PLoS ONE: cis-Expression QTL analyse af Etableret Colorectal Cancer Risk Varianter i Colon tumorer og tilstødende Normal Tissue

Abstrakt

Genom-dækkende forening undersøgelser (GWAS) har identificeret 19 risici varianter forbundet med kolorektal cancer. Da de fleste af disse risikofaktorer varianter bosat uden de kodende regioner af gener, gennemførte vi

cis

-expression kvantitativ trait loci (

cis

-eQTL) analyser at undersøge mulige regulerende funktioner på ekspressionen af ​​nabolande gener. Fyrre mikrosatellit stabile og CpG ø methylator fænotype-negative kolorektale tumorer og parret tilstødende normale colon væv blev anvendt til genom-dækkende SNP og genekspression profilering. Vi fandt, at tre risikogrupper varianter (rs10795668, rs4444235 og rs9929218, ved hjælp af nær perfekt fuldmagter rs706771, rs11623717 og rs2059252 henholdsvis) var signifikant associeret (FDR

q

-værdi ≤0.05) med ekspressionsniveauer af nærliggende gener ( 2 Mb op- eller ned-stream). Vi observerede en sammenhæng mellem lav kolorektal cancer risiko allel (A) for rs10795668 på 10p14 og øget ekspression af

ATP5C1 Hotel (

q

= 0,024) og mellem kolorektal cancer høj risiko allel (C ) for rs4444235 på 14q22.2 og forøget ekspression af

DLGAP5 Hotel (

q

= 0,041), både i tumorprøver. Den kolorektal cancer allel lav risiko (A) for rs9929218 på 16q22.1 var forbundet med et signifikant fald i ekspressionen af ​​både

NOL3 Hotel (

q

= 0,017) og

DDX28

(

q

= 0,046) i de tilstødende normale kolon vævsprøver. Af de fire gener,

DLGAP5

NOL3

tidligere er blevet rapporteret til at spille en rolle i kolon carcinogenese og

ATP5C1

DDX28

er mitokondrielle proteiner involveret i cellulær metabolisme og division hhv. Kombinationen af ​​GWAS fund, tidligere funktionelle undersøgelser, og det

cis

-eQTL analyser beskrives her tyder formodede funktionelle aktiviteter for tre af de kolorektal cancer GWAS identificeret risiko loci som regulerer ekspressionen af ​​tilstødende gener.

Henvisning: Loo LWM, Cheng I, Tiirikainen M, Lum-Jones A, Seifried A, Dunklee LM, et al. (2012)

cis

-Expression QTL Analyse af Etableret Colorectal Cancer Risk Varianter i Colon tumorer og tilstødende Normal Tissue. PLoS ONE 7 (2): e30477. doi: 10,1371 /journal.pone.0030477

Redaktør: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, USA

Modtaget: September 1, 2011; Accepteret: 16. december 2011; Publiceret: 17 feb 2012

Copyright: © 2012 Loo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Cancer Institute, National Institutes of Health under RFA # CA-95 til 011; og gennem samarbejdsaftaler med University of Hawaii Colorectal Cancer Family Registry (U01 CA074806), Mayo Clinic Cooperative Family Registry for Colon Cancer Studies (U01 CA074800), Ontario Registry for Studier af familiær Kolorektal Cancer (U01 CA074783), University of Southern California familiær Colorectal neoplasi Collaborative Group (U01 CA074799), og medlemmer af Colon Cancer Family Registry og proteasehæmmere Desuden blev dette arbejde delvist støttet af tilskud 5U24 CA074806 og Affymetrix Samarbejde i Cancer Research Program. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

genom-dækkende associationsstudier (GWAS) af kolorektal cancer har afsløret 19 almindelige genetiske varianter på 14 loci, der bidrager til risikoen for kolorektal cancer [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]. Alle undtagen én (rs10936599) af disse risikofaktorer varianter bor i intron, intergeniske eller gen-ørkenområder (tabel 1), og kan tjene som markører for kausale varianter, der regulerer nabolande eller fjernere gener. Således er den aktuelle udfordring er at belyse, hvordan disse risikofaktorer varianter specifikt påvirke udviklingen af ​​tyktarmskræft. En lovende fremgangsmåde er at evaluere disse varianter for deres foreninger med differential genekspression siden udskrift overflod kan fungere som et nyttigt mellemliggende fænotype i decifrere forbindelsen mellem en genetisk locus og en klinisk fænotype [8].

