Abstrakt
Ataksi-telangiectasia muteret (ATM) er en Ser /Thr proteinkinase, der spiller en kritisk rolle i DNA beskadigelse-induceret signalering og initiering af cellecyklus checkpoint signalering som respons på DNA-beskadigende midler, såsom ioniserende stråling. Vi har tidligere rapporteret ATM proteintab ved immunhistokemi (IHC) i 16% af human gastrisk cancer (GC) væv. Vi antager, at
ATM
gen intron-mutationer er omfattet af mikrosatellit instabilitet (MSI) forårsage ATM protein tab i en delmængde af GC. Vi studerede mononukleotid mutationer ved intron af
ATM
gen, ATM IHC og MSI i GC. Ti humane gastrisk cancer cellelinjer blev undersøgt for
ATM
genmutation ved introns, RT-PCR, direkte sekventering, og immunhistokemi. GC væv af 839 patienter blev analyseret for MSI og ATM IHC. Blandt dem, blev 604 sager analyseret for
ATM
mutationer ved introns forud exon 6, exon 10 og exon 20. To menneskelige GC cellelinier (SNU-1 og -638) viste
ATM
intron-mutationer, deletion i RT-PCR og direkte sekventering, og ATM proteintab ved IHC. Hyppigheden af
ATM
mutation, MSI, og ATM protein tab var 12,9% (78/604), 9,2% (81/882) og 15,2% (134/839), hhv. Analyse af foreninger blandt MSI, ATM genmutation, og ATM protein tab afslørede stærkt co-eksisterende
ATM
genændringer og MSI.
ATM
intron mutation og ATM protein tab blev fundet i 69,3% (52/75) og 53,3% (40/75) af MSI positive GC. MSI positivitet og ATM protein tab var til stede i 68,4% (52/76) og 48,7% (37/76) af GC med ATM intron mutation.
ATM
mutation og ATM protein tab havde karakteristika alderdom, distal placering af tumor, stor tumorstørrelse, og histologiske tarm type. Vores undersøgelse kan fortolkes som, at
ATM
genmutation ved intron kan målrettes af MSI og føre til ATM protein tab i en udvalgt gruppe af GC.
Henvisning: Kim HS, Choi SI, Min HL, Kim MA, Kim WH (2013) Mutation ved Introniske gentagelser af Ataksi-Telangiectasia muterede (ATM) Gene og ATM Protein Tab i Primary mavekræft med mikrosatelitter ustabilitet . PLoS ONE 8 (12): e82769. doi: 10,1371 /journal.pone.0082769
Redaktør: Hoguen Kim, Yonsei University College of Medicine, Republikken Korea
Modtaget: Juli 21, 2013; Accepteret: Oktober 27, 2013; Udgivet: December 6, 2013 |
Copyright: © 2013 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Denne forskning blev støttet af Basic Science Research Program gennem National Research Foundation Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for Videnskab, IKT Future Planlægning (NRF-2012R1A1A2004648). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Ataksi-telangiectasia muteret (ATM) genet er en komponent af DNA-skade responset (DDR) og aktiveres af DNA dobbelt-strengbrud (DSBs), og signalerer cellecyklen checkpoint at bremse passagen af celler gennem cyklussen for at lette DNA-reparation. Genet er lokaliseret til kromosom 11q22-23.
ATM
gen er meget stort, spænder over en genomisk region på 150 kb, bestående af 66 exoner med en kodende sekvens af 91.668 bp.
ATM er impliceret i responser på DSBs, der forekommer fysiologisk i specialiserede celletyper såsom kimceller og lymfocytter. ATM protein hjælper celler i at genkende beskadigede eller knækkede DNA-strenge. ATM protein koordinerer DNA-reparation ved at aktivere enzymer, der løser de knækkede tråde. Effektiv reparation af beskadigede DNA-strenge er med til at opretholde stabiliteten i cellens genetiske information [1].
ATM tab blev observeret i 16% af menneskers GC væv i en stor kohorte undersøgelse [2]. Inaktivering af
ATM
gen kan være en hyppig begivenhed i udviklingen af menneskelig gastrisk cancer (GC); Men de begivenheder relateret til tab af
ATM
udtryk i GC kunne ikke forklares ved den lave forekomst af
ATM
mutation. De fleste af de
ATM
mutationer identificeret i primære GC cellelinjer og GC væv var punktmutationer [3].
