PLoS ONE: RKIP Hæmning i livmoderhalskræft er forbundet med højere Tumor aggressiv adfærd og Modstand mod cisplatinbehandling

Abstrakt

Livmoderhalskræft er en af ​​de mest almindelige kræftformer hos kvinder over hele verden, at være af høj risikogruppe HPV inficeret, den førende ætiologiske faktor. Den raf-kinase-inhiberende protein (RKIP) er blevet forbundet med tumorudvikling og metastase i adskillige humane neoplasmer, men dens rolle på livmoderhalskræft er uklar. I den foreliggende undersøgelse, 259 livmoderhalsen væv, herunder cervicitis, cervikal intraepithelial læsioner og carcinomer, blev analyseret for RKIP ekspression ved immunhistokemi. Vi fandt, at RKIP ekspression blev signifikant nedsat under ondartet progression, bliver stærkt udtrykt i ikke-neoplastiske væv (54% af prøverne, 73/135), og udtrykkes ved lave niveauer i livmoderhalsen invasive karcinomer (-15% (19/124 ). Efter

in vitro

nedregulering af RKIP, observerede vi en levedygtighed og proliferativ fordel af RKIP-hæmmede celler over tid, som blev forbundet med en ændret cellecyklus distribution og højere koloni nummer i en koloni formation assay. en

in vitro

sårheling assay viste, at RKIP ophævelse er forbundet med øget vandrende kapacitet. RKIP nedregulering var også forbundet med en øget vaskularisering af tumorerne

in vivo

ved hjælp af en CAM assay. desuden RKIP hæmning inducerede livmoderhalskræft celler apoptotiske modstand mod cisplatin behandling. Afslutningsvis vi beskrevet, at RKIP protein væsentligt forarmet under ondartet progression af cervikale tumorer. på trods af den manglende tilknytning til patientens kliniske resultat, vi demonstrerer,

in vitro

og

in vivo

, at tab af RKIP udtryk kan være en af ​​de faktorer, der er bag aggressivitet, ondartet progression og kemoterapi modstand livmoderhalskræft

Henvisning:. Martinho O, Pinto F , Granja S, Miranda-Gonçalves V, Moreira MAR, Ribeiro LFJ, et al. (2013) RKIP Hæmning i livmoderhalskræft er forbundet med højere Tumor aggressiv adfærd og Modstand mod Cisplatin Therapy. PLoS ONE 8 (3): e59104. doi: 10,1371 /journal.pone.0059104

Redaktør: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu, Italien

Modtaget: November 23, 2012; Accepteret: 11 Feb 2013; Udgivet: 19 Mar 2013

Copyright: © 2013 Martinho et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af den portugisiske Fundação para a Ciência e Tecnologia (give PTDC /SAU-TOX /114.549 /2009). Olga Martinho og Sara Granja var modtagere af ph.d.-stipendier (SFRH /BD /36463/2007 og SFRH /BD /51062/2010, henholdsvis), og Filipe Pinto og Vera Miranda-Gonçalves var modtagere af forskningsstipendier (UMINHO /BI /016 /2011 og SFRH /BI /33503/2008, henholdsvis), begge fra FCT, Portugal. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere eksterne midler modtaget for denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Livmoderhalskræft er den tredje mest almindeligt diagnosticeret kræft. og den fjerde hyppigste årsag til kræft død hos kvinder i hele verden, der tegner sig for 9% (529,800) af det samlede antal sager nye kræft og 8% (275,100) af de samlede kræftdødsfald blandt kvinder i 2008 [1]. Vedvarende infektion med høj-risiko typer af human papillomavirus (HPV) er en

sinus-qua-non

betingelse for livmoderhalskræft udvikling af kræft. HPV’er inficere epithelceller og forårsage en række læsioner, der spænder fra almindelige vorter til cervikal neoplasi og cancer [2] – [4]. Tumorer i cervix er opdelt i tre forskellige histologiske undertyper: Uterine pladecellecarcinomer (SCC) er den hyppigste, efterfulgt af adenocarcinom (AC) og adenosquamøst carcinom (ASC), som er en usædvanlig subtype [5]. HPV-infektion alene er ikke nok til at udløse livmoderhalskræft og HPV-medieret onkogenese kræver også ophobning af yderligere genetiske forandringer, der sker over tid efter indledende infektion [6]. Det kan tage flere år for en

in situ

neoplasma at gå videre til en invasiv karcinom. Mekanismen for klonal evolution, som indebærer udvælgelse af celler med invasiv eller metastatisk potentiale, også forbliver uløst