Gene ekspressionsniveauerne er meget arvelige [9], [10], [11] og differentieret genekspression kan knyttes til en bestemt genetisk sted som et udtryk kvantitativ egenskab locus (eQTL) påvirker i nærheden (

cis-

) eller fjerne (

trans-

) gener [12], [13]. Faktisk er der rapporteret GWAS risikofaktorer loci at blive beriget for eQTLs, der giver indsigt i mulige mekanistiske effekter samt medvirken i identifikationen af ​​yderligere varianter, der kan tegne sig for arveligheden af ​​sygdom [14]. Mens flere tidligere eQTL undersøgelser er blevet gennemført næsten udelukkende i lymfoblastoidcellelinier [12], [15], [16], har et par nyere undersøgelser vist vævsspecifikke associationer mellem genetiske varianter og genekspression [17], [18], [19]. For kræftrisiko loci, er eQTL foreninger observeret i vævet oprindelse giver anledning til tumoren forventes at være mere informative [20].

For at afdække, om etablerede risikofaktorer varianter for kolorektal cancer påvirker ekspressionen af ​​tilstødende gener forskelligt af genotype, gennemførte vi en

cis

-eQTL analyse af GWAS-identificerede kolorektal risiko varianter ved hjælp af de parrede kolon tilstødende-normal og tumor vævsprøver indsamlet fra 40 patienter med tyktarmskræft. Dette er den første undersøgelse for at gennemføre en

cis

-eQTL analyse på både tilstødende normalt og tumorvæv fra en homogen gruppe af molekylært karakteriserede kolorektale tumorer (MSS og CIMP-negative).

Materialer og Metoder

Etik Statement

Godkendelse til denne undersøgelse blev opnået i overensstemmelse med lokale Institutional Review Board (IRB) krav i alle deltagende centre. Alle emner indgår i denne undersøgelse underskrev en informeret skriftligt samtykke.

forsøgspersoner og vævsprøver

Frisk frosset, blev kolon adenokarcinomer og parrede tilstødende normale vævsprøver indsamlet på tre steder (Mayo Clinic, Mount Sinai, og Cleveland Clinic) fra deltagerne i Colorectal Cancer Family Registry (C-CFR) [21] og testet for mikrosatellit instabilitet (MSI) og CpG ø methylator fænotype (CIMP). Prøver fra 40 mikrosatellit stabil (MSS) /CIMP-negative tumorer, den mest almindelige form for tyktarmskræft, og deres parrede tilstødende normale vævsprøver (i alt 80 prøver) blev anvendt til denne undersøgelse. De 40 patienter var af europæisk afstamning med en gennemsnitlig alder på diagnose af 57 år.

DNA og RNA-isolering

Alle tumorprøver blev snittet og farvet med hematoxylin og eosin, derefter af en patolog at bestemme tumor celleindhold. Tumorprøver anvendt til undersøgelsen havde 70% indhold tumorcelle. Genomisk DNA og totalt RNA blev ekstraheret fra disse vævsprøver anvendelse af Qiagen AllPrep DNA /RNA Mini kit (QIAGEN, Valencia, CA) efter fabrikantens anbefalinger.

