PLoS ONE: TBK1 kinase Addiction i Lung Cancer Cells medieres via Autophagy af Tax1bp1 /Ndp52 og ikke-kanoniske NF-KB Signalling

Abstrakt

K-Ras afhængige ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) celler er »afhængige« til basal autofagi der omprogrammerer cellulære metabolisme i en lysosomal-følsom måde. Her demonstrerer vi, at xenophagy-associerede kinase TBK1 driver basal autophagy, i overensstemmelse med dets kendte krav i NSCLC spredning K-Ras-afhængige. Desuden er basal autophagy i denne sammenhæng karakteriseret ved beslaglæggelse af xenophagy last receptor Ndp52 og dens paralog Tax1bp1, som vi demonstrerer her for at være en

bona fide

last receptor. Autophagy af disse last receptorer fremmer ikke-kanoniske NF-KB-signalering. Vi foreslår, at dette TBK1-afhængig mekanisme for NF-KB-signalering bidrager til autophagy afhængighed i K-Ras drevet NSCLC

Henvisning:. Newman AC, Scholefield CL, Kemp AJ, Newman M, McIver EG, Kamal A, et al. (2012) TBK1 kinase Addiction i Lung Cancer Cells medieres via Autophagy af Tax1bp1 /Ndp52 og ikke-Canonical NF-KB Signalering. PLoS ONE 7 (11): e50672. doi: 10,1371 /journal.pone.0050672

Redaktør: Edward Harhaj, Johns Hopkins School of Medicine, USA

Modtaget: 26 juli, 2012; Accepteret: 23. oktober 2012; Udgivet: November 29, 2012 |

Copyright: © 2012 Newman et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet i SW laboratorium blev finansieret af en Cancer Research UK Karriereudvikling Fellowship (C20685 /A12825) indehaves af SW. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Ahmad Kamal, Ed McIver og Michelle Newman er medarbejdere i Medical Research Council Technology, Lynton House, 7-12 Tavistock Square, London WC1H 9LT, UK. Medical Research Council Teknologi ejer en patentansøgning (PCT ingen WO2010100431) på TBK1 hæmmere inklusive MRT68601. Disse forfattere kan derfor modtage økonomiske fordele fra enhver fremtidig udnyttelse af dette patent. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

En strategi til at målrette tumor progression er at identificere specifikke molekylære sårbarheder knyttet til genetiske baggrund. Aktivering af K-Ras ved mutation, eller andre midler, gør ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) celler ‘afhængige’ af tilstedeværelsen af ​​TBK1 (tank-bindende kinase 1) protein for fortsat proliferation og /eller overlevelse [1], eventuelt via direkte stimulering af TBK1 aktivitet [2]. TBK1 og dets paralog, IKKε, ved siden af ​​de velkarakteriserede IKKα og IKKβ proteiner, udgør en underfamilie af serin-threonin proteinkinaser [3]. TBK1 og IKKε blev oprindeligt beskrevet som medierende NF-KB transskriptionsfaktoraktivering [4], [5], [6]. Det er også blevet foreslået, at konstitutiv fremme af NF-KB signalering i NSCLC-celler, nedstrøms for K-Ras kunne ligge til grund TBK1 »afhængighed« [1]. Faktisk har genekspressionsprofilering vist, at en K-Ras drevet, NF-KB-lignende signatur afhænger af TBK1 genet [1]. Imidlertid har mekanistisk evidens for TBK1-medieret NF-KB-engagement i kræft været sparsom. er blevet foreslået alternative forklaringer på TBK1 afhængighed, såsom direkte aktivering af pro-overlevelse Akt kinase signalering [7], [8]. Men ingen individuel bidrag TBK1 nødvendigvis gensidigt udelukkende med andre.

En anden vej engageret neden for K-Ras aktivering macroautophagy (herefter autofagi) [9], [10], [11]. Autophagy er en flertrins lysosomal nedbrydning proces [12]. I de tidlige stadier, afhængig af virkningen af ​​centrale autofagi gener såsom