Raf-kinase-inhiberende protein (RKIP; også kendt som PEBP1, for phosphatidylethanolamin-bindende protein1)., Som angivet ved navn, blev først identificeret som den endogene inhibitor af RAF /MEK /ERK pathway, inhibering Raf-1-aktivering [7] – [9]. Faktisk RKIP er blevet impliceret i forskellige intracellulære signalveje, der kontrollerer cellevækst [10], [11], motilitet [12], [13], epitelial til mesenkymale overgang (EMT) [14] og differentiering [15]. RKIP udtrykkes bredt i normale humane væv, synliggøre dens rolle i forskellige fysiologiske processer [16], men anses for at være en metastase suppressor i cancer [17], er dets manglende eller formindsket ekspression forbundet med malignitet og prognose i mange typer af metastatisk og aggressive cancere [10], [11], [18] – [34]

en tidligere undersøgelse, udført i en lille del af de patienter, fundet ved ekspression microarray analyse at RKIP er et af de gener, der. udtrykkes differentielt mellem tumorprøver fra cervikale cancerpatienter med eller uden lymfeknudemetastaser [35]. For nylig blev det konstateret i en stor serie af patienter, RKIP protein betydeligt nedreguleret i livmoderhalskræft og lymfeknudemetastaser [36]. Derudover blev en undersøgelse med HeLa cervical cancerceller viste, at RKIP gennem regulering af ERK-vejen, har en vigtig rolle i mitotisk checkpoint regulering [37]. Derfor de tidligere resultater, fik os til at belyse den biologiske rolle RKIP i livmoderhalskræft ondartet progression og kemoterapi respons. Derfor vi først vurderet ekspressionsniveauerne af RKIP protein i både ikke-maligne og tumor cervikale prøver, og vurderet sin rolle i det kliniske resultat af livmoderhalskræft kræftpatienter. For det andet, vi vurderede

in vitro

in vivo

den biologiske funktion af RKIP nedregulering i livmoderhalskræft malignitet og kemoterapi respons.

Materialer og metoder

Vævsprøver

for nuværende arbejde, blev 259 cervikale væv analyseret, som omfattede 45 cervicitis, 47 low-grade planocellulære intraepithelial læsioner (LSIL), 43 high-grade planocellulære intraepithelial læsioner (HSIL), 70 planocellulært karcinom (SCC), 41 adenocarcinomer (AC) og 13 adenosquamøst carcinomer (ASC) (tabel 1). De paraffin prøver indeholder de cervikale ikke-maligne læsioner blev hentet fra filerne i Patologi opdeling af Adolfo Lutz Institute São Paulo, Brasilien, og invasive cervikale tumor prøver blev hentet fra Araújo Jorge Hospital og School of Medicine i Federal University of Goiás (Goiania, Goias State, Brasilien). Alle histopatologiske diagnoser blev gennemgået af forfatterne og kategoriseres ifølge WHO klassifikationen. Alle patienter med livmoderhalskræft var hunner af brasiliansk oprindelse, med en gennemsnitsalder på 49 år (spændvidde 23-74 år). Opfølgende data var tilgængelige for 72 patienter, og indsamles gennem direkte interview med patienter eller deres pårørende, og ved gennemgang af in-hospital patientjournaler. Den mediane follow-up tid (samlet overlevelse) var 35,5 ± 42,0 måneder (interval, 2-144 måneder).

Alle prøverne indskrevet i den foreliggende undersøgelse var sammenkædet og uidentificeret fra deres donorer. Grundet den tilbagevirkende kraft af undersøgelsen, blev opnået nogen skriftligt informeret samtykke fra patienterne. De lokale etiske anmeldelse udvalg af de involverede institutioner (Etik udvalg i Human Research Adolfo Lutz Institute São Paulo og Araújo Jorge Hospital fra School of Medicine i Federal University of Goiás, Brasilien) godkendte arbejdet og frafaldes behovet for skriftligt informeret samtykke .

cellelinier

for den nuværende undersøgelse, den blev brugt tre cervikale karcinom cellelinjer: HeLa-cellelinie, venligt leveret af Dr.

en Elsa Logarinho (IBMC, Portugal) [38] , SiHa og C-33A cellelinjer, der var venligt leveret af Dr.

en Luisa Villa (INCT-HPV, Brasilien) [39]. Alle cellelinjer blev dyrket og holdt ved 37 ° C og 5% CO

2 i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM 1 ×, High Glucose, Gibco, Invitrogen) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibco, Invitrogen ) og 1% penicillin /streptomycin opløsning (Gibco, Invitrogen) (DMEM-10).