MSI og CIMP Testing

MSI status var bestemmes ved at analysere 10 mikrosatellit loci (

BAT25

,

BAT26

,

BAT40

,

BAT24C4

,

D5S346

,

D17S250

,

ACTC

,

D18S55

,

D10S197

, og

MYCL

) som tidligere beskrevet [22]. Tumorer blev klassificeret som MSS, hvis der ikke markører udstillet ustabilitet. For CIMP testning, blev tumor-DNA behandlet med natriumbisulfit og analyseret ved anvendelse af automatiserede realtids-PCR-baserede MethyLight Assay til at identificere methylerede bindingssteder for CpG i promotorregionerne af en etableret fem-gen panel til CIMP (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

, og

SOCS1

) og i promotor-regionen i

MLH1

. CIMP status blev rapporteret som tidligere beskrevet i [23]. Tumorer blev klassificeret som CIMP negativ, hvis promotor hypermethylering blev fundet i ≤2 gener af den fem-gen panel og hvis der ikke var

MLH1

promotor DNA methyation.

microarray analyse

Gene udtryk profiler for kolon tumorer og tilstødende normale væv blev evalueret med Affymetrix GeneChip menneskelige Exon 1.0 ST Array (Affymetrix, Santa Clara, CA); GEO tiltrædelse nummer GSE31737. Ribosomalt RNA (rRNA) blev fjernet fra totalt RNA ved anvendelse af RiboMinus menneske /mus Transkriptomet Isolation Kit (Invitrogen Carlsbad, CA). Efter rRNA reduktion, Affymetrix GeneChip Whole Transcript (WT) Sense Target Labeling-assay blev anvendt til at frembringe forstærket og biotinylerede sense-streng DNA-mål til hybridisering på GeneChip Humant Exon 1.0 ST Arrays, efter producentens anbefalinger.

Genomisk DNA blev ekstraheret fra normal colon væv (n = 34) eller blod (n = 6) prøver og genotypebestemmes hjælp af Affymetrix Genome-Wide Humant SNP 6.0 Array. Kort fortalt blev DNA-prøver behandlet, mærket og hybridiseret ifølge producentens anbefalinger. Alle arrays blev scannet på The GeneChip® Scanner 3000 7G hjælp af Affymetrix GeneChip kommandokonsollen (AGCC) Software til at måle de fluorescerende signalintensiteter på hver probe placering. Den gennemsnitlige takst for de 80 prøver var 99,6%.

Valg af risikofaktorer varianter for CRC

Vi overvejede alle 19 etablerede risikofaktorer varianter for kolorektal cancer rapporteret af genom-dækkende forbindelsesundersøgelser til november, 2010 (tabel 1) [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]. Genotype data for 12 af de 19 varianter var ikke tilgængelig fra Affymetrix 6.0 array (tabel 1). For hver af disse 12 varianter ikke på array, blev en proxy udvalgt blandt de indtastede SNPs i en region 20 kb op- eller nedstrøms for den risiko, allel, som var i højeste LD (r

2≥0.90) med risiko variant blandt HapMap CEU (https://gvs.gs.washington.edu/GVS/). Fordi rs10411210 på 19q13.1 ikke havde en acceptabel proxy (r

2 0,90). På Affymetrix 6.0 array, blev det udelukket, hvilket resulterer i alt 18 risikofaktorer varianter til analyse

Real- Time PCR validering

Teknisk validering af genekspression profiler blev udført på 20 tumor-tilstødende normale par indgår i microarray-analyser. Real-Time kvantitativ PCR (qPCR) blev gennemført for de gener, viser sig at være forskelligt udtrykt af geneotype i denne undersøgelse (

ATP5C1

,

DLGAP5

,

NOL3

,

DDX28

) og for fire gener (

APC

,

MACC1

,

DCC

, og

DSC2

) tidligere identificeret at være differentielt udtrykte i kolorektale tumorer. Kort sagt blev cDNA fremstillet fra op til 2 ug ubehandlet total RNA under anvendelse af høj kapacitet cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems Foster City, CA). For Real-Time qPCR, 21-25 ng cDNA (baseret på RNA input) blev kørt på 384-godt PCR-plader i tre eksemplarer hjælp 1 × TaqMan genekspression assays og TaqMan Universal PCR Mastermix med de anbefalede termiske profiler på 7900HT Hurtig Virkelige -Tid PCR System (Applied Biosystems Foster City, CA).