ATG5

ULK1

, dobbelt membraned vesikler dekoreret med ubiquitin-lignende proteiner af LC3 /GABARAP familie, kaldet autophagosomes, begynder at dannes. Disse spirende autophagosomes vedlægge rundt, og Sequester, cytosol som de modnes. Afhængig sammenhæng kan dette være en ikke-selektiv eller selektiv proces, hvor sidstnævnte involverer binding af adskilte populationer, eller “ladninger«, i organeller, proteiner eller andre strukturer, såsom bakterier i tilfælde af “xenophagy«. Selektivitet medieres via cargo-receptorer, der linker LC3 /GABARAP proteiner til lasten, i formodede multi-molekylære komplekser [12]. Autophagy virkninger på celle skæbne ved både denne selektive binding af fragt komplekser fra cytosolen og via efterfølgende lysosomal nedbrydning af indholdet af autophagosome, der frigiver metabolitter i cytosolen. Dette sidstnævnte trin er inhiberet af lysosomotrope lægemidler såsom chloroquin. Sådanne forbindelser er en potentiel klasse af midler til terapeutisk manipulation af autofagi [11], [13].

rolle autofagi i akut reaktion på Ras mutation er uklar. Det er blevet påvist at fungere som en effektor af overlevelse, celledød eller senescens [9], [14], [15]. Imidlertid er kontinuerlig basal autophagy entydigt kræves til spredning og /eller overlevelse af etablerede K-Ras drevet cancerceller [10], [11], [13]. En rolle autophagy her er direkte regulering af cellulære stofskifte via mitokondrie homøostase, protein kvalitetskontrol og /eller ombygning af den cellulære metabolit pool. Kumulativt, disse mekanismer regulere balancen mellem oxidativ phosphorylering og aerob glykolyse [10], [11], [13]. Nogle af disse mekanismer er afhængige af lysosomal nedbrydning, som vist ved følsomhed af metaboliske virkninger på lysosomotrope midler, såsom chloroquin. Det er imidlertid ikke blevet behandlet, hvordan autofagi er engageret nedstrøms K-Ras. Desuden er det ikke klart, om autofagi ‘afhængighed’ kan forklares alene ved direkte metaboliske virkninger eller hvis binding af specifikke proteiner modulerer celle skæbne, via ændring af signaltransduktion i cellen.

Interessant TBK1 har været impliceret i autophagy af cytosolisk

Salmonella spp.

bakterier fra inden celler [16]. Den hidtil ukendte TBK1-bindende protein og xenophagy fragt receptor, Ndp52, genkender ubiquitinerede proteiner, på overfladen af ​​bakterier og kulhydrat-bindende proteiner på bristede vært vesikler [17], [18]. En ikke-redundant trin i denne vej er for nylig blevet påvist at være TBK1-medieret phosphorylering af en yderligere hidtil ukendt last receptor, Optineurin [16]. Relevansen af ​​TBK1 signalering uden for xenophagy er uklar. Men vi viser her, at basal autophagy, med nogle paralleller til xenophagy og resulterer i omsætningen på fragt receptorer, såsom Ndp52 og paraloge protein Tax1bp1 er konstitutivt engageret i TBK1-afhængige NSCLC celler ved kinase aktivitet TBK1. Vi demonstrerer en central rolle for denne autofagi i kørsel ikke-kanoniske NF-KB-signalering medieret via RelB transskription faktor. Vi foreslår, at denne vej supplerer direkte metaboliske mekanismer i bidrag basal autophagy at støtte proliferation og /eller overlevelse i NSCLC celler. Vores resultater udvider dermed rolle autophagy afhængighed i K-Ras drevet kræft og vise mekanistisk samspil med TBK1-NF-KB-vejen.

Resultater

autofagi i K-Ras Afhængige Lung Cancer Cells er Nedstrøms TBK1 kinase

for at undersøge den rolle, TBK1 i K-Ras drevet basal autophagy vi udviklet en NSCLC kultur model i K-Ras ‘afhængige’ A549 celler [1]. Vi fandt, at cytosolen af ​​disse indeholdt rigelige punktformig strukturer, der er mærket med GFP-LC3B fusionsproteinet, men ikke med lipid-unconjugatable GFP-LC3BΔG- A (. Figur 1a). Den overflod af GFP-LC3B puncta blev dramatisk forhøjet ved chloroquin behandling (fig. 1a). Ifølge metoden af ​​feltet [19], så tog vi disse LC3B puncta at repræsentere en basal, steady-state niveau af autophagosomes. Disse autophagosomes var fraværende, da RNAi blev brugt til at knockdown den autofagi gener