Narkotika

Cisplatin (cis-diamminplatin (II) dichlorid) blev opnået fra Sigma-Aldrich og udvandet i 0,9% NaCl i en stamopløsning på 10 mM. Lægemidlet blev efterfølgende fremstillet som formidlede fortyndinger for at opnå en tilsvarende mængde af lægemiddel køretøj (1% slutkoncentration) i hvert af de undersøgte betingelser. I alle forsøgsbetingelser de lægemidler blev fortyndet i 0,5% FBS dyrkningsmedium (DMEM-0,5).

Immunhistokemi og Immuncytokemi Analyse af RKIP

Histologiske lysbilleder med 4 um tykke vævssnit blev udsat for immunohistokemisk analyse ifølge streptavidin-biotin peroxidase komplekst system (UltraVision storskalaproduktion Detection System Anti-Kombinationsfartøjer, HRP; LabVision Corporation) ved anvendelse af primært antistof dannet mod RKIP (Millipore, reference 07-137) fortyndet 1:600, inkubering 1 time ved RT, som tidligere beskrevet [18], [25], [40], [41]

Snit blev scoret dobbelt-blindt for cytoplasmatisk udtryk efter en semi-kvantitativt kriterium:. (

–

), 0% af immunoreaktive celler; (+),

5% af immunoreaktive celler; (++), 5-50% af immunoreaktive celler; og (+++),

50% af immunoreaktive celler. Prøver med scoringer (

– Kreis) og (+) blev anset for negativ, og dem med scoringer (++) og (+++) blev betragtet som positive

For RKIP immuncytokemisk analyse af livmoderhalskræft. carcinomcellelinjer blev cellerne udpladet på dækglas placeret i 12-brønds plader og fik lov at adhærere natten over. Proceduren for immuncytokemi blev udført som tidligere beskrevet [41].

Generation of shRKIP stabilt udtrykker cellelinier

Til generering af cellelinjer, som stabilt udtrykker shRKIP brugte vi PQY15 vektor, som indeholder en 19 bp shRNA for RKIP, som tidligere beskrevet [37], [41], [42]. Transfektionen blev udført ved hjælp af Fugene HD reagens (Roche) som anbefalet af fabrikanten, med 2 ug plasmid i et forhold på 6:02 (Reagens: Plasmid). Cellerne (2 x 10

5) blev udpladet på en plade med 12 brønde indtil 80% konfluens og transficeret i DMEM-medium uden FBS eller antibiotika desuden i løbet af 24 timer [41]. Derefter blev stabile transfektanter selekteret med 0,5 ug /ml (HeLa) eller 2 ug /ml (C-33a og SiHa) af puromycin i DMEM-10. Den tomme vektor blev også transficeret som kontrol.

