PLoS ONE: En intergeniske Non-Coding rRNA korreleret med Ekspression af rRNA og frekvens af en rRNA enkelt-nukleotid polymorfisme i Lung Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

ribosom RNA (rRNA) er en central regulator af cellevækst og kan styre udviklingen af ​​kræft. En cis-kodende rRNA (nc-rRNA) opstrøms fra

45S rRNA

transkriptionsstartsitet er for nylig blevet impliceret i kontrollen af ​​

rRNA

transskription i musefibroblaster. Vi undersøgte, om en lignende nc-rRNA kan udtrykkes i humane cancerceller epitelceller, og forbundet med nogen genomiske egenskaber.

Metode /vigtigste resultater

Brug kvantitativ rRNA måling vi vist, at en nc -rRNA transkriberes i humane lunge epiteliale og lungecancerceller, startende fra ca. -1000 nukleotider opstrøms for

rRNA

transkriptionsstartstedet (+1) og strækker sig i det mindste til +203. Denne nc-rRNA var signifikant mere rigelig i størstedelen af ​​lungekræft cellelinier, i forhold til en ikke-transformeret lunge epitelcellelinie. Dens overflod korreleret negativt med samlede 45s rRNA i 12 af 13 cellelinjer (P = 0,014). Under sekvensanalyse fra -388 til 306, observerede vi forskellige, hyppige intercopy enkelt nukleotid polymorfier (SNP) i

rRNA

, med en større hyppighed end forudsagt af chance på 12 lokaliteter. En SNP på +139 (U /C) i 5 ‘ledersekvensen varierede blandt cellelinierne og korreleret negativt med niveauet af nc-rRNA (P = 0,014). Modellering af den sekundære struktur af rRNA 5’-ledersekvensen indikerede en lille stigning i den strukturelle stabilitet på grund af 139 U /C SNP og en mindre forskydning i lokale konfiguration forekomster.

Konklusioner /Betydning

resultaterne viser forekomst af en følelse nc-rRNA i humane lunge epitel og kræftceller, og indebærer en rolle i reguleringen af ​​

rRNA

gen, som kan blive påvirket af en 139 SNP i fem ‘ledersekvens af det primære rRNA transkript

Henvisning:. Shiao YH, Lupascu ST, Gu YD, Kasprzak W, Hwang CJ, Fields JR, et al. (2009) En intergene Ikke-Coding rRNA korreleret med Angivelse af

rRNA

Hyppigheden af ​​en

rRNA

enkelt-nukleotid polymorfisme i Lung Cancer Cells. PLoS ONE 4 (10): e7505. doi: 10,1371 /journal.pone.0007505

Redaktør: Anita Brandstaetter, Innsbruck Medical University, Østrig

Modtaget: Juli 22, 2009; Accepteret: September 30, 2009; Udgivet: 19 Oktober 2009

Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Public Domain erklæring hvori det hedder, at når det først er i det offentlige rum, dette arbejde kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål

Finansiering:. Denne publikation er finansieret delvist med føderale midler fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, under kontrakt nr HHSN261200800001E. Denne forskning blev delvist understøttet af den Intramural Research Program for NIH, National Cancer Institute, Center for Cancer Research. Indholdet af denne publikation afspejler ikke nødvendigvis synspunkter eller politik Department of Health og Human Services, heller ikke nævner af firmanavne, kommercielle produkter, eller organisationer indebærer godkendelse af den amerikanske regering. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Syntese af ribosomer kræver en høj andel af cellulære ressourcer og er derfor stærkt regulerede. Biogenese af 45S ribosomale RNA (rRNA) er hastighedsbegrænsende for ribosom syntese og er tæt kontrolleret på flere niveauer. En stigning i ribosomer er et fælles træk ved aktivt prolifererende celler, herunder cancerceller, kan være inducerbar ved onkogen aktivering eller inaktivering af tumorsuppressorer, og kan endda være kræft-forårsagende [1], [2].