DNA mismatch repair (MMR) korrigerer de fejl, der kan opstå under DNA-replikation, hvorimod homolog rekombination og ikke-homolog ende sammenføjning er involveret i reparation af DNA DSB. Mutationer i DNA DSB reparation gener såsom
ATM, MRE11, RAD50, NBS1
ATR
er postuleret at spille en rolle i udviklingen af gastrointestinale maligniteter med en forringet MMR funktion. I kolorektale tumorer med nedsat MMR-system, mutationer af intron mononukleotid gentager i
ATM
MRE11
blev fundet at resultere i uregelmæssig splejsning efterfulgt af reduceret ekspression af vildtypeproteinet [4 ].
Ca. 10% af GC er forbundet med mikrosatellit instabilitet (MSI). MSI refererer til ændringer i antallet af nukleotid- gentagelser i mikrosatellit regioner lokaliseret i den kodende region i gener, og resulterer i læserammeforskydningsmutationer. MSI er blevet identificeret i protein-kodende regioner af kendte målgener herunder
TGF-βRII, IGFIIR, BAX
[5-7], og
hRAD50
gener [8].
hRAD50, BLM
, og
BRACA1
gener har poly (A) mononukleotidbyggeblokken gentager inden de kodende regioner, de
hMSH6
har (C) 8 fordøjelseskanalen,
NBS1
har (A) 7 tarmkanalen, og
ATM
har (T) 7 tarmkanalen. Rammeskift mutationer af disse gener med variable forekomst blev rapporteret tidligere [9-11].
Udover de mange mutationer akkumulerede i neutrale mikrosatellit sekvenser, MSI genererer også mutationer i cancer-gener, dvs. i de gener, der spiller en aktiv rolle i flertrinsprocessen af carcinogenese. Selvom gentagne sekvenser i den kodende region af generne er kortere end den typiske mikrosatellit loci anvendes til genkortlægning, deres tilbøjelighed til at undergå spontane skred fejl under replikation er stadig højere end for ikke-repetitivt sekvenser. Mutationer af en intron gentagelse blev rapporteret at inducere forringet udtryk for
MRE11
gen [12,13]. Polypyrimidine gentagne mutationer i
ATM
gen kan forstyrre den korrekte mRNA splejsning [14]. Men der er ingen beviser for, at indsættelse /sletning forekommer ved disse ikke-kodende mononukleotid sekvenser påvirker normal ATM protein funktion i MSI-relateret GC. I humant GC væv med MSI, hyppigheden af
ATM
mutation og foreningen med tabet af protein funktion er ikke klart forstået. Vi har fremsat den hypotese, at mononukleotid tract ændringer i intron af
ATM
genet er forbundet med tab af ATM proteinfunktion i GC med MSI.
Vi undersøgte mutationer på introniske (T) 15 i
ATM
gen intervenerende sekvens (IVS) foregående exon 6, hvilket fører til 22 bp sletning af exon 6 i humane gastrisk cancer cellelinjer . I den foreliggende undersøgelse blev mutationer af
ATM
gen sammen med tilstedeværelsen af MSI undersøgt i humane GC cellelinjer og primære GC væv. Vores resultater viste, at
ATM
gen intron mutation var hyppige i GC med MSI og var signifikant forbundet med tab af ATM protein funktion.
Materialer og metoder
etiske retningslinjer
Denne retrospektiv undersøgelse blev udført ved anvendelse af prøverne i løbet af hylderne efter patologisk diagnose, og alle prøverne blev anonymiseret før undersøgelsen. Denne retrospektiv undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board of Seoul National University Hospital (H-1010-065-336) med afkald på informeret samtykke på betingelse af anonymisering.