Statistisk analyse

for hver af de 18 risikofaktorer varianter undersøgte, en

cis

-eQTL analyse blev udført til undersøge sammenhængen mellem SNP genotyper og genekspression af alle nærliggende gener (inden for 2 Mb op- og nedstrøms for hver SNP). Hver SNP blev undersøgt ved co-dominante og dominerende modeller, ved hjælp af den rapporterede større allel blandt europæerne som reference allel. Risiko varianter, der har en genotype kategori med mindre end 2 prøver er ikke præsenteret. Genom-dækkende genekspression værdier var log

2-transformeret og normaliseret ved hjælp Robust Multi-array analyse (RMA), ved hjælp af median polsk sammendrag [24]. Transkriptet ekspression værdi for hvert gen betragtes var baseret på gennemsnittet af den probeset intensitet for dette gen. At identificere

cis

-genes forbundet med differentiale udtryk ved SNP genotypen blev multivariat analyse af kovarians (ANCOVA) udføres, justeret for tumor fase og assay batch. Den Benjamini og Hochberg falske opdagelse sats (FDR) korrektion blev anvendt til at korrigere for antallet af testede i 4 Mb interval adspurgte for hver risiko allel [25] gener. Spearman rank korrelation test blev udført for at validere sammenhængen mellem microarray og qPCR assays. Den Partek Genomics Suite 6.5 Software (St. Louis, MO) blev anvendt til microarray og statistisk data-analyser.

Resultater

I vores stikprøve sæt af 40 parrede MSS og CIMP-negative kolorektale tumorer og tilstødende normale væv, vi identificeret 50 gener, der blev udtrykkes forskelligt af genotype for 11 af de 18 risikofaktorer varianter undersøgt (

s

-værdier 0,05; tabel S1). Efter korrektion for multiple-test, fire gener (

ATP5C1

,

DLGAP5

,

NOL3

,

DDX28

) blev identificeret til at demonstrere en statistisk signifikant forskel i ekspressionsniveauer i tumoren eller tilstødende normale colon væv i en eller flere af de tre genotype kategorier for rs10795668 (10p14), rs4444235 (14q22.2), eller rs9929218 (16q22.1) (global test: FDR

q

-værdi 0,05; tabel 2). For rs10795668 på 10p14, observerede vi en signifikant forskel i genekspressionsniveauer ved genotype i tumorer for genet, der koder for gamma-underenheden i F1 kompleks af mitokondrisk ATP syntase (

ATP5C1

;

q

-værdi = 0,024). I modsætning hertil var der ingen forskel i genekspression niveauer ved genotype for

ATP5C1

eller andre tilstødende gener i tilstødende normal colon væv til denne variant. Tilsvarende for rs4444235 ved 14q22.2, observerede vi en signifikant forskel i genekspressionsniveauer ved genotype for

Drosophila

homolog af diske, stort associeret protein 5 (

DLGAP5 q

værdi = 0,041) ved sammenligning genekspressionsniveauer i tumorvæv, men ikke i det tilstødende normale væv. For rs9929218 på 16q22.1 blev to gener observeret at have en forskel i ekspressionsniveauerne ved genotype: nucleolar protein 3 (

NOL3

;

q

-værdi = 0,017) og DEAD kasse polypeptid 28 (

DDX28

,

q

-værdi = 0,046), i det tilstødende normale, men ikke tumorvæv.

de genotype-specifikke sammenligninger for de tre risikogrupper varianter med

cis

-eQTL foreninger er vist i tabel 2 og figur 1. Vi observerede en statistisk signifikant forøget ekspression af