Western blot-analyse

Cellerne blev plade i en plade med 6 ved en tæthed på 8 x 10

5 celler per brønd og tilladt at klæbe mindst 24 timer. Cellerne blev serumudsultet i 6 timer før protein isolation. Når det er nødvendigt, blev cellerne også stimuleret med 10 ng /ml EGF ved 10 minutter før afslutningen af ​​de 6 timers udsultning. Også for cisplatin eksperimenter cellerne blev udsat for forskellige koncentrationer af cisplatin i en yderligere periode på 24 timer i DMEM-0,5. Cellerne blev skrabet i koldt PBS og lyseret i buffer indeholdende 50 mM Tris, pH 7,6-8, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 10 mM NaF, 10 mM NaPyrophosphate, 1% NP-40 og 1/7 af protease cocktail inhibitorer (Roche). Western blotting blev udført ved anvendelse af standard 12% SDS-PAGE-gel, lastning 20 ug protein per bane, med detektion ved forøget kemiluminescens (SuperSignal West Femto maksimal følsomhed Underlag, Pierce). RKIP ekspression blev målt ved anvendelse af et specifikt antistof mod RKIP (fortynding 1:2000, Upstate Biotechnology). Aktiveret ERK og EGFR blev vurderet ved hjælp af antistof phospho-p44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) og phospho-EGFR (Y1068) (fortynding 1:1000, Cell Signaling Technology). Den samlede form af ERK og EGFR blev også vurderet med antistofferne P44 /42 MAPK (Erk1 /2) (klon 137F5, fortynding 1:1000, Cell Signaling Technology) og EGFR (udvanding 1:500, klon 31G7, ZYMED Laboratories). For apoptose vurdering blev det brugt antistoffer mod kløvet PARP (klon Asp214, fortynding 1:1000, Cell Signaling Technology), kløvet caspase-9 (klon Asp330, fortynding 1:1000, Cell Signaling Technology) og PARP (fortynding 1:1000, Cell Signaling Technology). For lastning kontrol brugte vi β-tubulin (klon AA2, fortynding 1:5000, Upstate Millipore). Alle de primære antistoffer blev inkuberet i en time ved stuetemperatur.

Blots detektion blev udført ved kemiluminescens (ECL Western Blotting Detection Reagents, RPN2109, GE Healthcare) in ImageQuant ™ LAS 4000 mini (GE Healthcare) eller ved hjælp X100 Hyperfilm ECL (Amersham, GE Healthcare).

cellelevedygtighed og proliferationsassays Salg

cellerne blev udpladet i 96-brønds plader in triplo med en tæthed på 3 × 10

3 celler per brønd og fik lov at adhærere natten i DMEM-10. Efter 6 timers serumudsultning blev de levedygtige eller proliferative celler kvantificeret under anvendelse af Cell Titer96 Vandig celleproliferationsassay (Promega) eller med celleproliferation ELISA, BrdU (kolorimetrisk, Roche Applied Science) og anvendt til tiden 0 værdi. Derefter blev cellerne inkuberet i DMEM-medium uden serum i 24, 48 og 72 timer og cellelevedygtighed og proliferation blev igen vurderet ved Cell Titer96 Vandig celleproliferationsassay og celleproliferation ELISA, BrdU (kolorimetrisk) hhv. Resultaterne blev kalibreret til startværdien (tid 0 timer, betragtes som 100% af levedygtighed /proliferation) og udtrykt som middelværdi ± SD. Assayet blev udført tre gange i mindst tre gange.

For at bestemme den koncentration, hvor 50% af cellevæksten inhiberes af cisplatin behandling (IC

50 koncentration), cellerne blev udpladet i 96- brønde ved en densitet på 3 x 10

3-5 × 10

3 celler per brønd og fik lov at adhærere natten over i DMEM-10. Efterfølgende blev cellerne behandlet med stigende koncentrationer af lægemidlet fortyndet i DMEM-0,5. Efter 48 timer blev cellelevedygtighed kvantificeret ved anvendelse Cell Titer96 Vandig celleproliferationsassay (MTS) (Promega). Resultaterne blev udtrykt som middel ± SD levedygtige celler relativt til lægemiddel vehikel alene (betragtet som 100% levedygtighed). IC

50-koncentrationen blev beregnet ved ikke-lineær regressionsanalyse ved anvendelse af GraphPad Prism software.

Sårheling Migration Assay

Cellerne blev podet i plader med 6 brønde og dyrket til mindst 95% konfluens. Monolag celler blev vasket med PBS og skrabet med en plastik 200 uL pipettespids og derefter inkuberet med frisk DMEM-medium uden serum. De “sårede” områder blev fotograferet ved fasekontrastmikroskopi ved 12, 24 eller 48 timer ‘tidspunkter. Den relative afstand migration blev beregnet ved følgende formel: Procent af sårlukning (%) = 100 (A-B) /A, hvor A er bredden af ​​celle- sår før inkubation og B er bredden af ​​celle- sår efter inkubering [ ,,,0],41]. Resultater udtrykkes som middelværdi ± SD. Assayet blev udført tre gange i mindst tre gange.