cellelinjer og vævsprøver
Ten human mavekræft celle linjer-SNU-1, SNU-5, SNU-16, SNU-216, SNU-484, SNU-601, SNU- 620, SNU-638, SNU-668 og SNU-719 blev opnået fra den koreanske cellelinje Bank (Seoul, Korea). Alle cellelinier blev dyrket i RPMI1640 tilsat 10% føtalt bovint serum (FBS; Hyclone, Lorgan, UT, USA) og antibiotika (100 U /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycin) ved 37 ° C i en befugtet 5% CO
2 inkubator. En celle-line væv vifte slide lavet af høstede og faste menneskelig GC cellelinjer blev opnået for immunhistokemi (Superbiochips, Korea).
formalinfikserede, paraffinindstøbte GC vævsprøver fra 839 patienter, som gennemgik helbredende gastrektomi for primær mavekræft behandling mellem 1
st januar 2004 og 31
st december, 2005 i Seoul National University Hospital blev indsamlet. Patienterne omfattede 577 mænd og 262 kvinder med en gennemsnitsalder på 57,6 år (interval: 4 til 87 år). Oplysninger om tumor placering blev opnået fra 835 tilfælde: øverste tredjedel i 109, midterste tredjedel i 323, nederste tredjedel i 383, og hele mave i 20 sager. Baseret på Lauren klassificering, de kræftformer var histologisk klassificeret som intestinal type 381, diffus type 327, blandet type i 123, og ubestemt i 8 tilfælde. Ud af de 839 sager, 165 blev tidligt GC og 674 blev avancerede GC. Lymfeknudemetastase var til stede i 531 tilfælde og fraværende i 308 tilfælde. To hundrede og fyrre fem patienter blev diagnosticeret som fase I, 254 som stadie II, 291 som stadium III, og 85 som trin IV. Adjuverende kemoterapi efter operation blev udført på 533 patienter, som omfatter 32 patienter i fase I, 153 i fase II, 260 i fase III, og 82 i trin IV. Den gennemsnitlige opfølgningsperiode var 49,3 måneder (interval: 0-85 måneder). Lokalt recidiv blev bemærket i 185 (21,0%), fjernmetastaser i 85 (9,6%), og død ved nogen årsag 289 ud af 882 patienter (32,8%). Patient overlevelsesdata, herunder datoer og dødsårsager, blev opnået fra den koreanske Central Cancerregisteret, Ministeriet for sundhed og velfærd, Korea. Standard histopatologisk undersøgelse omfattede vurdering af kræft type og patologisk tumor scenen, i henhold til de kriterier, som 7. udgave af AJCC Staging Manual [15].
DNA-ekstraktion og MSI beslutsomhed
Tumor væv prøver på objektglas blev undersøgt under et lysmikroskop. Et område af tumoren, hvor procentdelen af tumorceller overskredet mindst 50% af alle celler i dette område, og en parret område i normal slimhindevæv indeholdende ingen tumorceller blev mærket og skrabet med et knivblad. Den skrabede væv blev opsamlet i 1,5 ml mikrorør indeholdende 50 pi væv lysepuffer (0,5% Tween 20 [Sigma, St. Louis, MO], 100 mM Tris-HCI-buffer [pH 7,6], 1 mM EDTA, og 20 ug proteinase K [ ,,,0],Sigma]). Rørene blev inkuberet i 24 til 48 timer ved 55 ° C, indtil vævet indeholdende lyseringsbuffer blev klar. Proteinase K blev inaktiveret ved inkubation ved 95 ° C i 10 minutter, og det ekstraherede DNA blev opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse. MSI blev vurderet ved loci BAT25, BAT26, D2S123, D5S346 og D17S250. Tumorer blev klassificeret som MSI + når mindst 2 (40%) af de 5 mikrosatellitmarkører var forbundet med alleler af ændrede størrelse i tumor-DNA sammenlignet med DNA fra ikke-tumorvæv.
Påvisning af mutationer af
ATM på
intron mononukleotidbyggeblokken gentager
PCR-amplifikation blev udført i 10 volumen uL indeholdende 1 pi genomisk DNA, 5 pmol hver af forward og reverse primere, og 5 uL premix. Treogtredive cykler PCR blev udført med cyklus-parameter på 95 ° C i 30 sek, 30 sek ved en annealingstemperatur passende for hvert primerpar og 65 ° C i 1 min, efterfulgt af 10 min udvidelse ved 72 ° C.
variation af mononukleotiddannelse repeat i
ATM
genet blev opdaget ved hjælp af en PCR-baseret assay. Genomisk DNA blev amplificeret med primers- F-CCTTTTTCTGTATGGGATTATGG, R-TGAACATCTTGTGAAGGTTTCAG for exon6 (T) 15 (155 bp), F-TCCTTTTAGTTTGTTAATGTGATGGA, R-GCTGTTGGGGTAGAAGCTGA for exon10 (T) 15 (165 bp), og F-GCCAATGGAAGATGTTCTTGA, R- CATCTTGGTCACGACGATACA for exon20 (T) 15 (178 bp).