ATP5C1

i tumorerne hos patienter homozygote for a-allelen (

q

værdi = 0,006) ved rs10795668 (10p14) i forhold til referencen genotypen (GG). For rs4444235 (14q22.2), tumorer i patienter, der var homozygote for C-allelen havde signifikant højere Udtryk for

DLGAP5

i forhold til de tumorer i dem med henvisning genotypen (TT) (

q

-værdi = 0,014). For rs9929218 (16q22.1), genotypen særligt udtryk for

NOL3

og

DDX28

i det tilstødende normale colon væv blev faldt betydeligt blandt patienter heterozygote for A allel versus dem med henvisning genotype (GG) (

q

-værdi = 9,34 × 10

-5 og

q

-værdi = 4,15 × 10

-4 henholdsvis).

Box plots af normaliserede genekspression niveauer af

ATP5C1

,

DLGAP5

,

NOL3

,

og DDX28

for parret tilstødende normale colon væv (n = 40) og colontumorvæv (n = 40). Hvert punkt repræsenterer de normaliserede RNA ekspressionsniveauer for et individ. Medianen genekspression for hver genotype specifik gruppe er angivet med en linje inde hver boks i grafen.

s

-værdi indikerer betydningen af ​​den globale test sammenligner udtryk tværs genotyper. Hvis p-værdier var signifikant (

s

-value≤0.05), FDR

q

-værdier blev leveret, hvilket indikerer betydningen efter korrektion for multiple sammenligninger.

på grund af det lille antal af forsøgspersoner, som homozygote for de kolorektal cancer mindre alleler, vi også overvejet genekspression niveauer i prøver, der gennemføres enten en eller to kopier af den mindre allel, i forhold til henvisningen genotypen (sidste kolonne tabel 2). Tumor prøver fra patienter med en eller to kopier af den mindre allel (er) (enhver A) for rs10795668, sammenlignet med GG-genotypen, viste forøget udtryk for

ATP5C1 dele på 10p14 (

q

-værdi = 0,004). Tilsvarende for tumor prøver af patienter med en eller to kopier af den mindre allel (er) (enhver C) ved rs4444235 (14q22.2), udtryk for

DLGAP5

blev øget i sammenligning med tumorer med TT genotype (

q

-værdi = 0,032). Der var ingen statistisk signifikant forskel i ekspression af

NOL3

og

DDX28

i tumor eller tilstødende normale væv, når man sammenligner patienter med en eller to kopier af den mindre allel (er) (A) versus dem med GG genotype for rs9929218 ved 16q22.1 (tabel 2).

de fire gener, vi identificeret til at være differentielt udtrykt i forhold til de tre risikogrupper varianter har vist sig at have en rolle i cancer-relaterede mekanismer, såsom cellulær metabolisme og proliferation og apoptose [26], [27], [28], [29]. Derfor har vi sammenlignet ekspressionsniveauerne af de fire

cis

-regulated gener (

ATP5C1

,

DLGAP5

,

DDX28

,

NOL3

) mellem tumorer og tilstødende normale colon væv. Alle fire gener blev differentielt udtrykt i tumorer sammenlignet med de tilstødende normale colon vævsprøver. Udtrykket niveau af

ATP5C1 Hotel (

s

-værdi = 0,005) var lavere i tumorer, mens ekspressionsniveauerne af

DLGAP5

(

s

– værdi = 7,80 × 10

-7),

DDX28 Hotel (

s

-værdi = 0,016) og

NOL3 Hotel (

s

-værdi 0,044) var højere i tumorer i forhold til tilstødende normale colon væv (Figur 2).

Box plots af genekspression niveauer for

ATP5C1

,

DLGAP5

,

NOL3

,

og DDX28

i parret tilstødende normale colon væv og colontumorvæv (n = 40 par). Betydningen af ​​differentieret udtryk er angivet med

s

-værdi.