ATG5

ULK1

(fig. 1b-d). RNAi af

TBK1

producerede lignende virkninger, positionering denne kinase opstrøms af basal autophagosome overflod (fig. 1b-d). Vi udvidede disse resultater ved hjælp autofagi flux assays i kombination med et medlem af en nyligt beskrevet familie af enzymatiske inhibitorer af TBK1 (MRT68601, i det følgende benævnt TBKi, fig. S1) [20]. Inhibitor behandling af A549 tandem-fluorescerende LC3B celler [21] resulterede i reduktion af både tidlige autophagic ( “grøn + rød) LC3B puncta og sure sene autophagosomes (» røde «puncta) (fig. 1e, f). Tilsvarende blev chloroquin-medieret akkumulering af lipideret LC3B-II eller GABARAP-II, i form af disse proteiner korrelerede med dannelsen af ​​autophagosomes, forhindres ved inhibitor behandling (fig. 1 g). Tilsammen viser disse data, at TBK1 kinase faktisk fremmer autofagi, der handler på den tidlige trin af autophagosome dannelse, snarere end at undertrykke autophagosome modning i det lysosomale sure rum [19].

A549 GFP-LC3B eller GFP-LC3BΔG – A-celler blev behandlet med PBS eller 5 uM chloroquin (CQ) i 8 timer, og celler afbildes for GFP. b, c) A549 GFP-LC3B celler blev transficeret med indikeret siRNA i 72 timer (

NTC

= ikke-targeting kontrol) og b) celleekstrakter blottet for angivne proteiner (α-tub = α-tubulin) eller celler blev c) afbildes for GFP-LC3B puncta. d) A549 FLAG-HA-LC3B celler blev transficeret med angivet siRNA og HA-positive puncta immunfarvet, afbildet og talt efter 72 h (n = 3, ± S.E.M., * = p 0,05, ** = p 0,01). e, f) A549 tandem-fluorescerende-LC3B (tfLC3B) -celler blev behandlet med DMSO eller 1 uM MRT68601 (TBKi) i 24 timer og e) afbildes og f) kvantificeres for total antal autophagic puncta (grøn + rød) og undersættet af disse puncta med udetekterbar GFP signal (rød), som beskrevet detaljeret i Materialer og Metoder. g) A549-celler blev behandlet med DMSO eller 10 uM MRT68601 (TBKi) i 24 timer i nærvær eller fravær af PBS eller 5 uM (CQ) chloroquin og celleekstrakter blottet for angivne proteiner. Scale barer = 50 um i alle paneler.

Basal Autophagy Mål Cargo receptorer Ndp52 og Tax1bp1

Bakteriel autofagi (xenophagy) medieres via TBK1 og dens bindende parter, xenophagy lasten receptorer Ndp52 og Optineurin [16], [18]. I en parallel til dette, fandt vi rekruttering af Ndp52, og Ndp52 paralog Tax1bp1, til basale autophagosomes i A549-celler (fig. 2a, c). Vi viste også en konstitutiv Ndp52-TBK1 kompleks og bekræftet en tidligere rapport, at Tax1bp1 kunne binde TBK1 [22] (Fig. S2a, b). Disse data indebærer, at Ndp52 og Tax1bp1 kan blive målrettet til binding af basal autofagi. Følgelig stabiliseret Tax1bp1 ligner en positiv kontrol chloroquin behandling, p62 fragt receptoren (fig. 2b), og samtidig med øget Tax1bp1 lokalisering til LC3B-positive vesikler (fig. 2c). Ubiquitin-lignende proteiner af LC3 og GABARAP underfamilier kan binde Tax1bp1, med varierende affiniteter (fig. 2D). Dette antyder, at Tax1bp1 er, ligesom, Ndp52, en

bona fide

last receptorprotein. Yderligere støtte til dette fund kommer fra den iagttagelse, at sletning af formodede LC3 /GABARAP familie bindende motiver i Tax1bp1 ablaterer lokalisering til autophagosomes (fig. 2e). Disse motiver omfatter både en “kanoniske” LIR (LC3-interagerende region) motiv (W49, V50, G51, i52) og en »ikke-kanoniske LIR ‘motiv, sidstnævnte udledes af denne nyligt beskrevet for Ndp52 binding til LC3C (L141, V142, V143) [23] (fig. 2e, også se opstillinger i fig. S2C). I overensstemmelse med den rolle, TBK1 i de ovennævnte processer, blev TBK1 protein også vist at lokalisere til basale autophagosomes (Fig. 2f).