en ny type af rRNA regulator er for nylig blevet opdaget i musefibroblaster: en følelse ikke-kodende RNA (nc-rRNA) med oprindelse fra intergeniske spacerregionen mellem

rRNA

tandemgentaget genes.It viste sig at fungere som et negativ regulator af rRNA udtryk [3], [4]. Den mulige forekomst og betydning af dette nc-rRNA i humane celler, i celler af epitelial oprindelse, og i cancerceller er ikke undersøgt. Vi undersøgte, om dette nc-rRNA kan findes i humane lungeepitelceller og i humane lungecancerceller. Vi bemærkede også forekomsten af ​​enkelte nukleotid polymorfier (SNPs) i

rRNA

gen blandt cellelinjer, i sekvenserne opstrøms og nedstrøms for

rRNA

transskriptionsstartsitet, og studerede deres relationer til NC-rRNA niveauer og potentiel foldning af rRNA.

Resultater

Single nukleotid polymorfier i

rRNA

nær transkriptionsstartsitet

i mennesker, nogle 400

rRNA

gen kopier er arrangeret i sæt af tandem-gentagelser på 5 kromosomer [5]. Arrangementet af 18S, 5,8S og 28S

rRNA

gener er afbildet i fig. 1. Deres produkter forarbejdes fra en 45S forløber rRNA, som begynder med en 5′-ekstern transskriberet sekvens; de første 414 nucleotider af denne udgør en ledersekvens og er den første del, der skal fjernes [6]. Kernepromotoren ligger ved ca. -45 til +18 i forhold til transkriptionsstartsitet. Der er også regulatoriske enhancerelementer i de intergeniske afstandsstykker [anmeldt i 7] Salg

NTS: ikke-transkriberede spacer, også kendt som den intergeniske region;. ETS: ekstern transskriberede spacer; ITS: intern transkriberet spacer. rRNA transkription starter ved 5′-enden af ​​ETS, med de første 414 nukleotider omfattende ledersekvensen. Den ikke-kodende (nc) r-RNA transcript initieres opstrøms af ETS.

Seks humane lunge adenocarcinom cellelinjer og en ikke-transformeret udødeliggjort linje fra humant perifert lunge epitel blev undersøgt på det genomiske niveau. For hver cellelinie blev 35-65 kloner af amplificerede produkter for regionen -388 til 306 (i forhold til en transkriptionsstartstedet) opnået og sekventeret. I sammenligning med sekvenser for en

rRNA

fra kromosom 22 (GenBank AL592188), blandt de syv cellelinjer der var mindst én SNP på 329 af de 694 lokaliteter (47,4%). Detaljerede data er givet i supplerende tabel S1. Mindst én SNP blev fundet i 68% til 90% af klonerne fra de forskellige cellelinier (tabel 1). Procentdelene var ikke signifikant forskellige blandt linjerne. Blandt de SNP-positive kloner, det gennemsnitlige antal SNPs var 2,1 til 3.1, med ingen betydning forskelle mellem cellelinierne. Procentdelen af ​​kloner stratificeret efter antal SNPs heller ikke variere betydeligt på tværs af cellelinier (tabel 1).

Vi afgøres, om de enkelte steder var mere tilbøjelige til at præsentere en SNP end forventet ved en tilfældighed, for alle syv cellelinjer behandles sammen. Sandsynligheder opnået fra Poissonfordelingen viste, at forekomsten af ​​SNPs i 6 eller flere kloner på et givet sted var meget usandsynligt (P 0,0001) ved en tilfældighed. Der var 12 sådanne sites (total antal kloner i parentes): -234 (9), -233 (10), -181 (6), -104 (6), -96 (28), -72 (6), +52 (7), 139 (51), 144 (6), 207 (9), 225 (7), og 290 (6). Forekomster af disse hotspot SNP’er i cellelinierne er vist i tabel 1. Af disse flere er særligt bemærkelsesværdig. Tre forskellige SNP’er blev fundet på sted -233 (T /A, T /C, eller deletion, Supplerende tabel 1), med mindst en SNP i hver cellelinie. Linje A549 havde mærkbart flere SNPs på -96 (22 SNPs) og 139 (28 SNPs), sammenlignet med de andre cellelinjer (tabel 1). SNP +139 navnlig præsenteret høj frekvens i flere linjer.