Påvisning af afvigende splejsning i
ATM
Totalt RNA (2,5 ug) fra humane gastrisk cancer cellelinjer udarbejdet af Trizol-reagens (GIBCO-BRL) blev anvendt til første streng cDNA syntese med Superscript II revers transkriptase (GIBCO-BRL) og oligo-d (T)
12-18 primer. En alikvot af reaktionsblandingen blev amplificeret ved PCR til at syntetisere forskellige segmenter af ATM-cDNA.
PCR-amplifikation blev udført i volumen 20 pi indeholdende 1 pi revers-transkriberet cDNA, 5 pmol af hver af forward og reverse primere, og 10 pi Premix. Femogtredive cykler PCR blev udført med cyklus-parameter på 95 ° C i 30 sek, 30 sek ved en annealingstemperatur passende for hvert primerpar og 72 ° C i 1 min, efterfulgt af 10 min udvidelse ved 72 ° C. PCR-produkter blev elektroforesebehandlet i 2% agarosegel indeholdende ethidiumbromid og visualiseret under UV-lys. β-actin blev anvendt som en intern standard.
Tre RT-PCR primerpar afledt af
ATM
sekvenser (GenBank NM_000051) anvendte F-TGGTGCTATTTACGGAGCTG og R-TTCGAAAGTTGACAGCCAAA at detektere transkripter af exon 5-7 (produkt størrelse: 347 bp), F-TCCCTTGCAAAAGGAAGAAA og R-TACTGGTGGTCAGTGCCAAA for exon 9-11 (produkt størrelse: 504 bp), og F-TGGAGAAGAGTACCCCTTGC og R-GATTGACTCTGCAGCCAACA for exon 19-22 (produkt størrelse: 415 bp ).
Sekvensanalyse
Sekventering blev udført ved dideoxy-kædetermineringsmetoden ved anvendelse af DNA-sekventeringskit (Applied Biosystems) og ABI PRISM 310 Genetic Analyzer. Amplificerede PCR-produkter blev oprenset enzymatisk under anvendelse af et presequencing kit (Amersham Life Science, Cleveland, OH, USA), ifølge producentens instruktioner, og derefter direkte sekventeret under anvendelse BigDye terminator-metoden (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Sekventeringsreaktioner blev kørt på en ABI 3100 automatisk sekventeringsapparat (Applied Biosystems, Biosystems, Foster City, CA, USA), og de opnåede blev analyseret under anvendelse af DNA-sekventering analyse 3.7 software data (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). De nye data er blevet deponeret i GenBank (tiltrædelse nummer: KF704396)
Immunhistokemi
Repræsentative tumor-blok sektioner og celle-line array-sektioner af 4-um tykkelse blev afparaffineres og rehydreret i klassificering. alkohol. Antigen genfinding blev opnået ved tryk -Madlavning prøverne i 0,01 mol /l citratbuffer i 5 minutter. Kaninen monoklonalt antistof (klon Y170 opnået fra Epitomics, Burlingame, CA, USA) blev anvendt til immunhistokemi. ATM var farves i kernen af den normale maveslimhinden, stromale celler, og lymfocytter. Intensitet blev klassificeret som 0 (helt negativ), ± (tvetydigt farvning, signal kun observeret ved high-power mikroskopi med × 40 okular), + /3 (svagt positiv), ++ /3 (moderat positiv) og +++ /3 (stærkt positiv, næsten lig med lymfocytter og neutrofile celler). Kriterierne for negative sager blev sat som mindre end 10% af celler farvet som svagt positive (+ /3) eller højere intensitet, dvs. mere end 90% af cellerne viser totalt negativ (0) eller tvetydige farvning (±) [2 ].