A549 GFP-LC3B celler blev farvet for Ndp52 og afbildet. b, c) A549-celler blev behandlet med PBS eller 5 uM chloroquin (CQ) natten over og b) celleekstrakter blottet for angivne proteiner (α-tub = alfa tubulin) eller c) celler co-farvet for Tax1bp1 og LC3B, og afbildes af konfokal mikroskopi. d) 293FT celler blev transficeret med myc-TAX1BP1 ekspressionsvektor, eller tom vektor kontrol, og lysater underkastes pull-down med angivne fusionsprotein, som beskrevet i Materialer og metoder (- = GST alene, B = GST-LC3B, C = GST-LC3C, G = GST-GABARAP). e) A549 FLAG-HA-TAX1BP1 cellelinjer der stabilt udtrykker de angivne varianter af Tax1bp1 protein (se tekst) blev behandlet med 5 pM chloroquin natten over og farvet for HA puncta. f) A549 GFP-TBK1 mCherry-LC3C celler blev afbildet (pilene angiver colocalisation). Scale barer = 25 um i alle paneler.

TBK1 Drives Ikke-kanonisk NF-KB Signalering ved Autophagic beslaglæggelse af Ndp52 og Tax1bp1

Vi næste hypotese en sammenhæng mellem TBK1 drevet autofagi og basal NF-KB-signalering. Kernelokalisering af kanoniske NF-KB pathway underenheder c-Rel eller RelA var ikke påviselig i A549-cellelinien (p53 vildtype), men basal kernelokalisering af den ikke-kanoniske pathway subunit RelB kunne påvises (fig. S3). RelB kernelokalisering var afhængig TBK1 kinaseaktivitet som vist ved tabet af nukleare RelB farvning (fig. 3a, b) eller tab af ophold i den nukleare fraktion (fig. 3c) ved behandling med TBK1 inhibitor. Tax1bp1 er tidligere blevet påvist at inhibere kanoniske NF-KB-signalering ved kernedannelse af en ubiquitin redigering kompleks for kanoniske NF-KB regulatorer TRAF6 og RIP1 [24]. Imidlertid har modstridende rapporter påvist en NF-KB potenserende virkning, omend nedstrøms for dysregulering af Tax1bp1 funktion ved den virale onkoprotein Tax [25]. Vi fandt, at RNAi af

ATG5

,

ULK1

,

TBK1, TAX1BP1

eller

NDP52

hæmmede RelB nukleare lokalisering (Fig. 3d-f), antyde, at en nedstrøms konsekvens af Tax1bp1 og Ndp52 binding af autofagi er engagement af ikke-kanoniske NF-KB. Behandling med autofagi inhiberende forbindelse 3-MA (3-methyl adenin) også ablateres RelB kernelokalisering, yderligere underbygger disse fund (fig. 3g). Det er ikke klart, om autophagic nedbrydning af gods i lysosomer, eller blot autophagic beslaglæggelse af gods, er nødvendig for RelB signalering. Mens E64D /Pepstatin En behandling ikke havde nogen hæmmende effekt på RelB nukleare lokalisering, blev en lille, men signifikant effekt set med høje doser af chloroquin og en markant hæmmende virkning blev set med bafilomycin A1 (fig. S4). For at bekræfte den iagttagelse, at autofagi fremmer RelB aktivitet, vurderede vi ændringer i gentranskription. Analyser af potentielle RelB målgener viste, at

BIRC3

mRNA niveauer blev håndfast nedreguleret ved RelB hæmning (fig. 3 h, i). Vigtigere er det, RNAi af

ATG5

,

ULK1

,

TAX1BP1

og

TBK1

tilsvarende nedreguleret

BIRC3

mRNA (fig. 3j) .

A549-celler blev behandlet natten over med DMSO eller 10 uM MRT68601 (TBKi) og a) farvet for RelB (skala bar = 50 um), kernelokalisering kvantificeret i b) (n = 3, ± SEM, * * = p 0,01) eller c) kerneekstrakter fremstillet og blottet for angivne proteiner. d-f) A549-celler blev transficeret med indikeret siRNA (

NTC

= ikke-targeting kontrol) i 72 timer og e) celleekstrakter blottet for angivne proteiner eller d, f) cellerne blev farvet og kvantificeret for nuklear RelB (n = 3, ± SEM, * = p 0,05). g) A549-celler blev behandlet med PBS eller 10 mM 3-methyladenin (3-MA) ​​i 24 timer og derefter farvet og kvantificeret for nuklear RelB (n = 3, ± S.E.M., *** = p 0,005). h, i) A549 celler blev inficeret med angivne lentivirus og ved 72 timer efter infektion, h) celleekstrakter slettet for angivne proteiner eller i) total RNA kvantificeres for

BIRC3

mRNA (n = 3; ± SD) . j) A549-celler blev transficeret med indikeret siRNA i 72 timer og totalt RNA ekstrakter blev underkastet QRT-PCR for