Vi undersøgte statistisk om der var sekvens strækker hvor frekvensen af ​​SNP’er er større eller mindre end forudsagt ved en tilfældighed. Den kører test afslørede ingen sådanne strækninger til cellelinjer A549, H23, H1792, H2030, H2122, og HPL1D og for alle de strækninger, der betragtes sammen. Men for linje H441 behandles særskilt, fraværet af SNPs for regionerne -232 til -180, og -94 til -26, var ikke forventet tilfældigt alene (P = 0,0072). Adskillige cellelinier viste sig at udvise en høj frekvens af SNP’er i området -239 til -228. Hele regionen blev delt i to lag, et potentielt SNP hotspot stratum fra -239 til -228, og den supplerende lag består af de resterende arealer. Poisson regression (med en offset parameter svarende til det antal lokaliteter) blev anvendt til at sammenligne satserne for SNPs i disse to lag. Den SNP sats var 3,7 gange større i den potentielle SNP hotspot stratum end andre steder, P = 0,0010. De stiger var især fremtrædende for H1792, HPL1D, og ​​H23 linjer:. 3.9, 7.3, og 9.0 gange større henholdsvis (alle P values≤0.0002)

For de fleste cellelinjer var der flere tilfælde af mere end én klon der udgør den samme SNP (er), i de fleste tilfælde 2 eller 3 kloner. Det kan ikke afgøres med sikkerhed, hvis disse repræsenterer særskilte alleler eller flere polymerasekædereaktion (PCR) produkter fra samme allel. Der var 1 til 3 sådanne dublerede par i hver cellelinje, foruden syv kloner i A549 indeholder både -96 og +139 SNP’er (tabel 1). SNP -96 fandtes kun i kloner med 139 SNP i A549-celler. Derudover var der mange forekomster af kloner med en til tre identiske SNP’er, plus en til mange ekstra SNPs unikke for hver klon. Disse kloner naturligvis repræsenterer forskellige alleler. I hver celle linie der var 9 til 15 SNP sites der er involveret i sådanne kombinationer, med undtagelse af H441 celler, hvor eneste sted 139 blev fundet i syv sådanne variant kloner. Bortset fra sammenslutningen af ​​SNP -96 med SNP 139 i

rRNA

kloner fra A549 celler, flere forskellige SNPs synes at forekomme tilfældigt i kloner fra dette og de andre cellelinjer.

i betragtning af hyppigheden af ​​SNP 139 og forskellene mellem de cellelinier, undersøgte vi dens forekomst af en yderligere teknik. RNA blev isoleret fra de syv cellelinier anført i tabel 1, plus yderligere syv lungeadenocarcinom cellelinier (tabel 2). Sekvensen omkring position 139 blev amplificeret ved PCR efter revers transkription (RT) og frekvensen af ​​de to alleler bestemmes kvantitativt ved pyrosekventering. De ekstra fordele ved denne fremgangsmåde omfattede evaluering af udtryk af allelerne som rRNA, og vurdering af hele befolkningen af ​​molekyler, mens genomisk kloning undersøgt kun en stikprøve. Resultaterne (tabel 2) viste god overensstemmelse mellem de to metoder. Korrelationen mellem frekvensen af ​​det +139 SNP i genomisk

rRNA

(konstateres ved kloning) vs at i rRNA (bestemt ved RT-PCR og pyrosekventering) er signifikant (P = 0,0073), hvilket antyder, at begge alleller var lige udtrykkes. Hvor der var forskelle i frekvens, f.eks A549 celler, kan dette være et resultat af mindre nøjagtighed i forbindelse med vurdering af frekvensen ved kloning analysen.

En ikke-kodende RNA transskriberet fra

rRNA

opstrøms transskription starten websted

En nc-rRNA fra

rRNA

intergeniske spacer blev for nylig beskrevet for musefibroblaster [3], [4], men omfanget af den oprindelige udskrift blev ikke helt defineret. Anvendelse af primere for regionen -244 til +203 i forhold til den humane

rRNA

transkriptionsstartstedet vi demonstreret, at en NC-rRNA for denne region blev transskriberet af humane epitelceller også, herunder både de ikke-transformerede celler og HPL1D lung adenocarcinom A549-celler (fig. 2, region I). Den udskrift af nc-rRNA blev bekræftet ved sekventering. For at bestemme den opstrøms startstedet for denne nc-rRNA blev flere primere udnyttet, startende ved -1772. Sekventeringsreaktioner-bekræftet produkter blev opnået med primerne A-E (-1003 til -1), hvorimod primere F, G og H, der dækker mere opstrøms sekvenser, viste ingen produkter (fig. 2). Derfor transskription af nc-rRNA påbegyndt mellem -1225 og -1003.