Statistisk analyse
SPSS 15,0 pakken blev anvendt til statistiske analyser. Chi-square test og Cox proportional hazard model blev anvendt. Alle P-værdier er to sidede og P-værdier. 0,05 blev betragtet som signifikant for de statistiske metoder i denne undersøgelse
Resultater
Mutation ved intron mononukleotid gentagelser af ATM-genet i human gastrisk cancer cellelinjer
Blandt 10 humane gastrisk cancer cellelinjer, SNU-1 og SNU-638 blev karakteriseret som MSI positiv,
ATM
genmutationer positive og ATM tab ved IHC. I SNU-1 og SNU-638, blev 22 basepar deletion i exon 6 detekteret ved RT-PCR, og det blev bekræftet i efterfølgende sekvensanalyse (figur 1). SNU-5, SNU-16, SNU-484, SNU-601, SNU-620, SNU-668, og SNU-719 var MSI negative og havde vildtype
ATM
gen. Selvom SNU-216 var MSI negativ, det nærede mutationer i
ATM
gen, og havde stærk ATM udtryk opdaget af IHC (tabel 1).
(A) BAT26 (blå) og BAT25 (grøn) viste stabilt mønster i SNU-5 (øvre) og ustabil mønster i SNU-1 (lavere). (B) ATM-genet PCR-produkter inintervening sekvens (IVS6) (orange), IVS10 (blå), IVS20 (grøn) viste normale længde i SNU-5 (øvre) og afkortning i SNU-1 (lavere). (C) RT-PCR af
ATM
exon 6, exon 10 og exon 20 i gastrisk cancer cellelinjer. SNU-1 og 638 viste 22-bp sletning ved exon 6. (D) Direkte sekventering af IVS 6. SNU-5 har normale sekvens og SNU-1 har 22 sletning ved understregede sekvenser. (E) Immunhistokemi af ATM protein i gastrisk cancer cellelinjer. Negativ i SNU-1, tvetydig i SNU-638, mild positiv i SNU-16 og stærk positiv i SNU-5. (F) Skematisk fremstilling af en 22-bp deletion i exon 6 i
ATM
(882del22).
MSI
ATM
genmutation af intron mononukleotid gentager
ATM
sekventering
ATM
RT-PCR
ATM IHC
Bat 26
Bat 25
IVS 6
IVS 10
IVS 20
Exon 6
Exon 10
Exon 20
Exon 6
Exon 10
Exon 20
SNU-1 +++++ 22-bp delnono22-bp delnonoNegativeSNU-5 —– nonononononoPositiveSNU-16 —– ndndndnononoPositiveSNU-216 – +++ nononono nonoPositiveSNU-484—–ndndndnononoPositiveSNU-601—–ndndndnononoPositiveSNU-620—–ndndndnononoPositiveSNU-638+++++22-bp delnono22-bp del nonoNegativeSNU-668 —– ndndndnononoPositiveSNU-719 —– ndndndnononoPositiveTable 1. mikrosatelitter ustabilitet status og
ATM
gen profiler af humane gastrisk cancer cellelinjer.
IVS, intervenerende sekvens ; IHC, immunhistokemi. CSV Hent CSV
Mutation ved intron mononukleotid gentagelser af
ATM
gen og mikrosatellit ustabilitet i gastrisk kræftvæv
Hyppigheden af intron mutation i
ATM
genet blev bestemt som 12,9% (78/604). Hyppigheden af
ATM
genmutation var 9,3% (50/540) i intron foregående IVS 6; 11,0% (59/534) i intron foregående IVS 10 og 8,8% (46/523) i intron foregående IVS 20; blandt dem, IVS 6 og IVS 10 overlappede i 39, IVS 10 og IVS 20 i 35, IVS 10 og IVS 20 i 34, IVS 6, IVS 10 og IVS 20 i 31 tilfælde (tabel 2). Hyppigheden af MSI positivitet var 9,2% (81/882) og ATM protein tab var 15,2% (134/839) i vores studie af GC. I 596 tilfælde blev analyseret foreningerne blandt MSI (figur 2A), ATM-gen mutation (figur 2B), og ATM protein tab (figur 3).