BIRC3

mRNA (n = 3; ± S.D.). k) A549 celler blev inficeret med angivne lentivirus og ved 120 timer efter infektion celle nummer talt som beskrevet i Materialer og metoder (n = 3, ± SEM, * = p. 0,05)

RelB Activity bidrager til TBK1 og Autophagy ‘Addiction’

Vi bekræftede tidligere bemærkninger [1], [11], at kronisk lyddæmpning af

ATG5

eller

TBK1

ved lentiviral shRNA målretning, førte til et fald i celleantal i A549-celler, som gjorde RNAi af

KRAS

(fig. S5a-f). Vigtigere,

lentiviral RNAi af

RELB også ført til markant reduktion i celle nummer (fig. 3k). Dette tyder TBK1- og autofagi-medieret regulering af RelB kan i det mindste delvis, ligger til grund TBK1- og autofagi-afhængighed.

Autophagy og Ndp52 /Tax1bp1-medieret RelB Signalering kan være uafhængig af Optineurin og Tax1bp1 ikke fremme canonical NF-KB signalering

i A549 celler, den anden autophagy fragt receptor tidligere impliceret i TBK1 funktion, Optineurin [16], synes at have begrænset deltagelse i RelB signalering. Der er kun en lille, om end signifikant reduktion i RelB nukleare lokalisering ved

OPTN

RNAi (Fig. 4a, b). Men disse fund ikke udelukke en rolle for Optineurin i forskellige genetiske baggrunde eller under stress betingelser, og disse muligheder skal behandles i det fremtidige arbejde. I A549 celler, rolle Tax1bp1 at fremme NF-KB-signalering er også specifik for romanen autofagi-RelB pathway beskrevet heri. Stimulering af kanoniske NF-KB-signalering ved TNFa behandling, som vurderet ved nuklear lokalisering af RelA, ikke forstyrres af

TAX1BP1

RNAi, mindst så vidt ingen reduktion af TNFa-induceret nuklear translokation observeres (fig. 4c , d). ser således den stimulerende rolle Tax1bp1 på NF- KB at være specifikt for ikke-kanoniske RelB signalering. Det er dog vigtigt at bemærke, at denne analyse ikke behandler allerede godt beskrevne hæmmende rolle Tax1bp1 om varigheden og omfanget af kanoniske NF- KB-signalering [24].

A549 celler blev transficeret med angivne siRNA (

NTC

= ikke-targeting kontrol) i 72 timer og a) celleekstrakter blottet for angivne proteiner eller b) celler farvet og kvantificeret for nuklear RelB (n = 3, ± SEM, * = p 0,05) . c, d) A549-celler blev transficeret med indikeret siRNA (

NTC

= ikke-targeting kontrol) og stimuleret med 5 ng /ml TNF-α i 3 timer og c), farves og d) kvantificeres for nuklear RelA ( n = 3, ± SEM). Scale bar = 25 um.

RelB Aktivering af Autophagy og Ndp52 /Tax1bp1 ses også i p53-muterede, K-Ras-afhængige NSCLC Celler

Det er blevet foreslået, at der i p53-muterede NSCLC linjer, såsom NCI-H23, basal kanoniske NF-KB-signalering er meget højere end i p53 vildtype linjer, såsom A549. Men i det mindste i NCI-H23, vi stadig finde konstitutiv indgreb af RelB signalering, afhængig af basal autophagy funktion, hvilket antyder, at basal ikke-kanoniske og kanoniske NF-KB-signalering kan være sammenfaldende (fig. 5a-e). Konkret fandt vi, at NCI-H23-celler havde konstitutiv autofagi, som vurderet med tandem-fluorescerende LC3 markørprotein, der blev nedreguleret ved

TBK1

RNAi (Fig. 5a-c), og at væsentlig nuklear lokalisering af RelB i denne cellelinie var følsom over for RNAi-medieret hæmning af

TBK1

,

ATG5

,

NDP52

eller

TAX1BP1

(fig. 5d, e) .

NCI-H23 celler blev transficeret med indikeret siRNA (NTC = ikke-targeting kontrol) i 72 timer og a) celleekstrakter blottet for angivne proteiner. b, c) NCI-H23-tandem-fluorescerende LC3B celler blev transficeret med angivet siRNA og analyseret som beskrevet i Materialer og Metoder. D, E) NCI-H23 celler blev transficeret med indikeret siRNA i 72 timer og celler blev d) farves og e) kvantificeres for nuklear RelB (n = 3, ± SEM, * = p 0,05, ** = p 0,01) . Scale bar = 50 um i alle paneler.