For at bekræfte pålideligheden af ​​microarray resultater, vi foretaget en teknisk validering ved hjælp qPCR afprøvning af genekspressionsniveauer på 20 tilfælde med resterende RNA, ud af de 40 oprindelige sager, både for tilstødende normale og tumor vævsprøver. Den Spearman s Rank Order korrelationskoefficienterne for de fire gener identificeret i

cis

-eQTL analyse i vævstype (tumor eller normalt) hvor genotype-specifik differentiel ekspression blev observeret var,

ATP5C1 r

s

= 0,39;

DLGAP5 r

s

= 0,68;

NOL3 r

s

= 0,11;

DDX28 r

s

= 0,22. Som en yderligere teknisk validering skridt, vi analyseret fire gener (

APC

,

MACC1

,

DCC

, og

DSC2

), der tidligere er blevet etableret skal udtrykkes differentielt mellem tumor og tilstødende normale væv i kolorektal cancer [30], [31], [32], [33]. Vi fundet god korrelation (Spearman rang Order korrelation,

r

s

0,5) i genekspressionsprofilerne for alle fire gener mellem vores microarray og qPCR assays. Konkret lavere udtryk for

APC

,

DCC

, og

DSC2

og højere udtryk for

MACC1

blev observeret i tumor prøver i forhold til den parrede tilstødende normale væv i både microarray og qPCR assays. Disse tekniske validering data understøtter pålideligheden af ​​vores observationer baseret på genekspression microarray resultater.

Diskussion

Vores undersøgelse undersøgte 18 af de 19 GWAS-identificerede kolorektale cancer risiko varianter for association med udtrykket af tilstødende gener (inden for 2 Mb op- og nedstrøms for SNP) i 40 patienter med MSS og CIMP-negative tyktarmskræft, ved hjælp af frisk frosset parret tilstødende normale og colon tumor prøver (figur S1). Vi identificerede fire gener (

ATP5C1

,

DLGAP5

,

NOL3

, og

DDX28

) på tre risiko loci med en statistisk signifikant forskel i genekspression niveauer ved genotype.

ATP5C1

koder for gamma-underenheden af ​​den katalytiske kerne (F1) af mitokondrie ATP syntase, enzymkomplekset ansvarlig for ATP-syntese, vides at spille en central rolle i cellulær respiration. En fælles begivenhed i tumorceller er det metaboliske skift fra respiration (i mitochondrierne) til glycolyse (i cytosolen), der ofte omtales som “Warburg-effekten” [34], [35]. Flere mekanismer kan indlede denne omskifter, hvoraf den ene er et fald i ekspressionen af ​​beta-underenheden af ​​ATP syntase (F1) (

ATP5B

), der fører til afbrydelse af den katalytiske funktion af ATP syntase kompleks, en begivenhed, der tidligere er blevet observeret i flere typer cancer [26], [29]. I tumorprøver analyseret i nærværende undersøgelse, observerede vi en stigning i ekspressionsniveauerne af

ATP5C1 Hoteller, som var signifikant associeret med A-allelen på rs10795668. A allelen har været forbundet med en nedsat risiko for colorectal cancer (OR = 0,89;

s

= 2,5 × 10

-13) i en tidligere GWAS [6]. Således forøget ekspression af

ATP5C1

forbundet med A-allelen ville være i overensstemmelse med at opretholde aktiviteterne i ATP-syntase og cellulære respiration og potentielt hæmme tumor progression for tyktarmskræft.