Cell Cycle Analysis

Cellerne blev udpladet i en 6-brønds plade med en tæthed på 2 x 10

5 celler per brønd og fik lov at adhærere natten. Efter 6 timers serumudsultning blev cellerne inkuberet med frisk DMEM-medium uden serum i 24 timer. Celler blev tripsinized og fikseret i 70% ethanol i mindst 30 minutter og derefter farvet i 1 time ved 50 ° C med en propidiumiodid (PI) opløsning (20 ug /ml PI og 250 ug /ml RNAse i en opløsning af 0,1 % Triton X-100 i PBS). Cellecyklusanalyse af PI farvede celler blev udført ved hjælp af flowcytometri (LSRII, BD Biosciences). Procentdelen af ​​celler i hver fase af cellecyklussen blev bestemt med softwaren FlowJo versionen 7.6.3. Resultaterne blev udtrykt som middelværdien ± SD af procentdelen af ​​celler i G1-fasen eller G2 /M plus S-fase [41]. Assayet blev udført tre gange i mindst tre gange.

blød agar-kolonidannelse Assay

Den bløde agar kolonidannelse assayet blev udført under anvendelse af standard fremgangsmåder, som tidligere beskrevet af os [43]. Kort beskrevet blev 1 ml underlayers (baseagar lag) bestående af 0,6% agar medium fremstillet i 6-brønds plader ved at kombinere lige store volumener af 1,2% Noble agar med enten 2 × DMEM medium med 20% FBS. Cellerne blev trypsiniseret, centrifugeret, og ressuspended i 0,35% agarmedium (topagarlag; lige store volumener af 0,7% Noble agar og 2 x DMEM med 20% FBS); 2 × 10

3 celler blev derefter udpladet på de tidligere fremstillede baseagar lag. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 atmosfære i 15 dage og de dannede kolonier farvedes med 0,05% violet krystal i 15 minutter. Farvede kolonier blev fotograferet ved hjælp af et stereomikroskop (Olympus S2 × 16) og et digitalt kamera (Olympus DP71) og tælles med Image J software. Kun kolonier med en størrelse større end 775 um

2 (ca. 31,4 um diameter) blev talt [43]. Resultater udtrykkes som middelværdi ± SD. Analysen blev udført tre gange mindst tre gange.

kyllingechorioallantoinmembranen (CAM) Indhold

For at vurdere

in vivo

tumor spredning og angiogenese vi brugte CAM assay som tidligere beskrevet [41], [43]. Befrugtede kyllingeæg blev inkuberet ved 37 ° C og 70% fugtighed, og på dag 3 i udvikling, blev et vindue fremstillet i skallen, som blev forseglet med tape, og æggene blev returneret til inkubatoren. På dag 9 i udvikling blev små plastringe anbragt på CAM’en og på dag 10 i udviklingen 3 × 10

6 celler, resuspenderet i 20 pi af DMEM-medium, blev injiceret i ringene over CAM. På dag 17 af udviklingen blev den dannede tumor fotograferet

in ovo

anvendelse af et stereomikroskop (Olympus S2 × 16), og omkredsen af ​​tumoren blev målt ved anvendelse Cell B software (Olympus). Resultater udtrykkes som middelværdi ± SD.

Endelig blev hønseæg aflivet ved -80 ° C i 10 minutter, og CAM og tumorer blev fikseret med paraformaldehyd ved 4% og fotograferet

ex ovo

til blodkar optælling. De tumorer blev indlejret i paraffin og behandlet til histologisk analyse.

Statistisk analyse

Korrelationer mellem RKIP udtryk og kliniske data fra patienter blev udført ved hjælp af chi-square test (χ2-test). Kumulative overlevelsessandsynligheder blev beregnet under anvendelse af Kaplan-Meier-metoden. Forskelle mellem overlevelsesrater blev testet med log-rank test. Den statistiske analyse blev udført under anvendelse af SPSS software til Windows, version, 17.0. For

in vitro

in vivo

analyser, enlige sammenligninger mellem de forskellige vilkår undersøgte blev udført ved hjælp af Students t-test, og forskelle mellem grupper blev testet ved hjælp af to-vejs variansanalyse (ANOVA) . Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Graph Pad Prism-version 5. Niveauet af betydning i hele den statistiske analyse blev fastsat til p. 0,05

Resultater

RKIP Expression i Cervikal væv

en immunhistokemi tilgang blev gjort for at opdage RKIP proteinekspression og distribution i cervikale læsioner (fig. 1).