En model for et engagement i Basal RelB Signalering i K-Ras-afhængige Lung Cancer Cells

De data, der præsenteres i dette manuskript føre til formulering af følgende model (fig. 6). Mens aktiviteten af ​​TBK1-bindende fragt receptorer Optineurin, Ndp52 og potentielt Tax1bp1, driver autofagi af bakterieceller under xenophagy, er en lignende TBK1-medieret autophagic binding af Tax1bp1 og Ndp52 drevet af basal autophagy i K-Ras-afhængige NSCLC celler . Dette fører til indgreb af ikke-kanoniske NF-KB-signalering og celleproliferation og /eller overlevelse. Hvorvidt TBK1 også regulerer direkte, lysosomale funktion autofagi i cellulær metabolisme er ukendt; Det er også stadig skal løses, om denne rolle autofagi er eksperimentelt adskilles fra selektiv binding af Tax1bp1 og Ndp52. Mekanistisk, er det heller ikke klart, hvordan TBK1 driver autofagi. da dette manuskript var i de afsluttende faser af revisionen, gruppen af ​​Deretic offentliggjort dog, at phosphorylering af den generelle funktion autophagy receptor og facilitator af autophagosome biogenese, P62 /SQSTM1, i ubiquitin-bindende (UBA) domæne, kan være involveret i en roman rolle for TBK1 i sult-induceret autophagy [26], [27]. Faktisk første resultater fra dette laboratorium tyder på, at A549 celler har basalt phosphoryleret P62, der er faldet i overflod af TBKi behandling (fig. S6).

Se tekst for detaljeret diskussion. Ub = ubiquitin.

Diskussion

Autophagy er en mangesidet proces, vedtage ændringer i celle skæbne ved både ikke-selektive og selektive mekanismer [12]. Det er sandsynligt, at engagement autofagi i kræftceller virker direkte på både stofskiftet [10], [11], [13] og cellesignalering, i en integreret indsats. Det er fristende at spekulere, at xenophagy er koblet til en medfødt immunforsvar signalering respons via ikke-kanoniske NF-KB, og denne mekanisme er simpelthen afvigende engageret af onkogen-drevet autofagi i NSCLC celler. Rolle TBK1 i kørsel autofagi kan også forklare, hvordan autophagy er engageret, trods forudsagt høj basal mTOR aktivitet, i NSCLC celler. Mekanistisk kan P62 phosphorylering spiller en rolle i denne proces [26]. vi spekulere dog, at TBK1 er en promiskuøs kinase med mange substrater, og forudsige, at P62, og faktisk Optineurin (støder op til LIR motiv) phosphorylering [16], udgør blot en delmængde af funktionelt relevante mål af TBK1 i autofagi. Det er således muligt, at forskellige substrater af TBK1 handle på forskellige autofagi, enten ved tidlige trin, som vores data vil foreslå, eller på senere modning trin, som er for nylig blevet foreslået [26].

Generelt NF-KB-signalering har været tænkt at ligge opstrøms for autofagi [28], [29], [30]. Imidlertid er for nylig blevet foreslået, direkte regulering af kanoniske NF-KB-signalering ved autofagi. Hypotese mekanismer har omfattet beslaglæggelse af P62, kBa, NEMO eller Bcl10 [31], [32], [33], [34], [35]. Mangfoldigheden af ​​mekanismer autophagy handling illustrerer de forskellige funktioner i denne proces; her tilføjer vi en anden mekanisme af NF-KB-regulering, denne gang i reguleringen af ​​den ikke-kanoniske RelB vej. For nylig har afvigende RelB aktivitet blevet identificeret i lungetumorer, snit, med vores model [36]. Dog kan p53 vildtype NSCLC også være afhængig, til en vis grad, ved kanoniske NF-KB signalering [37], [38]. Faktisk A549-celler (p53 vildtype) er afhængige af c-Rel aktivitet til proliferation og overlevelse [1]. Dette er ikke gensidigt udelukkende med vores resultater; en målbart mængde nukleart c-Rel kunne være nødvendigt for proliferation /overlevelse, sammen med RelB. Faktisk forbindelse med p53-muteret NSCLC, hvor engagement af kanoniske NF-KB-signalering er meget mere indlysende [39], vil være en god arena at dissekere sådan samspil. Interessant nok har vi vist i dette manuskript at i det mindste nogle cellelinier med p53 mutation og meddelte fremtrædende basal kanoniske NF-KB-signalering (for eksempel NCI-H23), at basal, autofagi-drevet RelB kernelokalisering kan alligevel detekteres. Fremtidig undersøgelse af autofagi laster bragt til autophagosomal membraner af Tax1bp1 og Ndp52, ubiquitineret eller på anden måde, vil også belyse den mekanisme, hvormed disse cargo receptorer er involveret i formidling af ikke-kanoniske NF-KB-signalering. Proteomisk eksperimenter for at bestemme identiteten af ​​disse laster er undervejs i vores laboratorium.