ATM
intron mutation og ATM protein tab blev fundet i 69,3% (52/75) og 53,3% (40/75) af MSI positive GC. MSI positivitet og ATM protein tab var til stede i 68,4% (52/76) og 48,7% (37/76) af GC med ATM intron mutation. MSI positivitet og ATM intron mutation blev påvist i 35,7% (40/112) og 33,0% (37/112) af GC med ATM proteintab (tabel 3). Hyppigheden af ATM IHC Resultaterne viste en signifikant højere ATM tab i en undergruppe af MSI positive og
ATM
mutationspositivt GC (Figur 4A). Tredive tre af 596 tilfælde (5,5%) har de alle tre molekylære funktioner (figur 4B).
Beliggenhed
Gentager (vildtype)
Intron mutation i GC
Intron mutation i MSI positiv GC
Intron mutation i ATM IHC negative GC
ATM
IVS 6 (T)
1550/540 (9,3%) 42/50 (84,0%) 29/111 (26,1%)
ATM
IVS 10 (T)
1559/534 (11,0%) 47/59 (78,7%) 29/111 (26,1%)
ATM
IVS 20 (T)
1546 /523 (8,8%) 34/46 (73,9%) 22/107 (20,6%)
ATM
IVS 6 eller IVS 10 eller IVS 20 (T)
1578/604 (12,9%) 53/76 (69,7%) 37/112 (33,0%) tabel 2. Incidencies af
ATM
gen intron mutation i mavens kræft (GC)
IVS, intervenerende sekvens.; MSI, mikrosatellit ustabilitet; IHC, immunhistokemi. CSV Hent CSV
Lavere lane viste ustabilitet i BAT26 (blå) og BAT25 (grøn). (B) Nederste lane viste mutation ved mellemliggende sekvens 6 (IVS6) (blå).
(A) Negativ. (B) Equivocal (+/-). (C) svagt positive (1 + ~ 2 +). (D) Stærk positive (3+). Vejviser
ATM IHC
MSI
ATM
mutation
N
Negativ
Positive
NegativeNegative49768 (13,7%) 429 (86,3%) Positive244 (16,7%) 20 (83,3%) Subtotal52172 (13,8%) 449 (86,2%) PositiveNegative237 (30,4%) 16 (69,6%) Positive5233 (63,5%) 19 (36,5%) Subtotal7540 (53,3%) 35 (46,7%) Negative52075 (14,4%) 445 (85,6%) Positive7637 (48,7%) 39 (51,3%) Total596112 (18,8%) 484 (81,2%) tabel 3. Hyppigheden af ATM proteinekspression i undergrupper efter mikrosatellit instabilitet (MSI) status og
ATM
intron mutation.
CSV Hent CSV
(A) Frekvensen af ATM protein tab ved immunhistokemi i gastrisk cancer undergrupper af MSI status og
ATM
intron mutation. (B) Venn diagram, der viser antallet af gastriske kræfttilfælde med overlappende molekylære karakteristika blandt højt niveau mikrosatellit instabilitet (MSI-H),
ATM
intron mutation, og ATM protein tab.
Clinicopathologic korrelationer af
ATM
genmutation i GC
GC patienter med
ATM
genmutation var forbundet med alderdom, stor tumorstørrelse, distal placering, intestinal type, dybere invasion, og lavere recidiv rate. GC patienter med negativ ATM IHC var forbundet med alderdom, stor tumorstørrelse, godt til moderat differentieret type, og intestinal type Lauren klassificering (tabel S1). Chi-square test
ATM
genmutation status i ATM IHC negative og positive grupper med clinicopathologic variabler blev udført. I ATM IHC negative gruppe,
ATM
mutation positive GC var forbundet med alderdom (P = 0,032) og distal placering (P = 0,045). I ATM IHC positive gruppe,
ATM
genmutation var forbundet med godt eller moderat differentieret type GC (P = 0,022) (tabel S1).