a) Positive udtryk i en cervicitis. B) High-grade skællede intraepithelial læsion med negativ udtryk. C) Adenocarcinom væv afbilder positivt udtryk. D) Negativ adenocarcinom (*) med tilstødende normale celler (pil) skildrer positiv farvning. Alle billeder blev taget med på 200 × forstørrelse.

cytoplasmatisk positivt udtryk for RKIP blev observeret i 64,5% (29/45) af de cervicitis prøver, i 44,7% (21/47) af LSIL og 53,5% (23/43) af HSIL (tabel 1) (fig. 1A og B). Der blev ikke observeret nogen signifikante forskelle i ekspressionsniveauerne af RKIP mellem LSIL og HSIL (

s

= 0,404), og også mellem cervicitis og planocellulære intraepithelial læsioner (SIL) generelt (

s

= 0,087 ), tabel 1). Om maligne læsioner, RKIP var til stede i lave niveauer, med kun 19,5% (8/41) af AC, 12,9% (9/70) af SCC og 15,4% (2/13) af ASC afbilder positiv farvning (tabel 1) ( fig. 1C og D). blev ikke observeret nogen signifikante forskelle mellem RKIP udtryk i forskellige maligne læsioner undersøgt (

s

= 0,643, tabel 1). Men når gruppering af godartede læsioner (cervicitis og SIL) og maligne læsioner (AC, SCC og ASC) blev der observeret en statistisk signifikant fald i RKIP udtryk i livmoderhalskræft prøver (

s

0,001), når sammenlignet med de godartede læsioner (Tabel 1)

Ingen korrelationer blev fundet mellem RKIP udtryk og kliniske træk ved patienter, såsom alder, tilstedeværelse af metastaser og opfølgende data, uafhængigt af den histologiske type (p 0.05, tabel 2).

RKIP Expression og Modulation af ERK Pathway i livmoderhalskræft kræftcellelinjer

for at studere rolle RKIP i livmoderhalskræft, vi først screenet for RKIP udtryk i humane livmoderhalskræft cellelinjer (HeLa, SiHa og C-33A) ved immunocytokemi og western blot (fig. 2). Vi fandt, at RKIP udtrykkes ved høje niveauer i alle cellelinjer, og er til stede ved både cytoplasmaet og kernen af ​​cellerne (fig. 2A), som allerede beskrevet før [37]. Alle cellelinier blev anvendt til at knockdown ekspressionen af ​​RKIP ved stabil transfektion med PQY15 vektor indeholdende en kort hårnål-RNA til RKIP (shRKIP). Den tomme vektor blev også transficeret som kontrol. De RKIP proteinniveauer i disse stabile transficerede celler blev bestemt ved Western blot-analyse. Som vist i fig. 2B, RKIP proteinniveauer blev effektivt inhiberet i shRKIP transficerede celler sammenlignet med de tomme vektor transficerede celler.

A) Immuncytokemi analyse for RKIP i HeLa, SiHa og C-33A-celler udviser både nuklear og cytoplasmatisk ekspression. B) For RKIP inhibering blev cellelinjer stabilt transfekteret med en shRNA for RKIP og med den respektive tomme vektor til kontrol. RKIP ekspressionsniveauer blev vurderet ved Western blot. Yderligere blev cellerne stimuleret med 10 ng /ml EGF ved 10 minutter og EGFR og ERK-aktivering (phosphorylering) blev vurderet ved Western blot for phospho-ERK1 /2 og phospho-EGFR, men der blev observeret nogen signifikante forskelle. E: Tom vektor; Sh:. ShRKIP

At udforske rolle RKIP i modulering af EGF stimuleret ERK signalering i livmoderhalskræft blev de transfekterede celler stimuleret med EGF, og EGFR og ERK phosphoryleringsbegivenheder niveauer blev vurderet ved Western blot . Som det kan ses i fig. 2B, har EGF-stimulation ikke medføre væsentlige virkninger med aktiveringen af ​​ERK-signalering i disse celler, uafhængigt af RKIP status.