I betragtning af den interesse i at udvikle TBK1 inhibitorer til kræftbehandling, er vi nødt til at forstå i detaljer konsekvenserne af tab af vejen beskrevet her. I

in vivo

indstilling, virkningerne af RelB regulering af autophagy og TBK1 er usandsynligt, at være fuldstændig celle autonome, i betragtning af den veletablerede rolle NF-KB-signalering i at kontrollere celle-celle kommunikation og inflammation. Interessant,

TAX1BP1

kan regulere tarm tumorigenese i musemodeller af kræft [40]. Også kimlinie

TAX1BP1

knockout-mus viser et organ-specifikke inflammatoriske fænotype [41]. Det er muligt, at disse observationer kan vedrøre rolle Tax1bp1 beskrevet her eller alternativt til den bedre beskrevet rolle i at undertrykke kanonisk NF-KB-signalering [24]. Endelig målretning af autofagi foreslås også som et middel til cancerbehandling, i det mindste i nogle genetiske baggrunde. Dataene her tyder forsigtighed ekstrapolere resultaterne af genetiske hæmning af autophagy ved at målrette autophagosome dannelse og binding, til virkningen af ​​lægemidler, der er målrettet lysosomale funktion, såsom chloroquin, proteasehæmmere eller bafilomycin A1. Det er ikke klart, at agenter som disse vil påvirke alle de ændringer, såsom NF-KB-aktivitet, at målrette de tidlige stadier af autophagy vil, og

omvendt

.

Materialer og metoder Salg

cellelinier og Plasmider

Alle celler blev dyrket i DMEM (Sigma) + 10% FCS (Sigma) under 5% CO2 ved 37 ° C. HEK293FT celler fra Invitrogen. A549 celler, der anvendes blev opnået fra Institut for Cancer Research (London, UK) og identitet bekræftet af mikrosatellit genotype (Health Protection Agency, UK). NCI-H23-celler blev købt direkte fra ATCC. A549 og NCI-H23-celler blev derivatiseret at udtrykke ecotrop Receptor hjælp pEcoR-neo og udvælgelse i G418. Retrovirus at gøre stabile infektanter blev genereret på Phoenix-Eco-celler ved standardteknikker. Disse vira var: pBabe GFP-LC3B puro [42]: rotte LC3B cDNA fusioneret N-terminalt til GFP. pBabe GFP-LC3BΔG- En puro: over plasmid, der koder protein afkortet så C-ter Gly eksponeret ved forarbejdning af C-terminalen af ​​Atg4 er konstitutivt udsat. Gly Dette ter C-er muteret til Ala pBabe tfLC3B puro:. PBabe.puro med tandem fluorescerende LC3B [21] klonet i NheI (stump) /Sall i SnaBI /Sall-stedet. pWZL GFP-TBK1 HYGRO: pWZL GFP DEST IRES HYGRO vektor (upubliceret) med fuld længde TBK1 fusioneret til C-terminalen af ​​GFP ved rekombination med pDONR 223 TBK1 (upubliceret) ved Gateway teknologi (Invitrogen). pBabe mCherry LC3C BLAST: pBabe Cherry DEST BLAST vektor (upubliceret) med fuld længde LC3C fusioneret til C-terminalen af ​​mCherry ved rekombination med pDONR 223 LC3C [43] af Gateway-teknologi (Invitrogen). MSCV FLAG-HA-LC3B: Som beskrevet i litteraturen {Behrends 2010 # 4}. MSCV FLAG-HA- TAX1BP1 (WT og LIR-mutanter): TAX1BP1 cDNA blev klonet ind pDONR 223 ved standard Gateway kloningsteknikker vha pcDNA 3.1 myc-TAX1BP1 (nedenfor) som en skabelon. TAX1BP1 cDNA blev derefter Gateway klonet ind MSCV NTAP IRES PURO [43]. Site-directed mutagenese blev udført i pDONR før rekombination i MSCV NTAP IRES PURO at fremstille cDNA, der koder TAX1BP1 med mutationer i den formodede kanoniske eller ikke-kanoniske LIR-motivet (mutationer som beskrevet i teksten). Alle mutageniserede cDNA’er blev fuldt sekventeret

