige forsøg ± SEM. *

P

0,05, **

P

0.01.

REV3L

overekspression giver resistens over for cisplatin i livmoderhalskræft cellelinjer

For yderligere at validere effekten af ​​

REV3L

på kemosensitivitet af humane livmoderhalskræft celler til kemoterapeutiske stoffer, vi undersøgte følsomheden af ​​

REV3L

overekspression celler til cisplatin. Resultaterne viste, at overekspression af

REV3L

gjort cellerne resistente over for forskellige doser af cisplatin (fig. 4A).

REV3L

-overexpressing ME180 og MS751 celler viste et fald i cisplatin-induceret tidlig apoptose (fig. 4B, C). De 30%, 50%, 70% hæmmende koncentrationer af cisplatin i MS751, ME180

REV3L

overekspression celler og kontrol celler er vist i tabel 2.

(A) Overekspression af

REV3L

gjort livmoderhalskræft celler er resistente over for cisplatin. (B) Påvisning af apoptotiske celler ved flowcytometri. Overekspression af

REV3L

hæmmede apoptose induceret af cisplatin. (C) Procentdelen af ​​apoptotiske celler induceret af cisplatin. Data er gennemsnit af tre uafhængige forsøg ± SEM. *

P

0.05.

REV3L

induceret kemoresistens medieres gennem mitokondrier-associerede apoptosecyklus

Som mitokondrierne-associerede apoptosecyklus deltager i cellulært respons i tumorer til mange anticancer lægemidler, for at se om den er involveret i

REV3L

induceret ændring i følsomhed over for cisplatin, vi udførte en analyse af proapoptotiske proteiner (Bax, cytochrom c) og antiapoptotiske proteiner (bcl-2, Bcl- xl, og Mcl-1) i vektor kontrol celler og

REV3L

-overexpressing eller undertrykkelse celler med cisplatin behandling (fig. 5A, D). Efter behandling med cisplatin i 24 timer, Bcl-2, Bcl-xl og Mcl-1-niveauer markant nedsat, og Bax og cytochrom c-niveauer steg i shREV3L HeLa og SiHa-celler, sammenlignet med shGFP HeLa og SiHa-celler. Konsekvent, efter behandling med cisplatin,

REV3L

-overexpressing MS751 og ME180 celler viste højere niveauer af Bcl-2, Mcl-1 og Bcl-xl og lavere niveauer af Bax og cytochrom c, sammenlignet med vektor kontrolceller . Endvidere efter udsættelse for cisplatin (1 pmol /l) i 72 timer, en tidsafhængig stigning i mængden af ​​spaltet caspase-3 blev observeret i HeLa shREV3L celler og et fald i mængden af ​​spaltet caspase-3 blev observeret i MS751

REV3L

celler efter en enkelt dosis behandling af 10 pmol /l af cisplatin (fig. 5C, D). Således disse resultater tyder, at

REV3L

giver kemoresistens til cisplatin gennem mitokondrierelateret tilhørende apoptosecyklus.

(A) Ekspressionsniveauerne for Bcl-2, Bcl-xl og Mcl-1 var lavere og niveauer af Bax og cytochrom c var højere i shREV3L celler sammenlignet med shGFP celler som respons på den samme dosis af cisplatin.

REV3L

-overexpressing MS751 og ME180 celler viste højere niveauer af Bcl-2, Mcl-1 og Bcl-XL og lavere niveauer af Bax og cytochrom c sammenlignet med vektor kontrolceller. (B) γ-H

2AX og p-p53 (PS15) proteiner blev forøget i SiHa shREV3L celler og faldt i ME180 REV3L celler sammenlignet med kontrol celler efter cisplatin behandling. (C) Time-afhængig ekspression af spaltet caspase-3 efter udsættelse for en enkelt dosis cisplatin (1 pmol /l) i MS751 celler og en enkelt dosis cisplatin (10 pmol /l) i HeLa-celler. Ekspressionsniveauer af spaltet caspase-3 var lavere i MS751

REV3L

celler og højere i HeLa shREV3L celler sammenlignet med kontrolpatienter celler som respons på den samme dosis af cisplatin i en tidsafhængig måde. (D) Normalized fold udtryk for hvert protein mod den interne kontrol protein. Data er gennemsnit af tre uafhængige forsøg ± SEM. * P 0.05.

REV3L

begrænser DNA skade responset efter behandling med cisplatin

For at bestemme intensiteten af ​​DNA-skader respons efter cisplatin behandling i

REV3L

overekspression eller undertrykkelse livmoderhalskræft cellelinjer, vi har registreret γ-H

2AX (pS139) foci dannelse hjælp immunofluorescens. HeLa og SiHa celler mangelfulde i

REV3L

udtryk udviste intens γ-H

2AX farvning i sammenligning med shGFP kontrol celler efter udsættelse for cisplatin (fig. 6A). Tværtimod MS751 og ME180 celler med

REV3L

overekspression viste svagere γ-H

2AX farvning sammenlignet med kontrolceller (fig. 6B). Analyse af proteiner viste, at γ-H

2AX, og p-p53 (PS15) proteiner blev forøget i SiHa shREV3L celler og faldt i ME180

REV3L

overekspression celler, sammenlignet med kontrolceller efter cisplatin-behandling (Fig . 5B, D).

(a) HeLa og SiHa-celler blev dyrket i nærvær af i en enkelt dosis cisplatin (3 pmol /L og 25 pmol /L) i 24 timer. HeLa og SiHa celler mangelfulde i

REV3L

udtryk udstillet intenser γ-H

2AX farvning i sammenligning med shGFP kontrol celler efter udsættelse for cisplatin. (B) MS751 og ME180 celler blev dyrket i nærvær af i en enkelt dosis cisplatin (30 pmol /L og 5 pmol /L) i 24 timer. MS751 og ME180 celler med

REV3L

overekspression viste svagere γ-H

2AX farvning end kontrol celler. Kvantificering af γ-H

2AX foci blev udført og analyseret per celle. Over 50 celler blev talt i hver cellelinie.

Diskussion

Polζ er en fejlbehæftet DNA-polymerase er involveret i TLS der er kendetegnet ved sin evne til at forlænge fejlparret primer-skabelon termini . På den ene side kan Polζ opretholde genomet stabilitet og er en fordel for overlevelse, når cellerne udsættes for DNA-beskadigelse [35,36,37,38,39]. På den anden side, gennem inducere spontane og DNA-læsion-udløst mutationer ved at forårsage forkerte nukleotider i DNA, Polζ bidrager til akkumulering af genetiske skader, og kan således spille en rolle i carcinogenese og tumorprogression [40,41,42]. Expression niveauer af

REV3L

gen, der koder for den katalytiske subunit af Polζ, varierer i forskellige typer af kræft. Nogle undersøgelser fundet, at

REV3L

blev overudtrykt i humane gliomer væv reseceret før behandling sammenlignet med normale hjernevæv [19], mismatch repair-defekt, p53 – /- kolorektale adenocarcinomer sammenlignet med kontrolpersoner væv [43].

Der blev også rapporteret REV3L

polymorfier at være signifikant associeret med risikoen for lungekræft og brystkræft [44,45]. Mens andre undersøgelser fandt, at

REV3L

udtryk blev nedreguleret i tyktarmskarcinomer uafhængigt af tumor kvalitet [46], mavekræft [47], og lungekræft [47].