Rolle RKIP Expression af livmoderhalskræft cellelinier Biologisk Behavior

For at vurdere om graduering af RKIP udtryk påvirkede tumorigene egenskaber af cellerne, vi valgte cellelinje med højeste RKIP hæmning af shRKIP, HeLa og målt

in vitro

sine levedygtighed, spredning, forankring uafhængig vækst og migration kapaciteter (fig. 3). Vi observerede, shRKIP transficerede celler har en betydelig levedygtighed fordel over tid (figur 3A.), Sammenlignet med de tomme vektor transficerede celler (p 0,05). Denne forskel kan være en afspejling af et forøget celletal eller det kan afspejle øget cellulær metabolisme. For at se, om denne levedygtighed fordel skyldes højere spredning satser, vi undersøgte effekten af ​​RKIP på BrdU inkorporering, cellecyklus distribution og forankringsuafhængig vækst. BrdU assay bekræftede, at shRKIP transficerede celler har en signifikant proliferativ fordel over tiden (Fig. 3B). Den bløde agar kolonidannelse assayet viste en signifikant (p 0,05) stigning i antallet af dannede kolonier i shRKIP transficerede celler sammenlignet med kontrolcellerne (figur 3C.). Ved cellecyklusanalyse, observerede vi, at shRKIP transficerede celler havde en formindsket G0 /G1-fasen med en samtidig og signifikant (p 0,05) stigning i G2 /M + S-fase (figur 3D.). Disse resultater blev yderligere valideret i de andre to transficerede cellelinjer, SiHa og C-33A (fig. S1A-D).

A) Cellulær levedygtighed og B) Proliferation blev målt ved 24, 48 og 72 timer ved MTS og BrdU-assays, hhv. RKIP inhiberede celler havde en statistisk signifikant levedygtighed og proliferativ fordel over tid, sammenlignet med kontrolceller. C) Celler blev analyseret for deres evne til at proliferere i vækstmedium indeholdende 0,35% agar og dannelsen af ​​multi-cellulære kolonier fotograferet ved x16 forstørrelse efter 14 dage. RKIP inhibering inducerer en statistisk signifikant forankringsuafhængig vækst af HeLa-celler i blød agar. D) Nedregulering af RKIP i HeLa-celler inducerede et skift på cellecyklusfordeling med en statistisk signifikant højere procentdel af celler i G2M + S-fase i sammenligning med kontrolceller. Cellecyklusanalyse blev udført ved 24 timers tidspunktet ved flowcytometrisk analyse af propridium iodid farvede celler. E) En standardiseret bunden (sår) blev påført på monolag og digitale billeder blev taget ved adskillige tidspunkter (0, 12; 24 og 48 timer). Det blev observeret, shRKIP transficerede celler havde en statistisk signifikant migrering fordel over tid, sammenlignet med kontrolceller (højre panel). Repræsentative billeder ved 0 og 48 timer er vist i venstre panel. Alle forsøgene blev udført tre gange i mindst tre gange. Dataene er repræsenteret som middelværdi ± SD og forskelle med en

s

. 0,05 på de to-vejs ANOVA eller studerende t-test blev betragtet som statistisk signifikant (*)

Endelig , til at behandle virkningen af ​​RKIP i HeLa-celler migration, udført vi sårheling migration assay og bemærkede, at shRKIP transficerede celler havde en migration fordel i forhold til tid, med en signifikant (p 0,05) højere sårlukning sammenlignet med kontrolcellerne (fig. 3E). Det samme blev observeret i de to andre transfekterede cellelinjer, SiHa og C-33A (fig. S1E-F).

In vivo

Rolle RKIP Expression i livmoderhalskræft Vækst og angiogenese

for at undersøge effekten af ​​RKIP-medieret tumorvækst og angiogenese

in vivo

, vi udførte CAM assay (fig. 4). De transficerede celler blev implanteret i CAM’et af chick embryo (tom vektor celler, n = 10; shRKIP celler, n = 10) og syv dage efter celleimplantation blev kyllingefostre aflivet for at evaluere tumorvækst og angiogenese, som beskrevet i materialer og fremgangsmåder sektion. Middelværdien perimeter af tumorerne dannet af kontrollen og de shRKIP transficerede celler var 4335 ± 823 um og 4913 ± 1568 um hhv. Som vist i fig. 4B, størrelsen af ​​tumorerne dannet af shRKIP celler var ikke signifikant højere sammenlignet med tumorerne dannet af tom vektor celler.