DLGAP5

, også kendt som

HURP

(hepatom opreguleret protein), koder for et mikrotubulus-bindende protein involveret i dannelsen og funktionen af ​​mitotiske spindler [36], [37] og menes at være en celle cyklus regulator og mål for Aurora A-kinase [38], [39]. Over-ekspressionen af ​​

DLGAP5

har været forbundet med en deregulering af spindel fiber dannelse og funktion under mitose [38]. Desuden er det blevet rapporteret, at

DLGAP5

kan have en rolle i stamcelle vedligeholdelse og overlevelse og er blevet observeret til at være overudtrykt i kolorektale cancerceller [27], [28], [40]. C-allelen for rs4444235 er tidligere blevet rapporteret i GWAS at øge risikoen for kolorektal cancer (OR = 1,11;

s

= 8,1 × 10

-10) [3]. Vores konklusion, at C-allelen er forbundet med øget

DLGAP5

udtryk i tumorer, tyder på en potentiel mekanisme, hvormed denne allel kan fremme tumor progression for tyktarmskræft. Desuden bemærker vi, at rs4444235 har vist sig at have en væsentlig stærkere tilknytning til MSS-undertyper af kolorektal cancer [3], som var den molekylære undertype af tumor prøver indgår i vores undersøgelse.

DDX28

koder for en DEAD kasse protein med RNA helicase aktivitet. Selv

DDX28

har ikke specifikt blevet rapporteret at have en rolle i colorektal cancer, andre DEAD box RNA helicaser er blevet vist at være overudtrykt i kolorektale tumorer, hvilket viser en funktion for RNA helicaser i tumorigenese [41], [42 ], [43].

NOL3

gen, også kendt som ARC (apoptose repressor med caspase rekruttering domæne) koder for et anti-apoptotisk protein, der regulerer p53 og caspaser 2 og 8 [44], [45]. Flere undersøgelser har vist, at

NOL3

reguleres af aktiverede N- og H- Ras og overudtrykt i kolorektal cancer [41], [46], [47]. Vi har også observeret

NOL3

skal overudtrykt i tumoren versus tilstødende normale væv. Desuden er vores

cis

-eQTL analyse viste en forening for nedsat ekspression af både

DDX28

og

NOL3

i tilstødende normale colon væv af individer bærer A-allelen, især tilfælde med GA genotype for rs9929218. Taget sammen med konstateringen af, at en allel ved rs9929218 er forbundet med nedsat risiko for colorectal cancer (OR = 0,91;

s

= 1,2 × 10

-8) [3], vores observation af en forening mellem denne allel og faldt

DDX28

NOL3

udtryk i tilstødende normale væv tyder på, at disse gener kan sænke risikoen for tarmkræft ved at fungere til at hæmme tidlige begivenheder i kolorektal carcinogenese. Vores resultater kan også understrege vigtigheden af ​​at studere normalt væv, i tillæg til tumorvæv, i eQTL studier af kræft.

Interessant, de differentielt udtrykte gener, der er identificeret i denne undersøgelse var ikke gener direkte tilgrænsende de GWAS risiko varianter. For eksempel, for rs10795668,

GATA3

er det tætteste nærliggende gen, men vi havde ikke observere nogen væsentlig forening for differentieret udtryk for

GATA3

denne SNP genotype (

s

-værdi 0,05). Tilsvarende for rs4444235 og

BMP4

, som er adskilt af mindre end 10 kb, og for rs9929218, som er beliggende i en intron af

CDH1

, vi observerede ingen sammenhæng med genotype og genekspression. I en nylig undersøgelse, Carvajal-Carmona et al. rapporteret på en fin kortlægningsundersøgelse til kolorektal cancer risiko alleler i 8q23.3 og 16q22.1 [48]. De fandt også ingen forbindelse med genekspression af den nærmeste gen, såsom

EIF3H

og

CDH1

i monocyt cellelinjer henholdsvis men find en forening med fjernere gener såsom

UTP23

for rs16892766 på 8q23.3 og

ZFP90

for rs2059254 på 16q22.1 [48]. I vores undersøgelse af colon vævsprøver, vi også observeret en forening (

s

= 0,03) for

ZFP90

ekspressionsniveauerne og risikoen allelen på 16q22.1 (tabel S1); Men foreningen ikke længere var signifikant efter justeringer for flere sammenligninger. Disse resultater og de i andre undersøgelser [3], [12], [15], [49], tyder på, at risikoen alternative tilbud, ikke fortrinsvis regulere gener, der er nærmest. Snarere kan transkriptionelle reguleringsmekanismer påvirket af allel status indebærer komplekse kromatin bekræftelse stater og funktion inden for et væv specifik kontekst.