Produkterne blev også bekræftet ved DNA-sekventering. Repræsentative resultater er vist for cellelinier HPL (immortaliserede ikke-transformerede celler fra humant perifert lunge epitel) og A549, en human lunge-adenocarcinom-cellelinje. Resultater for kontrol udelade RT-enzymet er vist i de nederste paneler. Positionerne amplificeret ved specifikke primere er vist i bunden af ​​figuren, med +1 er transkriptionsstartstedet for rRNA. NC-rRNA blev påvist mellem -1003 og 203, men ikke mellem -1772 og -1225.

Beløbene i denne nc-rRNA varierede i lungen cellelinjer, med ni adenocarcinom cellelinjer udstiller betydeligt mere end den ikke-transformeret linje HPL1D. En linje, A549, havde signifikant mindre nc-rRNA, og niveauet var ikke signifikant forskellig i tre linjer (figur 3A.)

* P. 0,05, ** P 0,01, signifikant forskellig fra ikke- transformerede HPL celler. For 45s rRNA, tilsyneladende stigninger var af borderline betydning for H2122 (p = 0,062) og for H441 (P = 0,0595).

Siden i musefibroblastceller

rRNA

intergenisk spacer ncRNA haft en negativ regulerende virkning på rRNA [3], [4], vi kvantificeret total rRNA med real-time PCR efter RT. I forhold til HPL1D, syv cancer linjer udtrykt signifikant mere rRNA, to betydeligt mindre, og fire var ikke signifikant forskellige (fig. 3B). For tolv af de tretten lunge cancer cellelinjer, var der en signifikant negativ rang korrelation mellem niveauer af ncRNA og total rRNA udskrift (fig. 4). Den outlier cellelinie, H23, havde de højeste niveauer af total rRNA. En foreløbig konklusion, for fremtidige udforskning, er, at nc-rRNA og rRNA funktionelt er forbundet i de fleste af disse lunge kræftceller. Analogt til deres forhold i musefibroblaster [3], [4], NC-rRNA kan være en negativ regulator af rRNA. I H23 outlier, kan andre faktorer har tilføjet betydning i rRNA regulering.

Når outlier linje H23 blev udeladt, Spearman rank korrelationskoefficient rho = -0,74, P = 0,0135 ved Spearman rank test.

site 139 SNP korreleret omvendt med nc-rRNA

Vi adspurgte næste hvorvidt SNP 139, der fandt sted i de fleste cellelinjer og varierede betydeligt blandt dem, havde et forhold til NC rRNA og total rRNA ekspression. Frekvensen af ​​T til C genomisk SNP ved position +139 i det oprindelige panel af seks cancercellelinjer haft en væsentlig negativ rang korrelation med nc-rRNA (fig. 5A). Denne forening blev undersøgt mere detaljeret ved anvendelse af hele panel af cellelinier og bestemmelse af SNP allel frekvenser i det udtrykte rRNA ved pyrosekventering (se tabel 2). Med rRNA data for alle cellelinjer, der var igen en signifikant negativ rang korrelation mellem SNP 139 frekvens og nc-rRNA-niveauer (fig. 5B).

A. Korrelation af det genomiske SNP bestemt ved kloning i 6 humane lungecancer-cellelinjer, A549, H441, H23, H1792, H2030 og H2122 (se tabel 2) (Spearman rank korrelationskoefficient, rho = -0,89, P = 0,0409, ved Spearman rank test). B. Korrelation af SNP som varianten

rRNA

udskrift i 13 cancer linjer (Spearman rank korrelation koefficient, rho = -0,71, P = 0,0137 ved Spearman rank test).