A) Repræsentative billeder (16 × forstørrelse) af CAM-assayet efter 7 dages tumor vækst

in ovo

og

ex ovo

. B) Tumorvækst blev målt

in vivo

efter CAM assay som beskrevet i materialer og fremgangsmåder sektion. Det blev observeret en højere omkreds (uM) af tumorerne (

in ovo

) dannet af shRKIP celler imidlertid forskellen mellem kontrolcellerne var ikke signifikant. C) Hematoxylin-eosin-farvning af paraffinindlejrede tumorer viser højere vaskularisering induceret af RKIP inhibering. Repræsentative billeder med 10 × og 20 × forstørrelse er repræsenteret i det venstre panel. D) Tælling af blodkarrene

ex ovo

, det der blev observeret en statistisk signifikant stigning af antallet af fartøjer rekrutteret i tumorerne dannet af shRKIP celler sammenlignet med kontrollen. I alt blev det analyseret 20 æg (10 blev injiceret med tomme vektor og 10 med shRKIP celler). Dataene er repræsenteret som middelværdi ± SD og forskelle med en

s

0,05 på Students t-test blev betragtet som statistisk signifikant (*)

For at vurdere virkningen af. RKIP i angiogenese modulation, vi tælles

ex ovo

antallet af fartøjer omkring tumorer. Vi tælles et gennemsnit på 54 ± 16 og 83 ± 10 fartøjer i tumorerne dannet af tom vektor og shRKIP transficerede celler. RKIP inhiberede celler viste en statistisk signifikant (

s Restaurant 0,05) stigning i blodkar ansættelse sammenlignet med kontrolcellerne (figur 4d.). Som vist i fig. 4C, det hæmatoxylin-eosin-farvning af paraffinindlejrede tumorer og CAM bekræftede rige vaskularisering af tumorerne med kapillærer omkring tumoren og kapillærer spirende ud af CAM-modulet i tumorerne. Højere vaskularisering blev observeret i tumorerne dannet af shRKIP transfekterede celler (fig. 4C).

Rolle RKIP livmoderhalskræft Celler reaktion på kemoterapi

For at bestemme om RKIP protein kunne være involveret i modulering af livmoderhalskræft patientens respons på den konventionel kemoterapi, vi bestemmes sensibilitet af livmoderhalskræft cellelinjer transficeret med shRKIP til cisplatin behandling. Som det kan observeres i de cytotoksiske assays (fig. 5A), alle shRKIP transficerede cellelinier var mindre følsomme over for cisplatin behandling, sammenlignet med kontrol- cellelinjer transficeret med tom vektor, er denne forskel mindre tydelig for C-33A cellelinie. Som vist i fig. 5B, HeLa-celler transficeret med shRKIP viste en gennemsnitlig IC

50 af 18.55 ± 2,06 uM mod de 5,91 ± 0,30 uM nås med de tomme vektor celler. For C-33A cellelinie værdierne var mere ens mellem de to transficerede cellelinjer, 10,37 ± 2,69 um og 13,25 ± 1,98 uM for tom vektor og shRKIP transficerede celler, (fig. 5B). Den SiHa-cellelinjen var mindre følsom over for cisplatin med tom vektor transficerede celler der strækker 25.99 ± 0,51 uM gennemsnitlig IC

50, mens shRKIP transficerede celler nåede 40.69 ± 2,37 uM gennemsnitlig IC

50 for cisplatin (fig . 5B).

A) Repræsentative billeder af den ikke-lineære regressionsanalyse af livmoderhalskræft cellelinjer behandlet med cisplatin til bestemmelse af halv maksimale hæmmende koncentrationer (IC

50). B) Grafisk repræsentation af den gennemsnitlige IC

50 med henblik på cisplatin i den cervikale cancercellelinier. De transficerede celler med shRKIP var mindre følsomme over for cisplatin behandling i de tre forskellige cellelinier. C) HeLa transficerede cellelinier blev udsat for stigende koncentrationer af cisplatin med 24 timer. Cisplatinbehandling induceret ERK-aktivering (p-ERK1 /2) og apoptose af cellerne som vurderet af PARP (samlet og cleaded specifikke antistoffer) og caspase-9-spaltning, hovedsagelig i tom vektor transficerede celler. Alle forsøgene blev udført tre gange i mindst tre gange.