Survival analyse
Den Cox proportionel risiko model blev anvendt i både univariate og multivariate tests. Univariate Cox regressionsanalyse for samlet overlevelse og sygdomsfri overlevelse viste signifikant prædiktiv værdi af nogle etablerede prognostiske faktorer såsom lymfeknude metastaser, dybde tumor, og Laurens klassificering af histologiske type. Den patientgruppe, der fik adjuverende chemotherpy havde en signifikant høj relativ risiko for den samlede (OS) og sygdomsfri overlevelse (DFS) (P 0,001, Relativ risiko = 3,82 [95,0% CI, 2,81-5,18] til OS og P 0,001, Relativ risiko = 5,63 [95,0% CI, 3,69-8,58] for DFS). Imidlertid blev ingen signifikante tendenser i relativ risiko (RR) observeret for
ATM
intron mutation, MSI, eller ATM IHC tab. Multivariat analyse ved hjælp variabler af dybden af tumor, lymfeknude status, Laurens klassificering af histologiske type, adjuverende kemoterapi,
ATM
intron mutation, og ATM proteinekspression blev udført. ATM intron mutation har en lavere relativ risiko med et grænsetilfælde betydning for samlet overlevelse (P = 0,05, relativ risiko = 0,60, [95,0% CI 0,36-1,00]) (tabel 4).
Samlet overlevelse
Sygdomsfri overlevelse Vejviser Relativ risiko
95,0% CI
P værdi
N
Relativ risiko
95,0% CI
P værdi
N
Advanced Gastrisk Cancer8.263.00-22.750.005965.051.81-14.130.00544Lymph node positive6.663.47-12.770.005963.201.58-6.480.00544Diffuse typen histology1.431.06 -1.940.025961.611.09-2.360.02544Adjuvant chemotherapy0.990.57-1.730.985962.171.00-4.720.05544
ATM
intron mutation0.600.36-1.000.055960.560.29-1.080.08544ATM protein loss1.190.82-1.730 .355961.100.67-1.810.70544Table 4. Multivariat Cox regressionsanalyse.
CSV Hent CSV
diskussion
Vores resultater viste, at mutationer af en intron gentagelse i
ATM
gen resultere i uregelmæssig splejsning, hvilket fører til 22 bp deletion og ATM-proteinekspression tab i GC cellelinier. Disse resultater er i overensstemmelse med hensyn til fastlæggelse af en splejsning defekt i den foregående rapport [13]
MRE11
forløber udskrift knyttet til mutationer af en poly (T) 11 repeat inden intervenerende sekvens 4 (IVS-4), udelukkende i MMR-mangel cancer cellelinjer og primære tumorer. Vores resultater viste, at ATM proteintab i GC signifikant korrelerer med tilstedeværelsen af intron-genmutation i
ATM
.
I Ataksi-telangiectasia patienter, 70% -90% af
ATM
mutationer er nonsens, frame skift, eller splejsning mutationer, trunkere protein [16]. Ifølge COSMIC databaser (https://www.sanger.ac.uk/cosmic), mutationer ved kodende regioner af
ATM
genet blev detekteret i 5% (433 af 9249) af forskellige kræftformer. Blandt dem mavekræft viste mutationen kun i 1,35% (1 ud af 74). Selvom
ATM
genmutation i GC blev rapporteret tidligere [3,9], omfattende forklaring var begrænset af den lave hyppighed af mutation og relativt høj forekomst af funktionelt tab af ATM [2]. I vores undersøgelse, omkring 70% af MSI positive GC viste signifikant
ATM
gen intron mutation associeret med ATM proteintab. Vores resultater støtter kraftigt, at intron mutation af
ATM
med underliggende MSI er en af de vigtigste mekanismer i ATM tab i human GC. ATM tab skyldes uregelmæssig splejsning forbundet med intron afkortning i MSI positive colon-cancer-cellelinier. Ejima et al. søgte
ATM
genmutationer ved hjælp 62 par af oligonukleotidprimere, der svarer til den region der spænder fra exon 4 til og med exon 65
ATM
og dets flankerende introner. Afkortning af mononukleotidbyggeblokken skrifter af
ATM
introns udgjorde 34 (87%) af 39 intron ændringer. Tredive-en af dem blev fundet i de 5 colon-tumor cellelinier har MSI (LS180, HCT15, HCT116, SW48, og LoVo). De viste også lav ekspression af ATM protein i MSI positive kolorektale cancercellelinjer [14]. ATM ekspression er signifikant reduceret i mange brystcarcinomer, og fandt ingen
ATM
mutation i denne cellelinie [17]. Dette indikerer forskellige funktioner i
ATM
genændringer mellem gastrointestinale og brystcancer.