sekundær struktur modeller af rRNA arter

Stabil sekundær struktur er tidligere blevet rapporteret for 5′-ledersekvensen af ​​rRNA [8], [9]. Vi overvejede, om det +139 SNP kan ændre den sekundære struktur, og dermed den potentielle funktionalitet, af rRNA transkript eller den nc-rRNA. Vi modelleret co-transkriptionel foldning af ledersekvensen, 1-414, hjælp MPGAfold, herunder enten U eller C ved stedet 139. Der var 5 store stamceller strukturer, som vi har betegnet som vist i fig. 6. Denne overordnede struktur var stabil og bevares, hvilket giver den samme base-parring mønster i 70 til 100% af kørsler, som illustreret ved den blå eller magenta farvekodning i fig. 6. 139 Pladsen ligger i en lang stilk struktur, betegnes LL motiv, der består af sekvenser, herunder 46-152 (udvidelse så langt som 38-166 i nogle modellering udfald). Kendetegnene for LL motiv med U eller C ved stedet 139 er sammenlignet i tabel 3. SNP formular 139 var konsekvent, hvis lidt mere stabil, med en -2.7 kcal /mol fordel i både bedste fri energi og dominerende fri energi i LL folder. To almindelige lokale varianter af LL-motivet findes, et, hvori +139 stedet forekommer i en 5-nukleotid stamceller siden af ​​en bule, og en anden, hvor en uparret +140 U siden +139 loops ud (fig. 6), for en 3-loop-2 stammen konfiguration. Som MPGAfold befolkningstallet steget, hyppigheden af ​​de bedre pasform endelige strukturer, der indeholder 3-loop-2 stammen inden for LL motivet også steget, på bekostning af de mindre fit 5-basepar stammen (tabel 3). Denne tendens blev bemærket for både vildtype 139 U og SNP 139 C, men sidstnævnte bevarede en højere procentdel af 5-nukleotid konformation. De frie energier af begge konformationer af 139 C var lidt gunstigere end for de +139 U konformationer. Dette kan meget vel være relateret til parring af 139 C til G ved 63.

Stænglerne er farvekodede (skala vist) baseret på deres hyppighed i den endelige struktur blandt 20 kørsler på befolkningen niveau på 128 K. Uparrede baser er sort. Den grundlæggende struktur på venstre var højt konserverede og var som vist i alle undtagen 4/40 af de endelige forudsigelser. De punkterede kasser på rette viste alternative konformationer af LL-motivet omkring +139 stedet, som er forskellige for de 5 nukleotider på 60-64 og 138-142. For vildtype, 139 U (nederst stiplede boks), konformationen af ​​disse nukleotider involveret overvejende en 3-nukleotid stamme og en looped-out U på +140 (mørkeblå i diagrammet). Denne LL motiv variant blev fundet i 80% (16/20) af de endelige strukturer, med E = -246,1 kcal /mol i alle undtagen en af ​​disse. De LL motiv strukturer med de 5 nukleotider i orange, alle som en del af stammen, var i mindretal, 20% (4/20) af alle løsninger (se tabel 3). Den fulde struktur illustreret var identisk for alle undtagen en af ​​disse, med E = -245,9 kcal /mol. Derimod for SNP 139 C (top stiplede boks) de to konformationer blev præsenteret i tilsvarende omfang, 45% som 3′-nukleotid stamceller (grøn), E = -248,8 kcal /mol, og 55% som 5- nukleotid stamceller (lyseblå), E = -248,4 kcal /mol.

Vi modelleret også co-transkriptionel foldning af andre længder af 5′-ledersekvensen (ikke vist). Blandt disse var 1-173 længde, til at omfatte nucleolin bindingssted, den første kendte site for specifikke protein interaktion i 5′-leder. Sekvensen 1-700 blev undersøgt med henblik på at omfatte et område nedstrøms for 414 kendt for at påvirke leder spaltning [6] og med en U3 bindingssted [10]. Den SNP på 139 ikke signifikant indflydelse på foldning af disse sektioner af rRNA. Endelig brugte vi et andet program, Mfold, at undersøge de grove strukturelle karakteristika store 5′-ekstern transskriberede spacer (1-3655) og observeret stærk bevarelse af LL motiv og ingen langdistance-interaktioner med de nukleotider uden for LL underdomæne følge af nærvær eller fravær af 139 SNP (ikke vist). Mfold resultater viste også potentiale for dannelsen af ​​de samme LL motiv varianter illustreret i fig. 6 af vildtype og de +139 SNP sekvenser.