Andre plasmider, der anvendes i denne undersøgelse, var:. PcDNA 3.1 myc-His: Invitrogen, pcDNA 3.1 myc-TAX1BP1: myc-TAX1BP1 fuldlængde-cDNA (NCBI isoform 1) blev PCR-amplificeret med følgende primere fra en IMAGE-klon og klonede BamHI-XhoI i pCDNA 3.1 myc-His: GGA TCC GCC ACC ATG GAG CAG AAG CTG ATT TCC GAG GAG GAC CTG ACA TCC TTT CAA GAA GTC CCA TTG CAG ACT TC og CTC GAG CTA GTC AAA ATT TAG AAC ATT CTG ATC AAA ATG GGT C. den resulterende cDNA koder for 307I variant af dette protein (fælles polymorfi). pDEST15-tom vektor (til ekspression af GST kontrolprotein): skabt ved at indsætte en i-ramme stopkodon indeholdende kassetten i pDEST15 af Gateway kloning fra en specielt konstrueret pDONR223 plasmid. pDEST15-LC3B, pDEST15-LC3C og pDEST15-GABARAP (til ekspression af GST fusionsproteiner) blev skabt ved rekombination med pDONR 223 LC3B, pDONR 223 LC3C eller pDONR 223 GABARAP [43] af Gateway-teknologi (Invitrogen).

Kemikalier

Klorokin blev opnået fra Sigma og opretholdes som en frossen stamopløsning i PBS. 3-MA blev opnået fra Sigma og frisk løsninger fremstillet i DMEM forud på arbejdsplan koncentration før anvendelse til celler. TNFa blev opnået fra Sigma og opbevaret i frosne alikvoter i vandig opløsning. TBKi (MRT68601, fig. S1) blev opnået fra MRC Technology og vedligeholdes som en frossen stamopløsning i DMSO. Bafilomycin A1 blev opnået fra Sigma og opbevares som en frossen stamopløsning i DMSO. Pepstatin A blev opnået fra Sigma og opbevaret som en stamopløsning i ethanol. E64D blev opnået fra Calbiochem og opbevares som en frossen stamopløsning i DMSO

Antistoffer Salg

Antistofferne anvendt i denne undersøgelse, er som følger:. TBK1 (Rabbit AOW9 monoklonale, Millipore), Phospho-Ser172 -TBK1 (BD Pharmingen), ATG5 (for ATG5-12, Kanin polyklonale, Cell Signalling Technology), ULK1 (Kanin polyklonale A705, Cell Signalling Technology), LC3B (immunoblot, Kanin monoklonalt D11, Cell Signalling Technology), LC3B (Immunofluorescens, mus monoklonale 2G6, Nanotools), GABARAP (Kanin polyklonale Ap1821a, Abgent), ERK (Kanin polyklonale 9102, Cell Signalling Technology), RelB (Rabbit monoklonalt C1E4, Cell Signalling Technology), histon H3 (H3, mus monoklonalt 6-6-2 , Millipore), Tax1bp1 (Rabbit poly HPA024432, Sigma HPA), Ndp52 (Rabbit poly ab68588, Abcam), P62 (mus 3 /P62 monoklonalt, BD Pharmingen), myc tag (Rat JAC6 monoklonalt, Abd Serotec [TBK1 coIP eksperimenter] eller mus 4A6 monoklonale, Millipore [GST pulldown eksperimenter]), c-Rel (Rabbit polyklonale, 4727, Cell Signalling Technology), RelA (Rabbit monoklonalt C22B4, Cell Signalling Technology), α-tubulin (Mouse monoklonale DM1A, Sigma), HA ( Rat monoklonalt 3F10, Roche), GST (GST-2 mus monoklonalt, Sigma), Optineurin (Kanin polyklonale Varenr. 100000, Cayman Chemical), K-Ras (Mouse monoklonalt 3B10-2F2, Sigma). Anti-phospho-S403-P62 var en slags gave fra Nobuyuki Nukina (Riken, Japan). Phospho-specifikke antistoffer mod IRF3, RelA og JNK blev opnået fra Cell Signalling Technology.

siRNA transfektion

I 35 mm skåle, 0,8 × 10

5 A549 eller 1,2 × 10

5 NCI-H23 blev udpladet natten over. Celler blev transficeret i 8 timer med Oligofectamine (Invitrogen) og 10 nM siRNA (A549) eller 20 nM siRNA (NCI-H23), ifølge producentens instruktioner.