Få andre studier har undersøgt sammenhængen mellem kolorektale kræft risiko varianter og genekspression i nær-ved gener. Den COGENT studie undersøgte seks GWAS risiko varianter for deres effekt på ekspressionen af ​​et mindre antal tilstødende kandidatgener i 90 CEU Hapmap, EBV-transformerede lymfoblastoide cellelinier (rs9929218 for

CDH1

og

CDH3

, rs4444235 for

BMP4

, rs10411210 for

RHPN2

, rs961253 for

BMP-2

, rs6983267 for

c-myc

, og rs3802842 for

LOC120376

) [3]. Der blev ikke fundet signifikante sammenhænge. Selvom vi ikke var i stand til at vurdere rs10411210, vi på samme måde fundet nogen associationer mellem de resterende fire varianter og differential ekspressionen af ​​disse gener før eller efter korrektion for multiple test i både tilstødende normal tyktarm og tumorvæv (

s

-værdier 60% at påvise en forskel på 15% i udtryk tværs genotyper) og behovet for replikering studier med større stikprøvestørrelser at bekræfte effekten af ​​disse risikofaktorer varianter om regulering genekspression af tilstødende gener. De mest bemærkelsesværdige styrker af dette studie var at medtage både tilstødende normalt og malignt væv og begrænsningen til en homogen gruppe af molekylært karakteriserede kolorektale tumorer (MSS og CIMP-negative).

Sammenfattende vores data viser, at analysen af ​​virkningerne af risiko- alleler på genekspression i velkarakteriserede tumorer og deres parrede hosliggende normalt væv vil sandsynligvis være meget informative. Yderligere undersøgelse af de risikofaktorer varianter og differentielt udtrykte gener vil skulle udføres for at bekræfte vores resultater, samt at udvide analysen til andre molekylære undertyper af kolorektal cancer og adressering mekanistiske hændelser i et væv specifik kontekst.

Støtte Information

figur S1.

Flow diagram af

cis

-eQTL analyse af kolorektal cancer risiko varianter. Det diagram viser de procedurer, til at analysere af virkningerne af risiko- alleler på genekspression, af gener inden for en 4 Mb vifte af risikoen allelen, i godt karakteriseret kolorektale tumorer og deres parrede tilstødende normale væv

doi:. 10,1371 /journal.pone.0030477.s001

(TIF)

tabel S1.

differentielt udtrykte gener, der er forbundet med risikofaktorer varianter for kolorektal cancer. En liste over de 50 gener, der blev identificeret til at være forskelligt udtrykt af genotype for 11 af de 18 risiko varianter undersøgt (

s

-værdier 0,05) i analysen af ​​40 parrede MSS og CIMP-negative kolorektal tumor og tilstødende normale væv

doi:. 10,1371 /journal.pone.0030477.s002

(PDF)

Tak

indholdet af dette manuskript ikke nødvendigvis afspejler de synspunkter eller politikker af National Cancer Institute eller et af de samarbejdende centre i CFR’er, heller ikke omtale af firmanavne, kommercielle produkter, eller organisationer indebærer godkendelse af den amerikanske regering eller den fælles referenceramme. Vi takker også deltagerne i Colon Family Registry, som har bidraget til en bedre forståelse af de genetiske bidrag til tyktarmskræft. Vi vil også gerne takke Affymetrix Cancer Research Program og Drs. Gordon Okimoto og Hansong Wang til analytisk vejledning.