Derudover undersøgte vi nc-rRNA, der strækker sig fra ca. -1000 til mindst + 300.Its præcise omfang fra transkriptionsstartstedet nedstrøms kunne ikke bestemmes på grund af overlap med den almindelige rRNA udskrift. I alle MPGAfold kører modellering af nc-rRNA -1.000-414 blev LL motivet bevares og var ikke involveret i interaktion med sekvenser opstrøms for transkriptionsstartsitet (ikke vist).

Diskussion

Vi rapporterer her, at humane epitelceller, herunder lungekræft celler, ligesom musefibroblaster, udtrykker en ikke-kodende RNA fra intergeniske region af

rRNA

gen, og at en negativ regulerende rolle er muligvis underforstået , da der var en negativ korrelation mellem niveauer af nc-rRNA og total rRNA i de fleste af de humane lunge adenocarcinom cellelinier undersøgt.

Yderligere observerede vi en interessant forhold mellem en nc-rRNA SNP og nc -rRNA niveauer. Sekvenserne for de flere kopier af

rRNA

gener er konserveret blandt individer af en art og inden for individer, et fænomen spekuleret at repræsentere samordnet udvikling drevet af flere mekanismer, herunder intrakromosomal rekombination og interchromosomal gen konvertering [5], [ ,,,0],11]. Nogle variationer er blevet bemærket, især i evolutionært mindre konserverede regioner og i 28S komponent af genet [12], [13]. Disse ændringer meste involveret gevinst eller tab af gentagne segmenter, selvom enkelte nukleotid forskelle også er blevet bemærket [14] – [16]. Ingen funktionelle betydning er endnu ikke tildelt disse forskelle i nukleare

rRNA

. Men flere moderen-nedarvede punktmutationer i mitokondrie

rRNA

prædisponerer børn til ototoksicitet af antibiotiske aminoglycosider ved en ufuldstændigt forstået mekanisme, der involverer mitochondriemembranpermeabilitet og apoptose [17] – [19].

i vores undersøgelse blev nc-rRNA fundet at strække sig ind i 5’ETS leder region, forbi stedet +139, og forskelle i hyppigheden af ​​+139 C blandt cellelinierne korrelerede negativt med niveauer af nc-rRNA. På grundlag af disse observationer, vi postulerer, at 139 C SNP har en negativ regulerende virkning på enten transskription satsen for nc-rRNA, eller på stabilitet, og at ncRNA gengæld negativt regulerer rRNA.

I musefibroblastceller undersøgt af Mayer et al. [3], [4], ncRNA udtrykt fra intergeniske region af

rRNA

genet forårsagede et fald i rRNA transkription som følge af interaktion med nucleolar remodeling kompleks og ændret DNA og histon methylering. Konkret blev sekvensen -127 til -39 impliceret [4]. Sekvenser nedstrøms for transkriptionsstartstedet blev ikke undersøgt; hvorvidt disse kan operere med en tilsvarende mekanisme vil kræve yderligere undersøgelse. Ikke-kodende RNA er blevet impliceret i kontrollen af ​​genekspression ved en række forskellige mekanismer [revideret i 20] – [22]. I mindst to tilfælde er det blevet rapporteret, at lovgivningsmæssige lange ikke-kodende RNA, initieret opstrøms, strækker sig hen transkriptionsinitieringsstedet, som observeret i vores resultater. Disse lange nc-RNA’er indeholdt en interfererende transkript fungerer som en negativ repressor af det humane dihydrofolatreduktase-gen [23], og en trans-promotor transkript aktivering af fructose-1,6-bisphosphatase gen i fission gær [24].