Foruden mutationer, kan tumorsuppressorgener inaktiveres ved methylering af cytosinrester i CpG-øer, som er placeret i promotoren af mange gener.
ATM
gen er et hidtil ukendt mål for epigenetisk inaktivering gennem uhensigtsmæssig methylering af dens proximale promotorregion korrelerer med øget radiosensitivitet og lav proteinekspression i en human colorektal tumorcellelinie [18] og human glioma cellelinie [18]. uden nogen
ATM
genmutationer.
MSI målretning af
ATM
gen udgør en forbindelse mellem MSI og DNA-reparation i GC. Adskillige undersøgelser viser, at funktionelt tab af ATM øges i MSI og menneskelig
ATM
gen er et stort mål for inaktivering i MSI positiv GC cellelinjer og væv [19,20]. Årsagen til påfaldende høj forekomst af
ATM
gen intron mutation i MSI positiv GC kan skyldes mononukleotidbyggeblokken gentagelser (T) 15, og en længde på 13 nucleotider eller mere var særligt modtagelige for denne målrettede afkortning [14 ]. Hyppigheden af
ATM
gen læserammeskiftemutation (T) 7 i exon 6-kodende sekvens i MSI positiv GC blev rapporteret at være kun 6% (2/36) [8], som er meget lavere end vores observation.
Det forlyder, at ATM-mangel sensibiliserer celler til vækstinhiberende virkninger af PARP-inhibitor, olaparib, i gastrisk kræftceller med nedsat
ATM
udtryk [21]. Poly (ADP-ribose) polymerase inhibitorer evalueres i øjeblikket i kliniske forsøg mod en række cancere, herunder coloncarcinom [22]. I GC, er ATM-mangel kendt for at være en forudsigelse af respons på PARP-inhibitor [23-25]. En markør for homolog rekombination, Rad 51, er kendt for at være prædiktiv markør for neoadjuverende anthracylcine kemoterapi i brystcancer [26] samt af PARP-inhibitor i GC [24].
Vores resultater viste, at ATM proteintab er ikke en aggressiv faktor GC, selv om den er signifikant associeret med ugunstige udvikling af HR i MSI negativ GC. Dette kan sammenlignes med andre undersøgelser, der rapporterer ATM protein tab som en negativ prognostisk faktor [20]. I vores undersøgelser,
ATM
mutation og ATM negative GC havde tydelige clinicopathologic karakteristika; dog har denne gruppe ikke nogen overlevelse forskel med andre. I MSI negative gruppe, HR af GC med ATM protein tab var signifikant høj, men i MSI positiv gruppe, HR i GC med ATM protein tab ikke var signifikant. Dette indikerer, at MSI er en potentiel molekylær faktor, der påvirker biologisk adfærd GC. Således er vores studie understøtter, at MSI status kan påvirke følsomheden over for PARP-inhibitor ved at påvirke status af DNA skade responset proteinekspression gennem mononukleotid gentager ændringer.
Sammenfattende
ATM
genmutation i GC er 12,9%, og 33,0% af GC med
ATM
genmutation er associeret med ATM protein tab. MSI positiv GC viste
ATM
mutation i 69,7%. Vores resultater tyder på, at resultatet af ATM tab og følsomhed over for kemoterapeutisk forbindelse, olaparib, måske bedre forstå, hvis sager er stratificeret baseret på
ATM
genmutation status eller MSI.
Konklusioner
Vores undersøgelse viste,
ATM
gen intron mutation er til stede i 69% af MSI positive GC og 49% af
ATM
intron mutation er forbundet med tab af ATM protein. Disse tyder på
ATM
gen intron mutation målrettet efter mikrosatellit ustabilitet er forbundet med ATM protein tab i en delmængde af menneskelig mavekræft.
Støtte oplysninger
tabel S1.
Clinicopathologic korrelationer af gastrisk karcinom med ATM genmutation og ATM proteinekspression.
doi: 10,1371 /journal.pone.0082769.s001
(DOCX)
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.