Der har været en publikation peger på en funktionel forskel blandt SNPs i human

rRNA

[25]. I humane HaCaT keratinocytter i kultur, blev SNP’er lokaliseret i regionen omkring transkriptionsstartsitet for

rRNA

. I chromatin immunopræcipitationsanalyser, frekvenser af SNPs var signifikant forskellige i

rRNA

genregioner immunpræcipiteret med Upstream Binding Factor (UBF) eller med Poli vs at kombineret med transskription faktor basonuclin. I regionen -101 til -52, samlet SNP frekvens var ret lav i

rRNA

gen forbundet med UBF eller Poll og signifikant højere i basonuclin-associerede

rRNA

. Denne region omfatter -96 SNP i vores undersøgelse, som fandt sted i en høj procentdel af A549 kloner. Manglende SNP’er i UBF-associerede sekvens er bemærkelsesværdigt i betragtning af den promiskuitet af binding af UBF hele

rRNA

genet og dets regulatoriske regioner [26]. Det kunne være af interesse at bestemme, om øget basonuclin /UBF bindende forholdet forekommer i A549-cellelinjen. Basonuclin udtrykkes i epitel samt kønsceller [27] og er stærkt forøget i basalcellekræft i huden [28].

Yderligere bevis for funktionelle forskelle mellem

rRNA

genvarianter kommer fra en undersøgelse i mus [29]. Syv varianter blev identificeret på basis af restriktionsfragment-polymorfier og omfattede to SNP’er i promotorregionen. Variant SNP’er i 5′-ETS blev anvendt til at undersøge ekspression i specifikke voksne musevæv ved kvantitativ PCR. Tre varianter blev universelt udtrykte (herunder en på forskellige niveauer væv til væv), to blev ikke påvist i nogen væv, og to blev fundet kun i visse væv. Disse resultater var i overensstemmelse med tidligere cytologiske analyser af sølv farvning af nucleolar-organisering områder til forskellige kromosomer i humane celler: fibroblaster og leukocytter varieret med hensyn til hvilken kromosom klynger af

rRNA

gener var mest aktive [30], og der var forskelle mellem klynger i reaktion på den stimulerende virkning af serum [31].

nc-rRNA, udtrykt fra intergeniske region i museceller og interagere med nucleolar remodeling kompleks, er for nylig blevet betegnet pRNA ( promotor-RNA), og blev forudsagt ved computermodellering at have en stabil sekundær hårnålestruktur, som var sammenlignelig sekvens fra det humane

rRNA

promotor [4]. Når Mayer et al. [4] muterede tandem GC par i pRNA (ved basepar svarende til websteder -59 til -61 og -118 til -120 i den primære sekvens bruges af os), de observerede en stor effekt på sekundære struktur, eliminering af en stilk -løkke konfiguration, og ophævelsen af ​​specifik binding til TIP5 protein i nucleolar remodeling kompleks. Vi kontrolleres, om en tilsvarende ændring i sekundær struktur kan ledsage 139 SNP. Computer modellering af rRNA strukturer viste, at stedet 139 er lokaliseret i en stabil, energisk begunstiget stængel struktur vi betegnes LL motiv. Co-transkriptionel modellering viste, at 139 U til C SNP havde en relativt lille, men muligvis signifikant effekt på den lokale struktur, med C-substitution giver større stabilitet (samlet lavere fri energi) og øget hyppighed af en 5-nt stilk i stedet for en 3-nt stamceller. Hvorvidt dette konformationel forskel kan påvirke funktionelle vekselvirkninger mellem LL motivet vil kræve yderligere undersøgelse

En anden mulig forklaring på de specielle effekter af hjemmesiden 139 SNP kan findes i DNA sammenhæng:. Dette site er placeret i en bevaret kerne steroid respons element, TGTTCT, for klasse i hormonreceptorer, herunder for glukokortikoider, androgener, mineralkortikoider, og progesteron. Ændring af T til C ved stedet 139, den tredje position i dette element, vil sandsynligvis fjerne hormon receptor binding: udskiftning af denne T med A afskaffet svar på alle klasse I hormonreceptorer [32]. Også muligvis relevant er tilstedeværelsen lige nedstrøms for 139, på 159-167, af en bindende element for nucleolin, en stor vækst lovgivningsmæssige, RNA-bindende protein [33], [34].

I Ud over de 139 T /C SNP, opdagede vi 11 andre steder, hvor SNPs blev fundet hyppigere end forventet ved en tilfældighed. Ingen af ​​disse forekom ofte nok for korrelationer med cellulære egenskaber, der skal forsøges. Disse SNPs kan have funktionelle betydning, eller kan bare være på steder, der er særligt tolerante over for ændret sekvens. Sekvenser i regionen af ​​det humane

rRNA

gen, som regulerer transkription omfatter den væsentlige kernepromotoren, ca -45 til +18, som er afgørende for transkription, og en opstrøms styreelement starter ved ca. -200, herunder kritisk T

o element på -165 til -175 [35], [36]. Nr SNP’er forekom i nogen af ​​vores lung cellelinier fra -13 til -4; ændringer i denne region kan ikke funktionelt tolereres. Vi bemærkede SNP hotspots i opstrøms kontrolelement på -181, -104, -96, og -72. Hotspot -104 er en del af et bindingssted, TCGCGC, for medlemmerne af E2F transskription faktor familie. Komplekse virkninger på

rRNA

transskription, både positiv og negativ, er blevet tilskrevet E2F1, E2F4 og E2F6, når undersøgt i transfekterede humane lunge adenocarcinom H358 celler [37], [38]. Det er muligt, at erstatning af -104 T med C reducerer undertrykkende virkninger eller forstærker induktionen virkning af et eller flere E2F-familiemedlemmer.

polymorfier ved -96, al substituere et T til et C, slået et CpG site, hvor methylering kunne forekomme. Ændringerne ved -72, alle substituere et C i en T, skabt et CpG site. I en nylig undersøgelse med humane HeLa cancerceller, 27 CpG steder i opstrøms kontrol element og kerne promotor af

rRNA

var generelt meget methylerede, men i DNA immunudfældet med antistof til Poll disse steder havde reduceret eller fraværende methylering [39]. Dette omfattede websted -96 og en på -75. Eventuelt tab af -96 CpG kunne øge konstitutiv binding af Poll. Dette vil være af særlig betydning i A549-celler, hvor næsten halvdelen af ​​klonerne viste denne ændring. En sammenlignende undersøgelse af humane leverkræft vs normal matchende lever, findes i kræftformer, betydelig hypometylering af alle de

rRNA

opstrøms CpG sites mellem 137 og -59, herunder -96 [40]. Også i en DNase-fodaftryk assay websted -96 var placeret mellem to regioner beskyttet af UBF, og viste forstærket DNA-spaltning [41].

Det er også blevet bemærket, at humane og murine eksterne og interne transskriberede spacere har en højere procentdel af AA og GA-dinukleotider, og en lavere procentdel af AT, CA, og TA dinukleotider, end forventet tilfældigt [8]. Disse kan have særlige roller og kan forventes at være bevaret. Fem af de hotspot SNPs i vores undersøgelse resulterede i gevinst eller tab af et af disse fem dinukleotid par. Af særlig mulige betydning er de syv A /G SNPs på 52, som konverterer en GA og en AT til neutral GG og GT; og de ni G /A SNPs på 207, alle i cellelinie H23, hvilket resulterer i skabelsen af ​​en GA dinukleotid.

Sammenfattende en nc-rRNA, der omfatter de

rRNA

gen transkriptionsstartstedet, blev udtrykt i humane lunge adenokarcinomceller og var negativt korreleret med hyppigheden af ​​en T /C SNP på sted +139 i ledersekvensen af ​​5′-ETS. For de fleste cellelinjer, blev nc-rRNA også negativt korreleret med de samlede 45s rRNA. For nylig kemikalier rettet transkriptionsfaktorer for

rRNA

har vist sig lovende til behandling af kræft [42], [43]. Endvidere muligt reduceret ekspression af rRNA i hjernen, som følge af hypermethylering, blev forbundet med risiko for selvmord [44]. Senest er det blevet foreslået, at øget rRNA grund trisomi af kromosom 21 bidrager til Downs syndrom [45]. Således variabilitet i rRNA har relevans for flere sundhedsmæssige problemer. Den funktionelle betydning af SNP 139 kræver yderligere undersøgelse. Det havde en lokal virkning på den forudsagte fordeling af sekundære strukturer, kan ændre binding af glucocorticoidreceptorer, og kunne interagere med en nærliggende nucleolins bindingssted. Alle statistiske tests var to-sidet.